Co-coltura di neuroni glutamatergici e cellule di glioma pediatrico di alto grado in dispositivi microfluidici per valutare le interazioni elettriche

Riepilogo

Lavori recenti scoprono l'impatto neuronale sulle cellule di glioma pediatrico di alto grado (pHGG) e le loro interazioni reciproche. Il presente lavoro mostra lo sviluppo di un modello in vitro che co-coltiva cellule pHGG e neuroni glutamatergici e registra le loro interazioni elettrofisiologiche per imitare tali interattività.

Abstract

I gliomi pediatrici di alto grado (pHGG) rappresentano tumori cerebrali infantili e adolescenziali che portano una prognosi rapida e triste. Poiché è necessario superare la resistenza ai trattamenti attuali e trovare un nuovo modo di curare, è molto impegnativo modellare la malattia il più vicino possibile in un ambiente in vitro per testare nuovi farmaci e procedure terapeutiche. Studiare i loro processi patobiologici fondamentali, compresa l'ipereccitabilità dei neuroni glutammatergici, sarà un vero progresso nella comprensione delle interazioni tra il cervello ambientale e le cellule pHGG. Pertanto, per ricreare le interazioni neuroni/cellule pHGG, questo lavoro mostra lo sviluppo di un modello funzionale in vitro che co-coltiva i neuroni glutamatergici corticali derivati dall'uomo (hiPS) in cellule pHGG in dispositivi microfluidici compartimentati e un processo per registrare le loro modifiche elettrofisiologiche. Il primo passo è stato quello di differenziare e caratterizzare i neuroni glutamatergici umani. In secondo luogo, le cellule sono state coltivate in dispositivi microfluidici con linee cellulari derivate da pHGG. Il microambiente cerebrale e l'attività neuronale sono stati quindi inclusi in questo modello per analizzare l'impatto elettrico delle cellule pHGG su questi neuroni micro-ambientali. Le registrazioni elettrofisiologiche sono accoppiate utilizzando array multielettrodi (MEA) a questi dispositivi microfluidici per imitare le condizioni fisiologiche e registrare l'attività elettrica dell'intera rete neurale. Un aumento significativo dell'eccitabilità neuronale è stato sottolineato in presenza di cellule tumorali.

Introduzione

I gliomi pediatrici di alto grado (pHGG) presentano un'estesa diversità genotipica e fenotipica a seconda dell'età del paziente, della posizione e dell'estensione anatomica del tumore e dei driver ^molecolari1. Sono tumori cerebrali aggressivi che sono scarsamente controllati con le opzioni di trattamento attualmente disponibili e sono la principale causa di morte correlata ai tumori cerebrali nei bambini e negli ^adolescenti2. Quindi, oltre l'80% dei pazienti recidiva entro 2 anni dalla diagnosi e la loro sopravvivenza mediana è di 9-15 mesi, a seconda delle posizioni cerebrali e delle mutazioni del conducente. L'assenza di trattamenti curativi è l'urgenza primaria per la ricerca di laboratorio ed evidenzia l'immediata necessità di nuovi approcci terapeutici innovativi. A tale scopo, sono state sviluppate linee cellulari derivate dal paziente (PDCL) con la speranza di fornire la diversità ^pHGG3 in linee bidimensionali (2D) e / o neurosfere tridimensionali (3D). Tuttavia, quelle colture cellulari in vitro derivate dal paziente non imitano tutte le situazioni variabili del cervello. Questi modelli non considerano gli ambienti neuro-anatomici macroscopici e microscopici tipicamente descritti in pHGG.

