Cocultivo de neuronas glutamatérgicas y células pediátricas de glioma de alto grado en dispositivos microfluídicos para evaluar las interacciones eléctricas

Resumen

Trabajos recientes descubren el impacto neuronal en las células de glioma pediátrico de alto grado (pHGG) y sus interacciones recíprocas. El presente trabajo muestra el desarrollo de un modelo in vitro que co-cultiva células pHGG y neuronas glutamatérgicas y registra sus interacciones electrofisiológicas para imitar esas interactividades.

Resumen

Los gliomas pediátricos de alto grado (pHGG) representan cánceres cerebrales infantiles y adolescentes que tienen un pronóstico sombrío rápido. Dado que existe la necesidad de superar la resistencia a los tratamientos actuales y encontrar una nueva forma de curación, modelar la enfermedad lo más cerca posible en un entorno in vitro para probar nuevos medicamentos y procedimientos terapéuticos es muy exigente. El estudio de sus procesos patobiológicos fundamentales, incluida la hiperexcitabilidad de las neuronas glutamatérgicas, será un verdadero avance en la comprensión de las interacciones entre el cerebro ambiental y las células pHGG. Por lo tanto, para recrear las interacciones entre las neuronas y las células pHGG, este trabajo muestra el desarrollo de un modelo funcional in vitro de cocultivo que coculta las neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de Stem (hiPS) inducidas por humanos en células pHGG microfluídicas compartimentadas y un proceso para registrar sus modificaciones electrofisiológicas. El primer paso fue diferenciar y caracterizar las neuronas glutamatérgicas humanas. En segundo lugar, las células se cultivaron en dispositivos microfluídicos con líneas celulares derivadas de pHGG. El microambiente cerebral y la actividad neuronal se incluyeron en este modelo para analizar el impacto eléctrico de las células pHGG en estas neuronas microambientales. Los registros electrofisiológicos se acoplan utilizando matrices multielectrodos (MEA) a estos dispositivos microfluídicos para imitar las condiciones fisiológicas y registrar la actividad eléctrica de toda la red neuronal. Se subrayó un aumento significativo en la excitabilidad neuronal en presencia de células tumorales.

Introducción

Los gliomas pediátricos de alto grado (pHGG) presentan una diversidad genotípica y fenotípica extendida dependiendo de la edad del paciente, la ubicación y extensión anatómica tumoral y los impulsores ^moleculares1. Son tumores cerebrales agresivos que están mal controlados con las opciones de tratamiento actualmente disponibles y son la principal causa de muerte relacionada con cánceres cerebrales en niños y ^{adolescentes2}. Por lo tanto, más del 80% de los pacientes recaen dentro de los 2 años posteriores a su diagnóstico, y su supervivencia media es de 9 a 15 meses, dependiendo de las ubicaciones del cerebro y las mutaciones impulsoras. La ausencia de tratamiento curativo es el principal impulso para la investigación de laboratorio y destaca la necesidad inmediata de nuevos enfoques terapéuticos innovadores. Para este propósito, se desarrollaron líneas celulares derivadas de pacientes (PDCL) con la esperanza de proporcionar la diversidad de pHGG3 en líneas bidimensionales (2D) y / o neuroesferas tridimensionales (3D). Sin embargo, esos cultivos celulares in vitro derivados del paciente no imitan todas las situaciones de variables cerebrales. Estos modelos no consideran los ambientes neuroanatómicos macroscópicos y microscópicos típicamente descritos en pHGG.

