Glutamaterjik Nöronların ve Pediatrik Yüksek Dereceli Glioma Hücrelerinin Mikroakışkan Cihazlara Ortak Kültürü Elektriksel Etkileşimleri Değerlendirmek İçin

Özet

Son çalışmalar, yüksek dereceli pediatrik glioma (pHGG) hücreleri üzerindeki nöronal etkiyi ve bunların karşılıklı etkileşimlerini ortaya çıkarmaktadır. Bu çalışma, pHGG hücrelerini ve glutamaterjik nöronları birlikte kültleyen bir in vitro modelin gelişimini göstermektedir ve bu etkileşimleri taklit etmek için elektrofizyolojik etkileşimlerini kaydetmektedir.

Özet

Pediatrik yüksek dereceli gliomalar (pHGG), hızlı bir dismal prognoz taşıyan çocukluk ve ergen beyin kanserlerini temsil eder. Mevcut tedavilere karşı direncin üstesinden gelmeye ve yeni bir tedavi yöntemi bulmaya ihtiyaç olduğundan, yeni ilaçları ve terapötik prosedürleri test etmek için in vitro bir ortamda hastalığı mümkün olduğunca yakın modellemek oldukça zorludur. Glutamaterjik nöron hiperexcitability de dahil olmak üzere temel patobiyolojik süreçlerini incelemek, çevresel beyin ve pHGG hücreleri arasındaki etkileşimleri anlamada gerçek bir ilerleme olacaktır. Bu nedenle, nöronları / pHGG hücre etkileşimlerini yeniden oluşturmak için, bu çalışma, insan kaynaklı Pluripotent Stem (hiPS) türevi kortikal glutamaterjik nöronlar pHGG hücrelerini bölümlere ayrılmış mikroakışkan cihazlara ve elektrofizyolojik modifikasyonlarını kaydetmek için bir süreç haline getirerek fonksiyonel bir in vitro modelin gelişimini göstermektedir. İlk adım, insan glutamaterjik nöronlarını ayırt etmek ve karakterize etmekti. İkinci olarak, hücreler pHGG türevi hücre hatlarına sahip mikroakışkan cihazlarda kültürlendi. Daha sonra pHGG hücrelerinin bu mikro çevresel nöronlar üzerindeki elektriksel etkisini analiz etmek için beyin mikroçevriciliği ve nöronal aktivitesi bu modele dahil edildi. Elektrofizyolojik kayıtlar, fizyolojik koşulları taklit etmek ve tüm sinir ağının elektriksel aktivitesini kaydetmek için bu mikroakışkan cihazlara multielektrod dizileri (MEA) kullanılarak birleştirilmiştir. Tümör hücrelerinin varlığında nöron ekssitability'de önemli bir artış olduğunun altı çizildi.

Giriş

Pediatrik yüksek dereceli gliomalar (pHGG), hasta yaşına, tümör anatomik konumuna ve uzantısına ve moleküler sürücülere bağlı olarak genişletilmiş genotipik ve fenotipik çeşitlilik ^sergiler1. Şu anda mevcut tedavi seçenekleri ile kötü kontrol edilen agresif beyin tümörleridir ve çocuk ve ergenlerde beyin kanserleri ile ilgili önde gelen ölüm ^nedenidir2. Yani, hastaların% 80'inden fazlası teşhislerinden sonraki 2 yıl içinde nüks ediyor ve beyin konumlarına ve sürücü mutasyonlarına bağlı olarak ortanca sağkalımları 9-15 aydır. İyileştirici tedavinin olmaması laboratuvar araştırmaları için birincil dürtüdür ve yeni yenilikçi terapötik yaklaşımlara olan acil ihtiyacı vurgulamaktadır. Bu amaçla, hasta kaynaklı hücre hatları (PDCL), pHGG ^{çeşitliliğinin üç} boyutlu (2D) çizgilerde ve/veya üç boyutlu (3D) nörosferlerde sağlanması umuduyla geliştirilmiştir. Bununla birlikte, hasta kaynaklı in vitro hücre kültürleri tüm beyin değişken durumlarını taklit etmez. Bu modeller tipik olarak pHGG'de tanımlanan makroskopik ve mikroskobik nöro-anatomik ortamları dikkate almaz.

