Co-cultura de neurônios glutamatergicos e células glioma pediátricas de alto grau em dispositivos microfluidos para avaliar interações elétricas

Resumo

Trabalhos recentes revelam o impacto neuronal em células de glioma pediátrico de alto grau (pHGG) e suas interações recíprocas. O presente trabalho mostra o desenvolvimento de um modelo in vitro co-culminando células pHGG e neurônios glutamatergicos e registrou suas interações eletrofisiológicas para imitar essas interatividades.

Resumo

gliomas pediátricos de alto grau (pHGG) representam cânceres cerebrais infantis e adolescentes que carregam um rápido prognóstico sombrio. Uma vez que há a necessidade de superar a resistência aos tratamentos atuais e encontrar uma nova forma de cura, modelar a doença o mais próximo possível em um ambiente in vitro para testar novas drogas e procedimentos terapêuticos é altamente exigente. Estudar seus processos patobiológicos fundamentais, incluindo a hiperexcitabilidade do neurônio glutamtergógico, será um verdadeiro avanço na compreensão das interações entre o cérebro ambiental e as células pHGG. Portanto, para recriar as interações de neurônios/células pHGG, este trabalho mostra o desenvolvimento de um modelo in vitro funcional co-culturando tronco pluripotente induzido por humano (hiPS) neurônios glutamatericos derivados pHGG células pHGG em dispositivos microfluidos compartimentalizados e um processo para registrar suas modificações eletrofisiológicas. O primeiro passo foi diferenciar e caracterizar neurônios glutamatericos humanos. Em segundo lugar, as células foram cultivadas em dispositivos microfluidos com linhas celulares derivadas pHGG. O microambiente cerebral e a atividade neuronal foram então incluídos neste modelo para analisar o impacto elétrico das células pHGG nesses neurônios microambientes. Gravações eletrofisiológicas são acopladas usando matrizes multielerodas (MEA) a esses dispositivos microfluidos para imitar condições fisiológicas e registrar a atividade elétrica de toda a rede neural. Um aumento significativo da excitabilidade dos neurônios foi sublinhado na presença de células tumorais.

Introdução

Os gliomas pediátricos de alto grau (pHGG) apresentam uma diversidade genotípica e fenotípica estendida, dependendo da idade do paciente, localização e extensão anatômicas do tumor e drivers ^moleculares1. São tumores cerebrais agressivos que são mal controlados com as opções de tratamento disponíveis atualmente e são a principal causa de morte relacionada a cânceres cerebrais em crianças e ^{adolescentes2}. Assim, mais de 80% dos pacientes estão recaídas dentro de 2 anos após seu diagnóstico, e sua sobrevida mediana é de 9 a 15 meses, dependendo das localizações cerebrais e mutações do motorista. A ausência de tratamento curativo é o principal impulso para pesquisas laboratoriais e destaca a necessidade imediata de novas abordagens terapêuticas inovadoras. Para isso, as linhas celulares derivadas do paciente (PDCL) foram desenvolvidas com a esperança de fornecer a diversidade ^pHGG3 em linhas bidimensionais (2D) e/ou neuroesferas tridimensionais (3D). No entanto, essas culturas celulares in vitro derivadas do paciente não imitam todas as situações variáveis cerebrais. Esses modelos não consideram os ambientes neuroscópicos e microscópicos macroscópicos tipicamente descritos no pHGG.

Normalmente, o pHGG em crianças mais jovens está se desenvolvendo principalmente em regiões pontinas e talámicas, enquanto o HGG de adolescentes e jovens adultos se concentra nas áreas corticais, especialmente nos lobos frontotemporâneos1. Essas especificidades de localização em idades pediátricas parecem envolver diferentes ambientes que levam à gliomagênese e a uma rede metiço entre células tumorais e atividade neuronal ^{específica4,5,6}. Embora os mecanismos ainda não sejam identificados, o pHGG desenvolve-se principalmente a partir de células precursoras neurais ao longo da trajetória de diferenciação das linhagens astroglial e oligodendroglial. Embora o papel dessas linhagens gliais tenha sido por muito tempo restrito ao simples suporte estrutural para os neurônios, agora está claramente estabelecido que eles se integram inteiramente em circuitos neurais e exibem complexas interações gliais-neuronais complexas capazes de reorganizar regiões estruturais do cérebro e remodelar circuitos neuronais4,7,8 . Além disso, o aumento de fragmentos de evidências indica que o sistema nervoso central (SNC) desempenha um papel crítico na iniciação e progressão do câncer cerebral. Trabalhos recentes se concentraram na atividade neuronal, que parece impulsionar o crescimento e a mitose das malignidades gliais através de fatores de crescimento secretados e comunicações sinápticas eletroquímicas ^diretas6,9. Reciprocamente, as células de glioma de alto grau parecem influenciar a função neuronal com uma atividade neuronal glutamatergic crescente e modular o funcionamento dos circuitos nos quais estão estruturalmente e eletricamente ^integrados9. Assim, estudos usando modelos derivados do paciente e novas ferramentas de neurociência que controlam a ação dos neurônios demonstraram um efeito específico do circuito da atividade neuronal na localização, crescimento e progressão do glioma. A maioria dessas projeções neuronais envolvidas em gliomas são glutamatergicas e se comunicam através de secreções de glutamato. Biomarcadores glutamérgicos específicos, como mGluR2 ou vGlut1/2, são comumente ^descritos6.

