Co-culture de neurones glutamatergiques et de cellules de gliome pédiatrique de haut grade dans des dispositifs microfluidiques pour évaluer les interactions électriques

Résumé

Des travaux récents révèlent l’impact neuronal sur les cellules de gliome pédiatrique de haut grade (pHGG) et leurs interactions réciproques. Les présents travaux montrent le développement d’un modèle in vitro co-cultivant des cellules pHGG et des neurones glutamatergiques et ont enregistré leurs interactions électrophysiologiques pour imiter ces interactivités.

Résumé

Les gliomes pédiatriques de haut grade (pHGG) représentent des cancers du cerveau chez l’enfant et l’adolescent qui entraînent un pronostic lugubre rapide. Puisqu’il est nécessaire de surmonter la résistance aux traitements actuels et de trouver une nouvelle façon de guérir, modéliser la maladie aussi près que possible dans un cadre in vitro pour tester de nouveaux médicaments et procédures thérapeutiques est très exigeant. L’étude de leurs processus pathobiologiques fondamentaux, y compris l’hyperexcitabilité des neurones glutamatergiques, constituera une véritable avancée dans la compréhension des interactions entre le cerveau environnemental et les cellules pHGG. Par conséquent, pour recréer les interactions neurones/cellules pHGG, ce travail montre le développement d’un modèle in vitro fonctionnel co-cultivant des neurones corticaux glutamatergiques dérivés de la tige pluripotente induite par l’homme (hiPS) dans des cellules pHGG corticales en dispositifs microfluidiques compartimentés et un processus pour enregistrer leurs modifications électrophysiologiques. La première étape consistait à différencier et à caractériser les neurones glutamatergiques humains. Deuxièmement, les cellules ont été cultivées dans des dispositifs microfluidiques avec des lignées cellulaires dérivées de pHGG. Le microenvironnement cérébral et l’activité neuronale ont ensuite été inclus dans ce modèle pour analyser l’impact électrique des cellules pHGG sur ces neurones micro-environnementaux. Les enregistrements électrophysiologiques sont couplés à l’aide de réseaux multiélectrodes (MEA) à ces dispositifs microfluidiques pour imiter les conditions physiologiques et enregistrer l’activité électrique de l’ensemble du réseau neuronal. Une augmentation significative de l’excitabilité des neurones a été soulignée en présence de cellules tumorales.

Introduction

Les gliomes pédiatriques de haut grade (pHGG) présentent une diversité génotypique et phénotypique étendue en fonction de l’âge du patient, de l’emplacement et de l’extension anatomiques de la tumeur et des facteurs ^{moléculaires1}. Ce sont des tumeurs cérébrales agressives qui sont mal contrôlées avec les options de traitement actuellement disponibles et sont la principale cause de décès liés aux cancers du cerveau chez les enfants et les ^adolescents2. Ainsi, plus de 80% des patients rechutent dans les 2 ans suivant leur diagnostic, et leur survie médiane est de 9 à 15 mois, en fonction de l’emplacement du cerveau et des mutations du conducteur. L’absence de traitement curatif est la principale raison d’être de la recherche en laboratoire et souligne le besoin immédiat de nouvelles approches thérapeutiques innovantes. À cette fin, des lignées cellulaires dérivées de patients (PDCL) ont été développées dans l’espoir de fournir la diversité pHGG3 dans des lignées bidimensionnelles (2D) et / ou des neurosphères tridimensionnelles (3D). Néanmoins, ces cultures cellulaires in vitro dérivées de patients n’imitent pas toutes les situations de variables cérébrales. Ces modèles ne tiennent pas compte des environnements neuro-anatomiques macroscopiques et microscopiques généralement décrits dans pHGG.