Di solito, il pHGG nei bambini più piccoli si sviluppa principalmente nelle regioni pontine e talamiche, mentre l'HGG adolescenziale e del giovane adulto si concentra nelle aree corticali, specialmente nei lobi frontotemporali1. Queste specificità di localizzazione in tutte le età pediatriche sembrano coinvolgere ambienti diversi che portano alla gliomagenesi e a una rete intricata tra le cellule tumorali e l'attività neuronale ^{specifica4,5,6}. Sebbene i meccanismi non siano ancora identificati, il pHGG si sviluppa principalmente da cellule precursori neurali lungo la traiettoria di differenziazione dei lignaggi astrogliali e oligodendrogliali. Mentre il ruolo di questi lignaggi gliali è stato a lungo limitato al semplice supporto strutturale per i neuroni, ora è chiaramente stabilito che si integrano interamente nei circuiti neurali e mostrano complesse interazioni bidirezionali gliale-neuronale in grado di riorganizzare le regioni strutturali del cervello e rimodellare i circuiti neuronali4,7,8 . Inoltre, l'aumento di brandelli di prove indica che il sistema nervoso centrale (SNC) svolge un ruolo critico nell'inizio e nella progressione del cancro al cervello. Lavori recenti si sono concentrati sull'attività neuronale, che sembra guidare la crescita e la mitosi delle neoplasie gliali attraverso fattori di crescita secreti e comunicazioni sinaptiche elettrochimiche ^dirette6,9. Reciprocamente, le cellule di glioma di alto grado sembrano influenzare la funzione neuronale con una crescente attività neuronale glutamatergica e modulare il funzionamento dei circuiti in cui sono strutturalmente ed elettricamente ^integrate9. Quindi, gli studi che utilizzano modelli derivati dal paziente e nuovi strumenti di neuroscienza che controllano l'azione dei neuroni hanno dimostrato un effetto specifico del circuito dell'attività neuronale sulla posizione, la crescita e la progressione del glioma. La maggior parte di queste proiezioni neuronali coinvolte nei gliomi sono glutamatergiche e comunicano attraverso le secrezioni di glutammato. Biomarcatori glutamatergici specifici come mGluR2 o vGlut1/2 sono comunemente ^descritti6.

È interessante notare che, nonostante la loro eterogeneità molecolare, i gliomi pediatrici e adulti di alto grado mostrano una tipica risposta proliferativa all'attività neuronale glutammatergica e ad altri fattori secreti come la neuroligina-3 o bdNF (fattore neurotrofico derivato dal cervello)4,6,10,11,12,13 . Nelle regioni corticali, gli HHG pediatrici e adulti possono indurre ipereccitabilità neuronale attraverso un aumento della secrezione di glutammato e inibire gli interneuroni GABA che portano a gliomi associati all'attività della rete ^{epilettica14,15}. Inoltre, i circuiti neurali possono essere rimodellati dai gliomi spingendo specifici compiti neurologici, ad esempio il linguaggio, e possono richiedere un'ulteriore attività neuronale ^organizzata9.

Sulla base di questo razionale, l'avanzamento della comprensione delle comunicazioni bidirezionali tra cellule di glioma e neuroni deve essere completamente chiarito e integrato con le prime fasi degli approcci pHGG in vitro. Tale modellazione innovativa è fondamentale per comprendere e misurare l'impatto dell'attività elettrica neuronale durante i test antidroga e anticipare la risposta pHGG nei circuiti cerebrali. I recenti sviluppi negli strumenti di neuroscienza, come i dispositivi microfluidici e i lavori di ricerca pHGG, sono il terreno per sviluppare nuovi approcci di modellazione ed essere ora in grado di integrare il microambiente cerebrale in modelli pHGG in vitro3,16,17,18,19. Accoppiati con registrazioni elettrofisiologiche che utilizzano array multielettrodi (MEA), i dispositivi ^{microfluidici20,21,22} offrono la possibilità di imitare le condizioni fisiologiche registrando l'attività elettrica dell'intera rete neurale ed estrarre i parametri di connettività di rete in diverse condizioni. Questo ^{dispositivo23,24} permette ^innanzitutto la deposizione precisa delle cellule in una camera direttamente su MEA. Questa tecnologia consente il controllo della densità e dell'omogeneità della semina cellulare su MEA e il controllo fine dello scambio di media, che è un passo fondamentale per la differenziazione del progenitore neurale umano direttamente nei dispositivi. Inoltre, l'attuale camera di deposizione può essere seminata con più cellule in diversi punti temporali.