Curiosamente, apesar de sua heterogeneidade molecular, gliomas pediátricos e adultos de alto grau mostram uma resposta proliferativa típica à atividade neuronal glutamatergica e outros fatores secretados como neuroligina-3 ou BDNF (fator neurotrófico derivado do cérebro)4,6,10,11,12,13 . Nas regiões corticais, os HGGs pediátricos e adultos podem induzir a hiperexcitabilidade neuronal através de uma secreção de glutamato aumentada e inibir interneurônios GABA que levam a gliomas associados à atividade da rede epiléptica14,15. Além disso, circuitos neurais podem ser remodelados por gliomas empurrando tarefas neurológicas específicas, por exemplo, linguagem, e podem requisitar atividades neuronais organizadas ^adicionais9.

Com base nessa lógica, o avanço da compreensão das comunicações bidirecionais entre células glioma e neurônios deve ser totalmente elucidado e integrado com os estágios iniciais das abordagens in vitro pHGG. Tal modelagem inovadora é crucial para entender e medir o impacto da atividade elétrica neuronal durante o teste de drogas e antecipar a resposta do PHGG em circuitos cerebrais. Desenvolvimentos recentes em ferramentas de neurociência, como dispositivos microfluidos e trabalhos de pesquisa pHGG, são o leito para desenvolver novas abordagens de modelagem e agora ser capaz de integrar o microambiente cerebral em modelos in vitro pHGG3,16,17,18,19. Juntamente com gravações eletrofisiológicas usando matrizes multieletrônicas (MEA), dispositivos microfluidos20,21,22 oferecem a possibilidade de imitar condições fisiológicas ao registrar a atividade elétrica de toda a rede neural e extrair parâmetros de conectividade de rede em várias condições. Este ^{dispositivo23,24} permite primeiro a deposição precisa de células em uma câmara diretamente no MEA. Esta tecnologia permite o controle da densidade de semeadura celular e homogeneidade no MEA e o controle fino da troca de mídia, que é um passo crítico para a diferenciação de progenitores neurais humanos diretamente em dispositivos. Além disso, a atual câmara de deposição pode ser semeada com múltiplas células em diferentes pontos de tempo.

Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver um modelo in vitro funcional co-culminando neurônios glutamatergicos derivados do padrão pluripotente (hiPS) derivados de neurônios glutamatergicos derivados e células derivadas do pHGG em dispositivos microfluidos e registrando sua atividade elétrica para avaliar interações elétricas entre ambas as populações celulares. Primeiro, os neurônios glutamatericos cortical derivados do hiPS foram obtidos e caracterizados em dispositivos microfluidos em diferentes estágios da cultura [dia 4 (D4), como células hiPS, e dia 21 (D21) e dia 23 (D23), como neurônios amadurecidos glutamater]. Para a segunda etapa da cocultura, foram utilizados dois modelos pHGG: a linha UW479 pediátrica comercializada e as células pHGG iniciadas a partir de um tumor do paciente (BT35)³, com uma mutação do driver H3.3 K27M. Finalmente, realizamos gravações eletrofisiológicas de células glutamatergicas em D21 antes da semeadura celular pHGG e D23 após 48 h de co-cultura no mesmo dispositivo microfluido. As interações entre neurônios glutamatergicos e células pHGG foram caracterizadas por um aumento significativo na atividade eletrofisiológica registrada.

Protocolo

Para este protocolo, o número de credenciamento relacionado ao uso de materiais humanos é DC-2020-4203.