Habituellement, le pHGG chez les jeunes enfants se développe principalement dans les régions pontine et thalamique, tandis que le HGG de l’adolescent et du jeune adulte se concentre dans les zones corticales, en particulier dans les lobes frontotemporaux1. Ces spécificités de localisation à travers les âges pédiatriques semblent impliquer différents environnements conduisant à la gliomagenèse et à un réseau d’intrication entre les cellules tumorales et ^{l’activité} neuronale ^{spécifique4,5,6}. Bien que les mécanismes ne soient pas encore identifiés, le pHGG se développe principalement à partir de cellules précurseurs neurales le long de la trajectoire de différenciation des lignées astrogliales et oligodendrogliales. Alors que le rôle de ces lignées gliales a longtemps été limité à un simple soutien structurel des neurones, il est maintenant clairement établi qu’elles s’intègrent entièrement dans les circuits neuronaux et présentent des interactions gliales-neuronales bidirectionnelles complexes capables de réorganiser les régions structurelles du cerveau et de remodeler les circuits neuronaux4,7,8 . De plus, de plus en plus de preuves indiquent que le système nerveux central (SNC) joue un rôle essentiel dans l’initiation et la progression du cancer du cerveau. Des travaux récents se sont concentrés sur l’activité neuronale, qui semble stimuler la croissance et la mitose des tumeurs malignes gliales par le biais de facteurs de croissance sécrétés et de communications synaptiques électrochimiques ^directes6,9. Réciproquement, les cellules de gliome de haut grade semblent influencer la fonction neuronale avec une activité neuronale glutamatergique croissante et moduler le fonctionnement des circuits dans lesquels elles sont structurellement et électriquement ^intégrées9. Ainsi, des études utilisant des modèles dérivés de patients et de nouveaux outils de neurosciences contrôlant l’action des neurones ont démontré un effet spécifique au circuit de l’activité neuronale sur la localisation, la croissance et la progression du gliome. La plupart de ces projections neuronales impliquées dans les gliomes sont glutamatergiques et communiquent par le biais des sécrétions de glutamate. Des biomarqueurs glutamatergiques spécifiques tels que mGluR2 ou vGlut1/2 sont couramment ^décrits6.

Fait intéressant, malgré leur hétérogénéité moléculaire, les gliomes pédiatriques et adultes de haut grade montrent une réponse proliférative typique à l’activité neuronale glutamatergique et à d’autres facteurs sécrétés tels que la neuroligine-3 ou le BDNF (facteur neurotrophique dérivé du cerveau)4,6,10,11,12,13 . Dans les régions corticales, les HHG pédiatriques et adultes peuvent induire une hyperexcitabilité neuronale par une augmentation de la sécrétion de glutamate et inhiber les interneurones GABA conduisant à des gliomes associés à l’activité du réseau épileptique14,15. En plus de cela, les circuits neuronaux peuvent être remodelés par des gliomes poussant des tâches neurologiques spécifiques, par exemple le langage, et peuvent réquisitionner une activité neuronale organisée ^{supplémentaire9}.

Sur la base de cette logique, l’avancement de la compréhension des communications bidirectionnelles entre les cellules de gliome et les neurones doit être entièrement élucidé et intégré aux premiers stades des approches pHGG in vitro. Une telle modélisation innovante est cruciale pour comprendre et mesurer l’impact de l’activité électrique neuronale lors des tests de drogue et anticiper la réponse pHGG dans les circuits cérébraux. Les développements récents dans les outils de neurosciences, tels que les dispositifs microfluidiques et les travaux de recherche pHGG, sont le lit pour développer de nouvelles approches de modélisation et être maintenant en mesure d’intégrer le microenvironnement cérébral dans des modèles pHGG in vitro3,16,17,18,19. Couplés à des enregistrements électrophysiologiques utilisant des réseaux multiélectrodes (MEA), les dispositifs microfluidiques20,21,22 offrent la possibilité d’imiter les conditions physiologiques tout en enregistrant l’activité électrique de l’ensemble du réseau neuronal et d’extraire les paramètres de connectivité réseau dans plusieurs conditions. Ce ^{dispositif23,24} permet d’abord le dépôt précis de cellules dans une chambre directement sur MEA. Cette technologie permet le contrôle de la densité et de l’homogénéité de l’ensemencement cellulaire sur MEA et le contrôle fin de l’échange de milieux, ce qui est une étape critique pour la différenciation des progéniteurs neuronaux humains directement dans les dispositifs. De plus, la chambre de dépôt actuelle peut être ensemencée avec plusieurs cellules à différents moments.