Quindi, questo studio mirava a sviluppare un modello funzionale in vitro che co-coltivasse neuroni glutamatergici corticali derivati da stelo pluripotente umano (hiPS) e cellule derivate da pHGG in dispositivi microfluidici e registrasse la loro attività elettrica per valutare le interazioni elettriche tra entrambe le popolazioni cellulari. In primo luogo, i neuroni glutamatergici corticali derivati da hiPS sono stati ottenuti e caratterizzati in dispositivi microfluidici in diversi stadi di coltura [giorno 4 (D4), come cellule hiPS, e giorno 21 (D21) e giorno 23 (D23), come neuroni maturi glutamatergici]. Per la seconda fase della co-coltura, sono stati utilizzati due modelli di pHGG: linea UW479 pediatrica commercializzata e cellule pHGG avviate da un tumore del paziente (BT35)³, portatore di una mutazione driver H3.3 K27M. Infine, abbiamo eseguito registrazioni elettrofisiologiche di cellule glutamatergiche a D21 prima della semina delle cellule pHGG e D23 dopo 48 ore di co-coltura nello stesso dispositivo microfluidico. Le interazioni tra neuroni glutamatergici e cellule pHGG sono state caratterizzate da un aumento significativo dell'attività elettrofisiologica registrata.

Protocollo

Per questo protocollo, il numero di accreditamento relativo all'uso di materiali umani è DC-2020-4203.

1. Fabbricazione, preparazione e trattamento di dispositivi microfluidici

1. Fabbricare stampi SU-8 utilizzando tecniche di fotolitografia ^{convenzionali18}.
   NOTA: A tale scopo, sono state progettate due maschere fotolitografiche per costruire due strati di strutture fotoresistenti su substrato di wafer di silicio e un sottile strato di fotoresist su SU-8 2005 (alto 3,2 μm e largo 6 ± 1 μm) che definisce microgroove asimmetriche sotto la modellazione dei canali principali realizzati in SU-8 2100 (200 μm di altezza, 1 mm di larghezza, e 13 mm di lunghezza) (vedi Figura supplementare S1).
2. Attivare il wafer utilizzando un detergente al plasma (5.00e-1 torr, livello ad alta radiofrequenza (RF)) per 1 minuto e silanizzarlo utilizzando 1 mL di (tricloro (1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silano in una cartella di alluminio in un essiccatore per 30 min.
3. Preparare un rapporto 10:1 di polidimetilsilossano (PDMS), mescolare il prepolimero con il catalizzatore, passarlo in un essiccatore sottovuoto per rimuovere le bolle intrappolate e gettarlo lentamente sullo stampo prima di essere indurito in forno a 80 °C per 40 minuti.
4. Taglialo dopo usando un rasoio alla dimensione desiderata prima di staccare lo stampo. Perforare le zone di ingresso e di uscita per ottenere fori larghi 3 mm, pulire il PDMS e proteggerlo con nastro adesivo.
   NOTA: lo spessore del dispositivo PDMS finale è di circa 5 mm.
5. Trattare il dispositivo utilizzando un detergente al plasma (5.00e-1 torr, Alto livello RF durante 1 minuto), assemblarlo con una capsula di Petri in polistirolo ed esporre il vuoto sotto la luce UV per 30 minuti.
6. Riempire con una pipetta l'ingresso del dispositivo microfluidico prima dell'uso con etanolo al 70% e svuotarlo mediante aspirazione di pipettaggio.
7. Lavare il dispositivo microfluidico aggiungendo serbatoi di ingresso Dulbecco Fosfato Tamponato Saline (D-PBS) e svuotarlo mediante aspirazione di pipettaggio per tre volte consecutive.
8. Rivestire il dispositivo utilizzando 0,05 mg/mL di poli-D-lisina e metterlo in un incubatore (37 °C, 5% _CO2). Dopo 24 ore, sciacquare il dispositivo aggiungendo nel serbatoio di ingresso il mezzo neurobasale e svuotarlo mediante pipettaggio dell'aspirazione per tre volte consecutive.
9. Riempire il chip microfluidico con il terreno di coltura cellulare e lasciarlo rimanere a temperatura ambiente fino all'uso per un massimo di 2 ore.