Por lo general, la pHGG en niños más pequeños se desarrolla principalmente en las regiones pontina y talámica, mientras que la HGG de adolescentes y adultos jóvenes se concentra en las áreas corticales, especialmente en los lóbulos frontotemporales1. Estas especificidades de localización a lo largo de las edades pediátricas parecen involucrar diferentes ambientes que conducen a la gliomagénesis y a una red de intricción entre las células tumorales y la actividad neuronal ^{específica4,5,6}. Aunque los mecanismos aún no se han identificado, el pHGG se desarrolla principalmente a partir de células precursoras neurales a lo largo de la trayectoria de diferenciación de los linajes astrogliales y oligodendrogliales. Si bien el papel de estos linajes gliales se ha restringido durante mucho tiempo al soporte estructural simple de las neuronas, ahora está claramente establecido que se integran completamente en los circuitos neuronales y exhiben complejas interacciones glial-neuronales bidireccionales capaces de reorganizar las regiones estructurales del cerebro y remodelar los circuitos neuronales4,7,8 . Además, el aumento de fragmentos de evidencia indica que el sistema nervioso central (SNC) desempeña un papel crítico en el inicio y la progresión del cáncer cerebral. Trabajos recientes se centraron en la actividad neuronal, que parece impulsar el crecimiento y la mitosis de las neoplasias gliales malignas a través de factores de crecimiento secretados y comunicaciones sinápticas electroquímicas ^directas6,9. Recíprocamente, las células de glioma de alto grado parecen influir en la función neuronal con una creciente actividad neuronal glutamatérgica y modular el funcionamiento de los circuitos en los que están integradas estructural y ^{eléctricamente9}. Por lo tanto, los estudios que utilizaron modelos derivados del paciente y nuevas herramientas de neurociencia que controlan la acción neuronal demostraron un efecto específico del circuito de la actividad neuronal en la ubicación, el crecimiento y la progresión del glioma. La mayoría de estas proyecciones neuronales involucradas en los gliomas son glutamatérgicas y se comunican a través de secreciones de glutamato. Comúnmente se describen biomarcadores glutamatérgicos específicos como mGluR2 o vGlut1/²⁶.

Curiosamente, a pesar de su heterogeneidad molecular, los gliomas pediátricos y adultos de alto grado muestran una respuesta proliferativa típica a la actividad neuronal glutamatérgica y otros factores secretados como la neuroligina-3 o el BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro)4,6,10,11,12,13 . En las regiones corticales, los HGG pediátricos y adultos pueden inducir hiperexcitabilidad neuronal a través de un aumento de la secreción de glutamato e inhibir las interneuronas gaba que conducen a gliomas asociados con la actividad de la red epiléptica14,15. Además de eso, los circuitos neuronales pueden ser remodelados por gliomas que empujan tareas neurológicas específicas, por ejemplo, el lenguaje, y pueden requerir actividad neuronal organizada ^adicional9.

Sobre la base de esta lógica, el avance de la comprensión de las comunicaciones bidireccionales entre las células de glioma y las neuronas debe dilucidarse completamente e integrarse con las primeras etapas de los enfoques in vitro de pHGG. Este modelado innovador es crucial para comprender y medir el impacto de la actividad eléctrica neuronal durante las pruebas de drogas y anticipar la respuesta de pHGG en los circuitos cerebrales. Los desarrollos recientes en herramientas de neurociencia, como los dispositivos microfluídicos y los trabajos de investigación de pHGG, son la base para desarrollar nuevos enfoques de modelado y poder integrar ahora el microambiente cerebral en modelos de pHGG in vitro3,16,17,18,19. Junto con los registros electrofisiológicos utilizando matrices multielectrodos (MEA), los dispositivos microfluídicos20,21,22 ofrecen la posibilidad de imitar las condiciones fisiológicas mientras registran la actividad eléctrica de toda la red neuronal y extraen los parámetros de conectividad de la red bajo varias condiciones. Este ^{dispositivo23,24} permite en primer lugar la deposición precisa de células en una cámara directamente sobre MEA. Esta tecnología permite el control de la densidad de siembra celular y la homogeneidad en MEA y el control fino del intercambio de medios, que es un paso crítico para la diferenciación de progenitores neurales humanos directamente en dispositivos. Además, la cámara de deposición actual se puede sembrar con múltiples células en diferentes puntos de tiempo.

Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un modelo funcional in vitro que coculte las neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de Stem (hiPS) humanas y las células derivadas de pHGG en dispositivos microfluídicos y registre su actividad eléctrica para evaluar las interacciones eléctricas entre ambas poblaciones celulares. En primer lugar, se obtuvieron neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de hiPS y se caracterizaron en dispositivos microfluídicos en diferentes etapas de cultivo [día 4 (D4), como células hiPS, y día 21 (D21) y día 23 (D23), como neuronas maduras glutamatérgicas]. Para el segundo paso del cocultivo se utilizaron dos modelos de pHGG: la línea UW479 pediátrica comercializada y las células pHGG iniciadas a partir de un tumor de paciente (BT35)³, con una mutación impulsora H3.3 K27M. Finalmente, realizamos registros electrofisiológicos de células glutamatérgicas en D21 antes de la siembra de células pHGG y D23 después de 48 h de cocultivo en el mismo dispositivo microfluídico. Las interacciones entre las neuronas glutamatérgicas y las células pHGG se caracterizaron por un aumento significativo en la actividad electrofisiológica registrada.

Protocolo

Para este protocolo, el número de acreditación relacionado con el uso de materiales humanos es DC-2020-4203.