Ainsi, cette étude visait à développer un modèle fonctionnel in vitro co-cultivant des neurones glutamatergiques corticaux dérivés de la tige pluripotente humaine (hiPS) et des cellules dérivées de pHGG dans des dispositifs microfluidiques et enregistrant leur activité électrique pour évaluer les interactions électriques entre les deux populations cellulaires. Tout d’abord, des neurones glutamatergiques corticaux dérivés de hiPS ont été obtenus et caractérisés dans des dispositifs microfluidiques à différents stades de culture [jour 4 (D4), en tant que cellules hiPS, et jour 21 (D21) et jour 23 (D23), en tant que neurones matures glutamatergiques]. Pour la deuxième étape de la co-culture, deux modèles pHGG ont été utilisés : la lignée pédiatrique UW479 commercialisée et les cellules pHGG initiées à partir d’une tumeur patiente (BT35)³, porteuses d’une mutation pilote H3.3 K27M. Enfin, nous avons effectué des enregistrements électrophysiologiques de cellules glutamatergiques à D21 avant l’ensemencement des cellules pHGG et D23 après 48 h de co-culture dans le même dispositif microfluidique. Les interactions entre les neurones glutamatergiques et les cellules pHGG ont été caractérisées par une augmentation significative de l’activité électrophysiologique enregistrée.

Protocole

Pour ce protocole, le numéro d’accréditation relatif à l’utilisation de matériel humain est DC-2020-4203.

1. Fabrication, préparation et traitement de dispositifs microfluidiques

1. Fabriquer des moules SU-8 en utilisant des techniques de photolithographie ^{conventionnelles18}.
   REMARQUE: À cette fin, deux masques de photolithographie ont été conçus pour construire deux couches de structures de résine photosensible sur un substrat de plaquette de silicium et une fine couche de résine photosensible SU-8 2005 (3,2 μm de haut et 6 ± 1 μm de large) qui définit des microgrooves asymétriques sous le motif de canaux principaux fabriqués en SU-8 2100 (200 μm de haut, 1 mm de large, et 13 mm de long) (voir la figure supplémentaire S1).
2. Activez la plaquette à l’aide d’un nettoyeur plasma (5,00e-1 torr, niveau de radiofréquence (RF) élevé) pendant 1 min et ^silanez-la à l’aide de 1 mL de (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane dans un dossier en aluminium dans un dessiccateur pendant 30 min.
3. Préparer un rapport de 10:1 de polydiméthylsiloxane (PDMS), mélanger le prépolymère avec un catalyseur, le passer dans un dessiccateur sous vide pour éliminer les bulles piégées et le couler lentement sur le moule avant d’être durci dans un four à 80 °C pendant 40 min.
4. Coupez-le ensuite à l’aide d’un rasoir à la taille souhaitée avant de décoller le moule. Perforez les zones d’entrée et de sortie pour obtenir des trous de 3 mm de large, nettoyez le PDMS et protégez-le à l’aide de ruban adhésif.
   REMARQUE: L’épaisseur du dispositif PDMS final est d’environ 5 mm.
5. Traitez l’appareil à l’aide d’un nettoyeur plasma (5,00e-1 torr, niveau RF élevé pendant 1 min), ^assemblez-le avec une boîte de Petri en polystyrène et exposez le vide sous la lumière UV pendant 30 minutes.
6. Remplir avec une pipette l’entrée du dispositif microfluidique avant utilisation avec 70% d’éthanol et vider par aspiration par pipetage.
7. Lavez le dispositif microfluidique en ajoutant des réservoirs d’entrée de la solution saline tamponnée au phosphate (D-PBS) de Dulbecco et videz-le en pipetant l’aspiration trois fois de suite.
8. Enduire l’appareil à l’aide de 0,05 mg/mL de poly-D-lysine et le placer dans un incubateur (37 °C, 5 % de _CO2). Après 24 h, rincer l’appareil en ajoutant dans le réservoir d’entrée le milieu neurobasal et le vider en pipetant l’aspiration trois fois de suite.
9. Remplir la puce microfluidique avec le milieu de culture cellulaire et laisser-la rester à température ambiante jusqu’à utilisation pendant un maximum de 2 h.