2. Preparazione cellulare e semina nel dispositivo microfluidico

1. Coltura, semina e caratterizzazione immunofluorescente di neuroni glutamatergici corticali umani derivati da hiPS
   NOTA: Effettuare esperimenti con neuroni glutamatergici corticali derivati da hiPS commercializzati (Figura 1A). Preservare i materiali di derivazione umana e maneggiarli con l'approvazione e secondo le linee guida della legislazione.
   1. Svuotare i serbatoi di ingresso e di uscita del dispositivo microfluidico mediante aspirazione a pipetta prima della semina, lasciando che solo i canali del dispositivo vengano riempiti con il mezzo.
   2. Seminare le cellule hiPS al giorno 0 (D0) mettendo 10 μL di una sospensione di 6,5 x ¹⁰⁶ cellule hiPS/mL (ad esempio, concentrazione di 900 cellule/^mm2 ) con il mezzo, la cui composizione è riportata nella Tabella 1, e lasciare che il dispositivo sia sotto il cofano (a temperatura ambiente) per 15 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi.
   3. Dopo 15 minuti, riempire sia i serbatoi di ingresso che di uscita con 50 μL di terreno di coltura D4, la cui intera composizione è riportata nella Tabella 1, e trasferire il dispositivo nell'incubatore (37 °C, 5% _CO2).
   4. Mantenere la differenziazione neuronale glutamatergica per 23 giorni (Figura 1A(1), microscopia) in ambiente controllato (37 °C, 5% _CO2) e con uno specifico terreno di coltura cellulare, la cui composizione è descritta nella Tabella 1. Sostituire regolarmente il mezzo come descritto nel passaggio successivo 5. appena sotto e seguire i passaggi come nella Figura 1B.
   5. Sostituire il mezzo ogni 3 o 4 giorni dopo la composizione della Tabella 1 . Utilizzare il mezzo di semina fino a D4, D4 medio fino a D7, D7 medio fino a D11 e D11 medio per il tempo rimanente della coltura.
   6. Scatta foto microscopiche a D4, D21 e D23 utilizzando un microscopio a contrasto di fase standard per valutare la vitalità cellulare e consentire il conteggio delle cellule.
   7. Per la caratterizzazione, fissare i neuroni glutamatergici differenziati in paraformaldeide al 4% (PFA) per 30 minuti a temperatura ambiente dopo l'aspirazione del mezzo e seguire il protocollo per la colorazione a immunofluorescenza.
   8. Lavare le cellule tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e permeabilizzarle per 10 minuti con 0,1% di Triton-X seguito da 30 minuti con il 3% di albumina sierica bovina (BSA). Aggiungere anticorpi primari e incubare il dispositivo durante la notte a 4 °C.
   9. Risciacquare le cellule tre volte con PBS e incubare ulteriormente con gli anticorpi secondari corrispondenti per 2 ore a temperatura ambiente.
      NOTA: Gli anticorpi immunofluorescenti utilizzati nello studio sono elencati nella Tabella 2.
   10. Risciacquare le cellule tre volte con PBS e controcolorare con DAPI (4',6-diamino-2-fenilindolo) per 10 minuti a temperatura ambiente.
   11. Acquisire immagini con un microscopio a epifluorescenza invertita dotato di una telecamera CMOS (Complementary metal-oxide-semiconductor) e analizzarle utilizzando un software di analisi delle immagini appropriato.
   12. Aprire le immagini macchiate DAPI e binariizzare con la routine di soglia nel software. Per fare ciò, fare clic su Immagine > Regola > soglia e impostare i parametri appropriati per distinguere il nucleo dallo sfondo. Quindi, fare clic su Applica processo > > spartiacque per dividere il nucleo aggregato.
   13. Successivamente, utilizzare la funzione del software innato Analyze Particles per interpretare le immagini binarie. Per fare ciò, fare clic su Analizza e quindi su Analizza particelle e impostare i parametri appropriati dopo questo: filtro di dimensione e circolarità (escludere dall'analisi oggetti più piccoli di 7 μm, più grandi di 20 μm o con una circolarità inferiore a 0,1 μm).
   14. Unire le immagini di contorno ottenute dall'analisi DAPI alle immagini immunofluorescenti corrispondenti per convalidare la colorazione corretta.
   15. Infine, salvare i dati associati (numero di oggetti, area media, % di copertura, ecc.) per i diversi biomarcatori e quantificare l'espressione a D4 e/o D21 utilizzando un software di quantificazione appropriato.
2. Coltura cellulare della linea pHGG commercializzata, UW479, e della linea cellulare derivata dal paziente, ^BT353
   1. Coltivare entrambe le linee cellulari in DMEM/F-12 GlutaMAX integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) in un pallone di coltura cellulare. Attendere la confluenza dell'80% di ciascuna linea cellulare come presentato nella Figura 1C.
   2. Mantenere queste cellule pHGG in un ambiente controllato a 37 °C in condizioni normossiche durante gli esperimenti.