1. Fabricación, preparación y tratamiento de dispositivos microfluídicos

1. Fabrica moldes SU-8 utilizando técnicas de fotolitografía ^{convencionales18}.
   NOTA: Para este propósito, se han diseñado dos máscaras de fotolitografía para construir dos capas de estructuras fotorresistentes sobre sustrato de oblea de silicio y una capa fotorresistente delgada SU-8 2005 (3,2 μm de alto y 6 ± 1 μm de ancho) que define microgrooves asimétricos bajo el patrón de canales principales realizado en SU-8 2100 (200 μm de alto, 1 mm de ancho, y 13 mm de largo) (ver Figura Suplementaria S1).
2. Active la oblea usando un limpiador de plasma (5.00e-1 torr, alto nivel de radiofrecuencia (RF)) durante 1 minuto y silanícela usando 1 ml de (tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano en una carpeta de aluminio en un desecador durante 30 min.
3. Prepare una proporción de 10:1 de polidimetilsiloxano (PDMS), mezcle el prepolímero con catalizador, páselo en un desecador al vacío para eliminar las burbujas atrapadas y értelo lentamente sobre el molde antes de curarlo en un horno a 80 °C durante 40 minutos.
4. Córtelo después de eso usando una maquinilla de afeitar al tamaño deseado antes de despegar el molde. Perfora las zonas de entrada y salida para obtener orificios de 3 mm de ancho, limpia el PDMS y protégelo con cinta adhesiva.
   NOTA: El grosor del dispositivo PDMS final es de aproximadamente 5 mm.
5. Trate el dispositivo con un limpiador de plasma (5.00e-1 torr, alto nivel de RF durante 1 min), enséblelo con una placa de Petri de poliestireno y exponga el vacío bajo luz UV durante 30 min.
6. Llene con una pipeta la entrada del dispositivo microfluídico antes de usarlo con etanol al 70% y vacíelo mediante aspiración pipeteante.
7. Lave el dispositivo microfluídico agregando depósitos de entrada de solución salina tamponada con fosfato (D-PBS) de Dulbecco y vacíelo mediante aspiración de pipeteo tres veces consecutivas.
8. Cubra el dispositivo con 0,05 mg/ml de poli-D-lisina y colóquelo en una incubadora (37 °C, 5% de _CO2). Después de 24 h, enjuague el dispositivo agregando en el depósito de entrada el medio neurobasal y vacíelo mediante aspiración pipeteante tres veces consecutivas.
9. Llene el chip microfluídico con el medio de cultivo celular y déjelo permanecer a temperatura ambiente hasta su uso durante un máximo de 2 h.