2. Préparation et ensemencement des cellules dans le dispositif microfluidique

1. Culture, ensemencement et caractérisation immunofluorescente de neurones glutamatergiques corticaux dérivés de hiPS humains
   REMARQUE: Effectuer des expériences avec des neurones glutamatergiques corticaux dérivés de hiPS commercialisés (Graphique 1A). Préserver les matières d’origine humaine et les manipuler avec l’approbation et conformément aux directives de la législation.
   1. Videz les réservoirs d’entrée et de sortie du dispositif microfluidique par aspiration à pipette avant l’ensemencement, en laissant uniquement les canaux de l’appareil être remplis de milieu.
   2. Ensemencez les cellules hiPS au jour 0 (J0) en mettant 10 μL d’une suspension de 6,5 x ¹⁰⁶ cellules hiPS/mL (par exemple, concentration de 900 cellules/^mm2 ) avec le milieu, dont la composition est donnée dans le tableau 1, et laissez le dispositif être sous le capot (à température ambiante) pendant 15 min pour permettre aux cellules de se fixer.
   3. Après 15 min, remplir les réservoirs d’entrée et de sortie avec 50 μL de milieu de culture D4, dont la composition totale est donnée dans le tableau 1, et transférer le dispositif dans l’incubateur (37 °C, 5 % de _CO2).
   4. Maintenir la différenciation des neurones glutamatergiques pendant 23 jours (figure 1A(1),microscopie) dans un environnement contrôlé (37 °C, 5 % de _CO2) et avec un milieu de culture cellulaire spécifique, dont la composition est décrite dans le tableau 1. Remplacez le support régulièrement comme indiqué à l’étape suivante 5. juste en dessous et suivez les étapes comme dans la figure 1B.
   5. Remplacer le milieu tous les 3 à 4 jours suivant la composition du tableau 1 . Utilisez le milieu d’ensemencement jusqu’au milieu D4, le milieu D4 jusqu’au milieu D7, le milieu D7 jusqu’au milieu D11 et le milieu D11 pendant le temps restant de la culture.
   6. Prenez des photos microscopiques à D4, D21 et D23 à l’aide d’un microscope à contraste de phase standard pour évaluer la viabilité des cellules et permettre le comptage cellulaire.
   7. Pour la caractérisation, fixer les neurones glutamatergiques différenciés dans 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 30 min à température ambiante après aspiration moyenne et suivre le protocole de coloration par immunofluorescence.
   8. Lavez les cellules trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et perméabilisez-les pendant 10 minutes avec 0,1% de Triton-X, suivie de 30 minutes avec 3% d’albumine sérique bovine (BSA). Ajouter les anticorps primaires et incuber le dispositif pendant la nuit à 4 °C.
   9. Rincez les cellules trois fois avec du PBS et coubez davantage avec les anticorps secondaires correspondants pendant 2 h à température ambiante.
      REMARQUE : Les anticorps immunofluorescents utilisés dans l’étude sont énumérés dans le tableau 2.
   10. Rincez les cellules trois fois avec du PBS et contre-tache avec du DAPI (4',6-diamino-2-phénylindole) pendant 10 min à température ambiante.
   11. Acquérir des images avec un microscope à épifluorescence inversée équipé d’une caméra CMOS (Complementary metal-oxide-semiconductor) et les analyser à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images approprié.
   12. Ouvrez les images colorées DAPI et binarisées avec la routine de seuil dans le logiciel. Pour ce faire, cliquez sur Image > Ajuster > seuil et définissez les paramètres appropriés pour distinguer le noyau de l’arrière-plan. Ensuite, cliquez sur Appliquer > processus > bassin versant pour diviser le noyau agrégé.
   13. Après cela, utilisez la fonction du logiciel inné Analyze Particles pour interpréter les images binaires. Pour ce faire, cliquez sur Analyser puis sur Analyser les particules et définissez les paramètres appropriés après cela: filtre de taille et de circularité (exclure de l’analyse les objets inférieurs à 7 μm, supérieurs à 20 μm ou ayant une circularité inférieure à 0,1 μm).
   14. Fusionnez les images de contour obtenues à partir de l’analyse DAPI avec des images immunofluorescentes correspondantes pour valider la coloration correcte.
   15. Enfin, enregistrez les données associées (nombre d’objets, surface moyenne, % de couverture, etc.) pour les différents biomarqueurs et quantifiez l’expression à D4 et/ou D21 à l’aide d’un logiciel de quantification approprié.
2. Culture cellulaire de la lignée pHGG commercialisée, UW479, et de la lignée cellulaire dérivée du patient, ^BT353
   1. Culture des deux lignées cellulaires dans du DMEM/F-12 GlutaMAX complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) dans une fiole de culture cellulaire. Attendez la confluence à 80 % de chaque lignée cellulaire, comme illustré à la figure 1C.
   2. Maintenir ces cellules pHGG dans un environnement contrôlé à 37 °C dans des conditions normoxiques tout au long des expériences.