3. Protocollo di co-coltura

1. Regolare il giorno di semina e la concentrazione per le linee cellulari UW479 e BT35 per raggiungere l'80% delle cellule confluenti quando dovrebbe iniziare la co-coltura, corrispondenti a 21 giorni di coltura per i neuroni glutamatergici.
2. Tripsinizzare le cellule UW479 e BT35 e seminarle sulla parte superiore dei neuroni glutamatergici in ciascun dispositivo microfluidico dedicato (con una densità target di 900 cellule / ^mm2 per ciascun tipo di cellula) prima di seminare le cellule pHGG nel dispositivo microfluidico contenente neuroni glutamatergici maturi.
3. Mantenere le co-colture per 2 giorni in un ambiente controllato (37 °C, 5% _CO2) con neurone glutamatergico D11 e mezzo successivo dettagliato nella Tabella 1.
4. Conta le cellule pHGG utilizzando le immagini microscopiche analizzate con un software di analisi delle immagini per valutarne la fattibilità. Calcolare la percentuale di celle.
   NOTA: utilizzare la seguente formula: 100 - ((numero di celle in D23 / numero di celle in D21) x 100).

4. Registrazione elettrofisiologica

1. Eseguire la registrazione elettrofisiologica con un sistema commerciale e software disponibile in commercio.
   NOTA: Gli esperimenti sono stati condotti con un MEA che consisteva in elettrodi di 30 μm di diametro distanziati di 100 μm.
2. Eseguire una prima registrazione elettrofisiologica sui neuroni glutamatergici a D21 prima della semina delle cellule pHGG. Utilizzare i neuroni glutamatergici differenziati come controllo e coltivarli da soli in parallelo alla co-coltura. Eseguire una seconda registrazione per entrambe le condizioni come descritto nel passaggio successivo numerato 3.
3. Eseguire una seconda registrazione elettrofisiologica al D23 (dopo 2 giorni di co-coltura).