2. Preparación celular y siembra en el dispositivo microfluídico

1. Cultivo, siembra y caracterización inmunofluorescente de neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de hiPS humanos
   NOTA: Realizar experimentos con neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de hiPS comercializadas (Figura 1A). Preservar los materiales derivados del ser humano y manipularlos con la aprobación y bajo las directrices de la legislación.
   1. Vacíe los depósitos de entrada y salida del dispositivo microfluídico mediante aspiración de pipeta antes de la siembra, dejando que solo los canales del dispositivo se llenen con medio.
   2. Sembrar las células hiPS en el Día 0 (D0) colocando 10 μL de una suspensión de células hiPS/ml de 6,5 x ¹⁰⁶ hiPS (por ejemplo, concentración de 900 celdas/^mm2 ) con el medio, cuya composición se indica en la Tabla 1, y dejar que el dispositivo esté bajo el capó (a temperatura ambiente) durante 15 minutos para permitir que las células se adhieran.
   3. Después de 15 min, llene los depósitos de entrada y salida con 50 μL de medio de cultivo D4, cuya composición completa se indica en la Tabla 1, y transfiera el dispositivo a la incubadora (37 ° C, 5% _co2).
   4. Mantener la diferenciación neuronal glutamatérgica durante 23 días (Figura 1A(1), microscopía) en un ambiente controlado (37 °C, 5% _CO2) y con un medio de cultivo celular específico, cuya composición se describe en la Tabla 1. Reemplace el medio regularmente como se detalla en el siguiente paso 5. justo debajo y siga los pasos como en la Figura 1B.
   5. Reemplace el medio cada 3 a 4 días después de la composición de la Tabla 1 . Use el medio de siembra hasta D4, el medio D4 hasta D7, el medio D7 hasta D11 y el medio D11 durante el tiempo restante del cultivo.
   6. Tome imágenes microscópicas en D4, D21 y D23 utilizando un microscopio de contraste de fase estándar para evaluar la viabilidad celular y permitir el conteo celular.
   7. Para la caracterización, fijar las neuronas glutamatérgicas diferenciadas en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 30 min a temperatura ambiente después de la aspiración media y seguir el protocolo de tinción por inmunofluorescencia.
   8. Lave las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y permeabilícelas durante 10 min con Tritón-X al 0,1% seguido de 30 min con albúmina sérica bovina (BSA) al 3%. Agregue anticuerpos primarios e incube el dispositivo durante la noche a 4 °C.
   9. Enjuague las células tres veces con PBS e incube aún más con los anticuerpos secundarios correspondientes durante 2 h a temperatura ambiente.
      NOTA: Los anticuerpos inmunofluorescentes utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla 2.
   10. Enjuague las células tres veces con PBS y contramante con DAPI (4',6-diamino-2-fenilindol) durante 10 min a temperatura ambiente.
   11. Adquiera imágenes con un microscopio de epifluorescencia invertido equipado con una cámara CMOS (complementary metal-oxide-semiconductor) y analice utilizando el software de análisis de imágenes apropiado.
   12. Abra las imágenes manchadas de DAPI y binarize con la rutina de umbral en el software. Para hacer esto, haga clic en Imagen > Ajustar > umbral y establezca los parámetros apropiados para distinguir el núcleo del fondo. Luego, haga clic en Aplicar > proceso > cuenca para dividir el núcleo agregado.
   13. Después de eso, use la función del software innato Analyze Particles para interpretar las imágenes binarias . Para hacer esto, haga clic en Analizar y luego en Analizar partículas y establezca los parámetros apropiados después de esto: filtro de tamaño y circularidad (excluir del análisis objetos menores de 7 μm, mayores de 20 μm o con una circularidad menor de 0.1 μm).
   14. Fusionar las imágenes de contorno obtenidas del análisis DAPI con las imágenes inmunofluorescentes correspondientes para validar la tinción correcta.
   15. Finalmente, guarde los datos asociados (número de objetos, área media, % de cobertura, etc.) para los diferentes biomarcadores y cuantifique la expresión en D4 y/o D21 utilizando el software de cuantificación adecuado.
2. Cultivo celular de la línea pHGG comercializada, UW479, y la línea celular derivada del paciente, ^BT353
   1. Cultivo de ambas líneas celulares en DMEM/F-12 GlutaMAX suplementado con Suero Fetal Bovino (FBS) al 10% en un matraz de cultivo celular. Espere el 80% de confluencia de cada línea celular como se presenta en la Figura 1C.
   2. Mantenga estas células de pHGG en un ambiente controlado a 37 °C en condiciones normóxicas durante los experimentos.

3. Protocolo de cocultivo

1. Ajustar el día de siembra y la concentración para las líneas celulares UW479 y BT35 para alcanzar el 80% de las células confluentes cuando debe comenzar el cocultivo, lo que corresponde a 21 días de cultivo para las neuronas glutamatérgicas.
2. Tripsinizar las células UW479 y BT35 y sembrarlas en la parte superior de las neuronas glutamatérgicas en cada dispositivo microfluídico dedicado (con una densidad objetivo de 900 células / ^mm2 para cada tipo de célula) antes de sembrar las células pHGG en el dispositivo microfluídico que contiene neuronas glutamatérgicas maduras.
3. Mantener los cocultivos durante 2 días en un ambiente controlado (37 °C, 5% _CO2) con neurona glutamatérgica D11 y medio posterior detallado en la Tabla 1.
4. Contar las células pHGG utilizando las imágenes microscópicas analizadas con un software de análisis de imágenes para evaluar su viabilidad. Calcula el porcentaje de celdas.
   NOTA: Utilice la siguiente fórmula: 100 - ((número de celdas en D23 / número de celdas en D21) x 100).

4. Registro electrofisiológico

1. Realizar el registro electrofisiológico con un sistema comercial y software disponible comercialmente.
   NOTA: Los experimentos se llevaron a cabo con un MEA que consistió en electrodos de 30 μm de diámetro espaciados por 100 μm.
2. Realizar un primer registro electrofisiológico en neuronas glutamatérgicas en D21 antes de la siembra de células pHGG. Utilizar las neuronas glutamatérgicas diferenciadas como control y cultivarlas solas en paralelo al cocultivo. Realice una segunda grabación para ambas condiciones como se describe en el siguiente paso numerado 3.
3. Realizar un segundo registro electrofisiológico en D23 (después de 2 días de cocultivo).