3. Protocole de co-culture

1. Ajuster le jour d’ensemencement et la concentration pour les lignées cellulaires UW479 et BT35 pour atteindre 80% des cellules confluentes lorsque la co-culture devrait commencer, ce qui correspond à 21 jours de culture pour les neurones glutamatergiques.
2. Trypsiniser les cellules UW479 et BT35 et les ensemencer sur le dessus des neurones glutamatergiques dans chaque dispositif microfluidique dédié (avec une densité cible de 900 cellules / ^mm2 pour chaque type de cellule) avant d’ensemencer les cellules pHGG dans le dispositif microfluidique contenant des neurones glutamatergiques matures.
3. Maintenir les co-cultures pendant 2 jours dans un environnement contrôlé (37 °C, 5% _CO2) avec le neurone glutamatergique D11 et le milieu ultérieur détaillé dans le tableau 1.
4. Compter les cellules pHGG à l’aide des images microscopiques analysées avec un logiciel d’analyse d’images pour évaluer leur viabilité. Calculez le pourcentage de cellules.
   REMARQUE: Utilisez la formule suivante: 100 - ((nombre de cellules à D23 / nombre de cellules à D21) x 100).

4. Enregistrement électrophysiologique

1. Effectuer l’enregistrement électrophysiologique avec un système commercial et un logiciel disponible dans le commerce.
   NOTE: Les expériences ont été réalisées avec un MEA composé d’électrodes de 30 μm de diamètre espacées de 100 μm.
2. Effectuer un premier enregistrement électrophysiologique sur les neurones glutamatergiques à D21 avant l’ensemencement des cellules pHGG. Utilisez les neurones glutamatergiques différenciés comme contrôle et cultivez-les seuls parallèlement à la co-culture. Effectuez un deuxième enregistrement pour les deux conditions, comme décrit à l’étape suivante numérotée 3.
3. Effectuer un deuxième enregistrement électrophysiologique à D23 (après 2 jours de co-culture).