5. Trattamento elettrofisiologico dei dati

1. Filtrare i dati grezzi con un filtro Butterworth passa-banda di 2^° ordine (con frequenze passband di 100 Hz e 2500 Hz).
2. Per il rilevamento dei picchi, calcolare il quadrato medio della radice del segnale durante la registrazione di 10 minuti per ciascun elettrodo e impostare una soglia di ampiezza corrispondente a otto volte il valore quadrato di questa media radice.
3. Applicare un algoritmo PTSD (Precision Timing Spike ^Detection25), considerando una durata massima di 2 ms per un potenziale d'azione.
4. Considera come un elettrodo attivo, ogni elettrodo che rileva almeno 5 picchi / min. Continuare il test se almeno il 10% degli elettrodi di registrazione sono attivi.
5. Dividere il numero di picchi rilevati per il periodo di tempo di registrazione per calcolare la velocità media di accensione di ciascun elettrodo attivo. Calcola una velocità media di sparo per ogni esperimento indipendente. In definitiva, calcola una media per condizione (±SEM) ed esprimila come funzione il giorno della registrazione.
6. Calcola un grafico raster per ogni esperimento che rappresenta gli eventi rilevati per ciascun elettrodo attivo in funzione del tempo. Quindi, calcola le velocità di sparo a livello di array temporale (o velocità di accensione istantanea) di tutti gli elettrodi attivi, consentendo di monitorare la sincronicità dell'attività della rete neurale.
7. Infine, genera grafici a barre utilizzando il software di quantificazione ed esegui confronti utilizzando i test kruskal Wallis.

Risultati

Prima di studiare le interazioni elettriche tra neuroni glutamatergici e cellule di glioma, i neuroni glutamatergici corticali derivati da hiPS sono stati caratterizzati per convalidare la fattibilità di coltivarli in dispositivi microfluidici (Figura 1A). La loro caratterizzazione è stata valutata utilizzando Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotropic Glutamate Receptors 2) e vGLUT1 immunocolore, rappresentati nella Figura 1A (2-7)

Discussione

Questo lavoro descrive un accurato modello funzionale in vitro per valutare l'interazione tra neuroni glutamatergici corticali umani derivati da hiPS e cellule tumorali cerebrali in dispositivi microfluidici. Uno dei passaggi cruciali del presente protocollo è stata la differenziazione hiPS nei neuroni glutamatergici, che è stata confermata dalla diminuzione della colorazione immunofluorescente Nestin e Sox2 e dalla comparsa simultanea della colorazione mGluR2 e vGLUT1. Tuttavia, pochi progenitori neurali sono...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
256MEA100/30iR-ITO-w/o	MCS	256MEA100/30iR-ITO-w/o
40 µm probe for Scepter counter	Dutscher	53750
60 µm probe for Scepter counter	Dutscher	51999
Accutase	Sigma	A6964
Ala -Gln (GlutaMAX)	Sigma	G8541
Axel Observer 7 Microscope	Zeiss	431007-9904-000
Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon®	Dutscher	353109
Class II Biological Safety Cabinet	Thermo Scientific	HERASafe type KS12
Colibri 7 LED	Zeiss	4230529710-000
Cortical Glutamatergic Neurons	BrainXell	BX-0300
DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX	Gibco	31331-028
DMEM/F12 Medium	Sigma	D8437
DPBS 1X	Dutscher	L0615-500
EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3	Nunc	156499
Foetal Bovine Serum (FBS)	Dutscher	500105
GDNF	Peprotech	450-10
Geltrex	Life Technologies	A1413201
Human BDNF	Peprotech	450-02
Incubator	Memmert	IC0150med
MCS InterFace Boarder	MCS	181205-MEA2100-11240
MEA2100	MCS	181205-MEA2100-11240
Micropipette P10	Sartorius	LH-729020
Micropipette P100	Sartorius	LH-729050
Micropipette P1000	Sartorius	LH-729070
Micropipette P200	Sartorius	LH-729060
Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock	Dutscher	33290
MultiChannel Experimenter	MCS	-
N2 Supplement-A	StemCell	7152
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
Neurocult SM1 neuronal supplement	StemCell	5711
Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	030570ACL
Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	032260CL
Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	134760CL
Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine	Dutscher	X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity	Drummond	4000202/4038202
Pipette for cell culture 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
Pipette for cell culture 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
Plaque chauffante (CultureTemp)	Belart	370151000
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Primovert microscope	Zeiss	415510-1100-000
Scepter (Handheld Automated Cell Counter)	Millipore	PHCC00000
TGF-β1	Peprotech	100-21C
Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352096
Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352070