1. Fabricação, preparação e tratamento de dispositivos microfluidos

1. Fabricar moldes SU-8 utilizando técnicas de fotolitografia ^{convencionais18}.
   NOTA: Para isso, duas máscaras fotolitografia foram projetadas para construir duas camadas de estruturas fotoresististas no substrato de wafer de silício e uma fina camada fotoresista SU-8 2005 (3,2 μ m alto e 6 ± 1 μm de largura) que define microrressométricas sob a padronização dos principais canais feitos em SU-8 2100 (200 μm de altura, 1 mm de largura, e 13 mm de comprimento) (ver Figura Suplementar S1).
2. Ative o wafer usando um limpador de plasma (5.00e-1 torr, alto nível ^de radiofrequência (RF) por 1 min e silanize-o usando 1 mL de (tricloro(1S,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano em uma pasta de alumínio em um desiccador por 30 minutos.
3. Prepare uma proporção de 10:1 de Polidimtilsiloxano (PDMS), misture o prepolímero com catalisador, passe-o em um dessector de vácuo para remover bolhas presas e lance-o lentamente sobre o molde antes de ser curado em um forno a 80 °C por 40 min.
4. Corte-o depois disso usando uma navalha no tamanho desejado antes de descascar o molde. Bata a entrada e as zonas de saída para obter furos de 3 mm de largura, limpe o PDMS e proteja-o usando fita adesiva.
   NOTA: A espessura do dispositivo PDMS final é de aproximadamente 5 mm.
5. Trate o dispositivo usando um limpador de plasma (5.00e-1 torr, alto nível de RF durante 1 min), monte-o com uma placa de Petri de poliestireno e exponha o vácuo sob luz UV por 30 minutos.
6. Encha com uma pipeta a entrada do dispositivo microfluido antes do uso com 70% de etanol e esvazie-o por aspiração de tubulação.
7. Lave o dispositivo microfluido adicionando reservatórios de entrada O Soro tampão tampão de fosfato (D-PBS) de Dulbecco e esvazie-o por aspiração de tubulação três vezes consecutivas.
8. Cubra o dispositivo usando 0,05 mg/mL Poly-D-Lysine e coloque-o em uma incubadora (37 °C, 5% DE _CO2). Após 24 horas, enxágue o dispositivo adicionando no reservatório de entrada o meio neurobásal e esvazie-o por aspiração de tubulação três vezes consecutivas.
9. Encha o chip microfluido com o meio de cultura celular e deixe-o permanecer em temperatura ambiente até que seja usado por um máximo de 2 h.