5. Traitement des données électrophysiologiques

1. Filtrez les données brutes avec un filtre Butterworth passe-bande de ^2e ordre (avec des fréquences de bande passante de 100 Hz et 2500 Hz).
2. Pour la détection des pics, calculez le carré moyen racine du signal sur les 10 minutes d’enregistrement pour chaque électrode et définissez un seuil d’amplitude correspondant à huit fois la valeur carrée de cette moyenne racine.
3. Appliquez un algorithme PTSD (Precision Timing Spike ^Detection25), en considérant une durée maximale de 2 ms pour un potentiel d’action.
4. Considérez comme une électrode active, chaque électrode détectant au moins 5 pointes/min. Poursuivez le test si au moins 10% des électrodes d’enregistrement sont actives.
5. Divisez le nombre de pics détectés par la période d’enregistrement pour calculer la vitesse de tir moyenne de chaque électrode active. Calculez une cadence de tir moyenne pour chaque expérience indépendante. En fin de compte, calculez une moyenne par condition (±SEM) et exprimez-la en fonction le jour de l’enregistrement.
6. Calculez un diagramme raster pour chaque expérience représentant les événements détectés pour chaque électrode active en fonction du temps. Ensuite, calculez les vitesses de tir temporelles à l’échelle du réseau (ou vitesses de tir instantanées) de toutes les électrodes actives, ce qui permet de surveiller la synchronicité de l’activité du réseau neuronal.
7. Enfin, générez des graphiques à barres à l’aide du logiciel de quantification et effectuez des comparaisons à l’aide des tests Kruskal Wallis.

Résultats

Avant d’étudier les interactions électriques entre les neurones glutamatergiques et les cellules de gliome, les neurones glutamatergiques corticaux dérivés de hiPS ont été caractérisés pour valider la faisabilité de leur culture dans des dispositifs microfluidiques (Figure 1A). Leur caractérisation a été évaluée à l’aide de Nestin, Sox2, mGlurR2 (récepteurs métabotropes du glutamate 2) et de l’immunocoloration vGLUT1, représentés à

Discussion

Ce travail décrit un modèle fonctionnel in vitro précis pour évaluer l’interaction entre les neurones glutamatergiques corticaux dérivés de hiPS humains et les cellules tumorales cérébrales dans des dispositifs microfluidiques. L’une des étapes cruciales du présent protocole était la différenciation hiPS dans les neurones glutamatergiques, qui a été confirmée par la diminution de la coloration immunofluorescente Nestin et Sox2 et l’apparition simultanée de la coloration mGluR2 et vGLUT1. N?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
256MEA100/30iR-ITO-w/o	MCS	256MEA100/30iR-ITO-w/o
40 µm probe for Scepter counter	Dutscher	53750
60 µm probe for Scepter counter	Dutscher	51999
Accutase	Sigma	A6964
Ala -Gln (GlutaMAX)	Sigma	G8541
Axel Observer 7 Microscope	Zeiss	431007-9904-000
Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon®	Dutscher	353109
Class II Biological Safety Cabinet	Thermo Scientific	HERASafe type KS12
Colibri 7 LED	Zeiss	4230529710-000
Cortical Glutamatergic Neurons	BrainXell	BX-0300
DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX	Gibco	31331-028
DMEM/F12 Medium	Sigma	D8437
DPBS 1X	Dutscher	L0615-500
EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3	Nunc	156499
Foetal Bovine Serum (FBS)	Dutscher	500105
GDNF	Peprotech	450-10
Geltrex	Life Technologies	A1413201
Human BDNF	Peprotech	450-02
Incubator	Memmert	IC0150med
MCS InterFace Boarder	MCS	181205-MEA2100-11240
MEA2100	MCS	181205-MEA2100-11240
Micropipette P10	Sartorius	LH-729020
Micropipette P100	Sartorius	LH-729050
Micropipette P1000	Sartorius	LH-729070
Micropipette P200	Sartorius	LH-729060
Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock	Dutscher	33290
MultiChannel Experimenter	MCS	-
N2 Supplement-A	StemCell	7152
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
Neurocult SM1 neuronal supplement	StemCell	5711
Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	030570ACL
Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	032260CL
Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	134760CL
Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine	Dutscher	X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity	Drummond	4000202/4038202
Pipette for cell culture 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
Pipette for cell culture 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
Plaque chauffante (CultureTemp)	Belart	370151000
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Primovert microscope	Zeiss	415510-1100-000
Scepter (Handheld Automated Cell Counter)	Millipore	PHCC00000
TGF-β1	Peprotech	100-21C
Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352096
Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352070