5. Tratamiento electrofisiológico de datos

1. Filtre los datos sin procesar con un filtro Butterworth de paso de banda de ^{segundo orden (} con frecuencias de banda de paso de 100 Hz y 2500 Hz).
2. Para la detección de picos, calcule el cuadrado medio de la raíz de la señal durante los 10 minutos de grabación para cada electrodo y establezca un umbral de amplitud correspondiente a ocho veces el valor cuadrado de esta media raíz.
3. Aplicar un algoritmo de TEPT (Precision Timing Spike ^Detection25), considerando una duración máxima de 2 ms para un potencial de acción.
4. Considere como un electrodo activo, cada electrodo detecta al menos 5 picos / min. Continúe el ensayo si al menos el 10% de los electrodos de grabación están activos.
5. Divida el número de picos detectados por el período de tiempo de registro para calcular la velocidad media de disparo de cada electrodo activo. Calcule una velocidad media de disparo promedio para cada experimento independiente. En última instancia, calcule un promedio por condición (±SEM) y expréselo como una función el día de la grabación.
6. Calcule un gráfico ráster para cada experimento que represente los eventos detectados para cada electrodo activo en función del tiempo. Luego, calcule las tasas de disparo temporales en toda la matriz (o tasas de disparo instantáneo) de todos los electrodos activos, lo que permite monitorear la sincronicidad de la actividad de la red neuronal.
7. Finalmente, genere gráficos de barras utilizando el software de cuantificación y realice comparaciones utilizando las pruebas de Kruskal Wallis.

Resultados

Antes de estudiar las interacciones eléctricas entre las neuronas glutamatérgicas y las células de glioma, se caracterizaron las neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de hiPS para validar la viabilidad de cultivarlas en dispositivos microfluídicos (Figura 1A). Su caracterización fue evaluada utilizando Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotrópicos Glutamato Receptores 2) e inmunotinción vGLUT1, representada en la Figura 1A

Discusión

Este trabajo describe un modelo funcional in vitro preciso para evaluar la interacción entre las neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de hiPS humanas y las células tumorales cerebrales en dispositivos microfluídicos. Uno de los pasos cruciales en el presente protocolo fue la diferenciación hiPS en neuronas glutamatérgicas, que se confirmó por la disminución de la tinción inmunofluorescente de Nestin y Sox2 y la aparición simultánea de tinción mGluR2 y vGLUT1. Sin embargo, pocos progenitores ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
256MEA100/30iR-ITO-w/o	MCS	256MEA100/30iR-ITO-w/o
40 µm probe for Scepter counter	Dutscher	53750
60 µm probe for Scepter counter	Dutscher	51999
Accutase	Sigma	A6964
Ala -Gln (GlutaMAX)	Sigma	G8541
Axel Observer 7 Microscope	Zeiss	431007-9904-000
Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon®	Dutscher	353109
Class II Biological Safety Cabinet	Thermo Scientific	HERASafe type KS12
Colibri 7 LED	Zeiss	4230529710-000
Cortical Glutamatergic Neurons	BrainXell	BX-0300
DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX	Gibco	31331-028
DMEM/F12 Medium	Sigma	D8437
DPBS 1X	Dutscher	L0615-500
EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3	Nunc	156499
Foetal Bovine Serum (FBS)	Dutscher	500105
GDNF	Peprotech	450-10
Geltrex	Life Technologies	A1413201
Human BDNF	Peprotech	450-02
Incubator	Memmert	IC0150med
MCS InterFace Boarder	MCS	181205-MEA2100-11240
MEA2100	MCS	181205-MEA2100-11240
Micropipette P10	Sartorius	LH-729020
Micropipette P100	Sartorius	LH-729050
Micropipette P1000	Sartorius	LH-729070
Micropipette P200	Sartorius	LH-729060
Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock	Dutscher	33290
MultiChannel Experimenter	MCS	-
N2 Supplement-A	StemCell	7152
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
Neurocult SM1 neuronal supplement	StemCell	5711
Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	030570ACL
Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	032260CL
Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	134760CL
Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine	Dutscher	X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity	Drummond	4000202/4038202
Pipette for cell culture 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
Pipette for cell culture 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
Plaque chauffante (CultureTemp)	Belart	370151000
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Primovert microscope	Zeiss	415510-1100-000
Scepter (Handheld Automated Cell Counter)	Millipore	PHCC00000
TGF-β1	Peprotech	100-21C
Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352096
Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352070