2. Preparação celular e semeadura no dispositivo microfluido

1. Cultura, semeadura e caracterização imunofluorescente de neurônios glutamatergicos derivados do hiPS humano
   NOTA: Realizar experimentos com neurônios glutamatergicos cortical derivados de hiPS (Figura 1A). Preservar materiais derivados do homem e manuseá-los com a aprovação e sob as diretrizes da legislação.
   1. Esvazie os reservatórios de entrada e saída do dispositivo microfluido por aspiração de pipeta antes da semeadura, permitindo que apenas os canais do dispositivo sejam preenchidos com meio.
   2. Semente as células hiPS no dia 0 (D0) colocando 10 μL de uma suspensão de células hiPS/mL de ^{6,5 x 106} (por exemplo, concentração de 900 células/^mm2 ) com o meio, cuja composição é dada na Tabela 1, e deixe o dispositivo ficar sob o capô (à temperatura ambiente) por 15 minutos para permitir que as células se conectem.
   3. Após 15 min, encha tanto os reservatórios de entrada quanto de saída com 50 μL de meio de cultura D4, cuja composição inteira é dada na Tabela 1, e transfira o dispositivo para a incubadora (37 °C, 5% DE _CO2).
   4. Manter a diferenciação de neurônio glutamatergic por 23 dias (Figura 1A(1), microscopia) em ambiente controlado (37 °C, 5% _CO2) e com um meio de cultura celular específico, cuja composição está descrita na Tabela 1. Substitua o meio regularmente conforme detalhado na próxima etapa 5. logo abaixo e siga os passos como na Figura 1B.
   5. Substitua o meio a cada 3 a 4 dias após a composição da Tabela 1 . Utilize o meio de semeadura até D4, D4 médio até D7, D7 médio até D11 e meio D11 para o tempo restante da cultura.
   6. Tire fotos microscópicas em D4, D21 e D23 usando um microscópio padrão de contraste de fase para avaliar a viabilidade celular e permitir a contagem de células.
   7. Para caracterização, fixar os neurônios glutamatergicos diferenciados em 4% de paraformaldeído (PFA) por 30 minutos à temperatura ambiente após aspiração média e seguir o protocolo de coloração de imunofluorescência.
   8. Lave as células três vezes com Salina Tamponada de Fosfato (PBS) e permeabiliza-as por 10 minutos com 0,1% Triton-X seguida por 30 min com 3% de Albumina de Soro Bovino (BSA). Adicione anticorpos primários e incubar o dispositivo durante a noite a 4 °C.
   9. Enxágüe as células três vezes com PBS e incuba ainda mais com os anticorpos secundários correspondentes por 2 h à temperatura ambiente.
      NOTA: Os anticorpos imunofluorescentes utilizados no estudo estão listados na Tabela 2.
   10. Enxágüe as células três vezes com PBS e contraten com DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) por 10 minutos à temperatura ambiente.
   11. Adquira imagens com um microscópio de epifluorescência invertida equipado com uma câmera CMOS (Complementary metal-óxido-semicondutor) e analise usando um software de análise de imagem apropriado.
   12. Abra as imagens manchadas do DAPI e binarize com a rotina de limiar no software. Para fazer isso, clique em Imagem > Ajuste > Limiar e defina os parâmetros apropriados para distinguir o núcleo do plano de fundo. Em seguida, clique em Aplicar > Processo > Bacia hidrográfica para dividir o núcleo agregado.
   13. Depois disso, use a função do software Analyze Particles inata para interpretar as imagens binárias. Para fazer isso, clique em Analisar partículas e, em seguida, em Analisar partículas e definir os parâmetros apropriados após isso: filtro de tamanho e circularidade (exclua de objetos de análise menores que 7 μm, maiores que 20 μm, ou com uma circularidade menor que 0,1 μm).
   14. Mescle as imagens de contorno obtidas da análise da DAPI às imagens imunofluorescentes correspondentes para validar a coloração correta.
   15. Finalmente, salve os dados associados (número de objetos, área média, % de cobertura, etc.) para os diferentes biomarcadores e quantifique a expressão em D4 e/ou D21 usando software de quantificação apropriado.
2. Cultura celular da linha pHGG comercializada, UW479, e linha celular derivada do paciente, ^BT353
   1. Cultura ambas as linhas celulares em DMEM/F-12 GlutaMAX suplementadas com 10% de Soro Bovino Fetal (FBS) em um frasco de cultura celular. Aguarde 80% de confluência de cada linha celular apresentada na Figura 1C.
   2. Mantenha essas células pHGG sob um ambiente controlado a 37 °C em condições normóxias durante os experimentos.

3. Protocolo de co-cultura

1. Ajuste o dia de semeadura e a concentração das linhas celulares UW479 e BT35 para atingir 80% das células confluentes quando a co-cultura deve começar, correspondendo a 21 dias de cultura para neurônios glutamatergicos.
2. Experimentpsinize as células UW479 e BT35 e semeá-las no topo dos neurônios glutamatergicos em cada dispositivo microfluido dedicado (com uma densidade alvo de 900 células/^mm2 para cada tipo de célula) antes de semear as células pHGG no dispositivo microfluido contendo neurônios glutamatergicos maduros.
3. Manter as coculturas por 2 dias em ambiente controlado (37 °C, 5% _CO2) com neurônio glutamatergic D11 e meio em diante detalhado na Tabela 1.
4. Conte células pHGG usando as imagens microscópicas analisadas com um software de análise de imagem para avaliar sua viabilidade. Calcule a porcentagem de células.
   NOTA: Use a seguinte fórmula: 100 - ((número de células em D23 / número de células em D21) x 100).

4. Gravação eletrofisiológica

1. Realize a gravação eletrofisiológica com um sistema comercial e software comercialmente disponível.
   NOTA: Os experimentos foram realizados com um MEA que consistia de eletrodos de 30 μm de diâmetro espaçados por 100 μm.
2. Realize um primeiro registro eletrofisiológico em neurônios glutamatericos em D21 antes da semeadura de células pHGG. Use os neurônios glutamatericos diferenciados como controlá-los e cultuá-los sozinhos em paralelo à cocultura. Faça uma segunda gravação para ambas as condições, conforme descrito no próximo passo numerado 3.
3. Realize uma segunda gravação eletrofisiológica na D23 (após 2 dias de co-cultura).

5. Processamento de dados eletrofisiológicos

1. Filtre os dados brutos com um filtro Butterworth de ^2ª ordem (com frequências de banda de passagem de 100 Hz e 2500 Hz).
2. Para detecção de picos, calcule o quadrado médio raiz do sinal ao longo da gravação de 10 minutos para cada eletrodo e defina um limiar de amplitude correspondente a oito vezes o valor quadrado desta raiz.
3. Aplique um algoritmo PTSD (Precision Timing Spike ^Detection25), considerando uma duração máxima de 2 ms para um potencial de ação.
4. Considere como um eletrodo ativo, cada eletrodo detectando pelo menos 5 picos/min. Continue o ensaio se pelo menos 10% dos eletrodos de gravação estiverem ativos.
5. Divida o número de picos detectados pelo período de tempo de gravação para calcular a taxa média de disparo de cada eletrodo ativo. Calcule uma taxa média média de disparo para cada experimento independente. Em última análise, calcule uma média por condição (±SEM) e expresse-a como uma função no dia da gravação.
6. Calcule um gráfico raster para cada experimento representando os eventos detectados para cada eletrodo ativo em função do tempo. Em seguida, calcule as taxas de disparo em toda a matriz temporal (ou taxas de disparo instantâneas) de todos os eletrodos ativos, permitindo monitorar a sincronicidade da atividade da rede neural.
7. Finalmente, gere gráficos de barras usando o software de quantificação e realize comparações usando testes kruskal Wallis.

Resultados

Antes de estudar as interações elétricas entre neurônios glutamatergicos e células glioma, os neurônios glutamatergicos cortical derivados do hiPS foram caracterizados para validar a viabilidade de culminá-los em dispositivos microfluidos (Figura 1A). Sua caracterização foi avaliada utilizando Nestin, Sox2, mGlurR2 (receptores metabotrópicos de glutamato 2), e imunostaining vGLUT1, representado na Figura 1A(2-7)

Discussão

Este trabalho descreve um modelo in vitro funcional preciso para avaliar a interação entre neurônios glutamatergicos cortical derivados do hiPS humano e células tumorais cerebrais em dispositivos microfluidos. Um dos passos cruciais no presente protocolo foi a diferenciação hiPS em neurônios glutamatericos, o que foi confirmado pela diminuição da coloração imunofluorescente Nestin e Sox2 e aparência simultânea da coloração mGluR2 e vGLUT1. No entanto, poucos progenitores neurais permaneceram como ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
256MEA100/30iR-ITO-w/o	MCS	256MEA100/30iR-ITO-w/o
40 µm probe for Scepter counter	Dutscher	53750
60 µm probe for Scepter counter	Dutscher	51999
Accutase	Sigma	A6964
Ala -Gln (GlutaMAX)	Sigma	G8541
Axel Observer 7 Microscope	Zeiss	431007-9904-000
Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon®	Dutscher	353109
Class II Biological Safety Cabinet	Thermo Scientific	HERASafe type KS12
Colibri 7 LED	Zeiss	4230529710-000
Cortical Glutamatergic Neurons	BrainXell	BX-0300
DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX	Gibco	31331-028
DMEM/F12 Medium	Sigma	D8437
DPBS 1X	Dutscher	L0615-500
EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3	Nunc	156499
Foetal Bovine Serum (FBS)	Dutscher	500105
GDNF	Peprotech	450-10
Geltrex	Life Technologies	A1413201
Human BDNF	Peprotech	450-02
Incubator	Memmert	IC0150med
MCS InterFace Boarder	MCS	181205-MEA2100-11240
MEA2100	MCS	181205-MEA2100-11240
Micropipette P10	Sartorius	LH-729020
Micropipette P100	Sartorius	LH-729050
Micropipette P1000	Sartorius	LH-729070
Micropipette P200	Sartorius	LH-729060
Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock	Dutscher	33290
MultiChannel Experimenter	MCS	-
N2 Supplement-A	StemCell	7152
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
Neurocult SM1 neuronal supplement	StemCell	5711
Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	030570ACL
Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	032260CL
Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	134760CL
Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine	Dutscher	X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity	Drummond	4000202/4038202
Pipette for cell culture 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
Pipette for cell culture 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
Plaque chauffante (CultureTemp)	Belart	370151000
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Primovert microscope	Zeiss	415510-1100-000
Scepter (Handheld Automated Cell Counter)	Millipore	PHCC00000
TGF-β1	Peprotech	100-21C
Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352096
Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352070