Genellikle, küçük çocuklarda pHGG esas olarak pontin ve talamik bölgelerde gelişirken, ergen ve genç yetişkinin HGG'si kortikal alanlarda, özellikle frontotemporal loblarda ^{yoğunlaşmak1}. Pediatrik yaşlardaki bu konum özellikleri gliomageneze yol açan farklı ortamları ve tümör hücreleri ile spesifik nöronal aktivite arasında karmaşık bir ağı içeriyor gibi görünmektedir4,5,6. Mekanizmalar hala tanımlanmasa da, pHGG esas olarak astroglial ve oligodendroglial soyların farklılaşma yörüngesi boyunca sinirsel öncül hücrelerden gelişir. Bu glial soyların rolü uzun zamandır nöronlar için basit yapısal destekle sınırlı olsa da, artık tamamen sinir devrelerine entegre oldukları ve beynin yapısal bölgelerini yeniden düzenleyebilen ve nöronal devreleri yeniden şekillendirebilen karmaşık çift yönlü glial-nöronal etkileşimler sergiledikleri açıkça belirlenmiştir4,7,8 . Ayrıca, artan kanıt kırıntıları, merkezi sinir sisteminin (CNS) beyin kanserinin başlatılmasında ve ilerlemesinde kritik bir rol oynadığını göstermektedir. Son çalışmalar, salgılanan büyüme faktörleri ve doğrudan elektrokimyasal sinaptik iletişim yoluyla glial malignitelerin büyümesini ve mitozini yönlendiren nöronal aktiviteye ^{odaklanmıştır6,9}. Karşılıklı olarak, yüksek dereceli glioma hücreleri artan glutamaterjik nöronal aktivite ile nöronal fonksiyonu etkiliyor ve yapısal ve elektriksel olarak entegre oldukları devrelerin çalışmasını modüle ediyor ^{gibi görünmektedir9}. Bu nedenle, nöron eylemini kontrol eden hasta kaynaklı modeller ve yeni sinirbilim araçları kullanılarak yapılan çalışmalar, nöronal aktivitenin glioma konumu, büyümesi ve ilerlemesi üzerinde devreye özgü bir etkisini göstermiştir. Gliomalarda yer alan bu nöronal projeksiyonların çoğu glutamaterjiktir ve glutamat salgıları yoluyla iletişim kurar. mGluR2 veya vGlut1/2 gibi spesifik glutamaterjik biyobelirteçler yaygın olarak ^{tanımlanır6}.

İlginçtir ki, moleküler heterojenliklerine rağmen, pediatrik ve erişkin yüksek dereceli gliomalar glutamaterjik nöronal aktiviteye ve nöroligin-3 veya BDNF (beyin kaynaklı nörotrofik faktör) gibi diğer salgılanan faktörlere tipik bir proliferatif yanıt göstermektedir 4,6,10,11,12,13 . Kortikal bölgelerde pediatrik ve erişkin HGG'ler artan glutamat salgılanması yoluyla nöronal hiperexcitability'e neden olabilir ve epileptik ağ aktivitesi ile ilişkili gliomalara yol açan GABA internöronlarını inhibe ^{edebilir14,15}. Bunun da ayrıca, nöral devreler gliomalar tarafından belirli nörolojik görevleri, örneğin dili iterek yeniden şekillendirilebilir ve ek organize nöronal aktivite talep ^edebilir9.

Bu gerekçeye dayanarak, glioma hücreleri ve nöronlar arasındaki çift yönlü iletişimin anlaşılmasının ilerletilmesi, in vitro pHGG yaklaşımlarının erken aşamaları ile tam olarak aydınlatılmalı ve entegre edilmelidir. Bu tür yenilikçi modelleme, ilaç testi sırasında nöronal elektriksel aktivite etkisini anlama ve ölçmede ve beyin devrelerine pHGG yanıtını tahmin etmede çok önemlidir. Mikroakışkan cihazlar ve pHGG araştırma çalışmaları gibi nörobilim araçlarındaki son gelişmeler, yeni modelleme yaklaşımları geliştirmek ve artık beyin mikroçevrimini in vitro pHGG modellerine entegre edebilmek için yataktır3,16,17,18,19. Multielektrod dizileri (MEA) kullanan elektrofizyolojik kayıtlarla birleştiğinde, mikroakışkan cihazlar20,21,22, tüm sinir ağının elektriksel aktivitesini kaydederken fizyolojik koşulları taklit etme ve çeşitli koşullar altında ağ bağlantı parametrelerini çıkarma imkanı sunar. Bu ^cihaz23,24, önce hücrelerin doğrudan MEA'da bir odada hassas bir şekilde birikmesini sağlar. Bu teknoloji, MEA'daki hücre tohumlama yoğunluğunun ve homojenliğinin kontrolünü ve insan sinir progenitörlerinin doğrudan cihazlara farklılaşması için kritik bir adım olan medya değişiminin ince kontrolünü sağlar. Ayrıca, mevcut biriktirme odası farklı zaman noktalarında birden fazla hücre ile tohumlanabilir.

Bu nedenle, bu çalışma, insan Pluripotent Stem (hiPS) türevi kortikal glutamaterjik nöronları ve pHGG türevi hücreleri mikroakışkan cihazlara eş-kültleyen ve her iki hücre popülasyonu arasındaki elektriksel etkileşimleri değerlendirmek için elektriksel aktivitelerini kaydeden fonksiyonel bir in vitro model geliştirmeyi amaçlamıştır. İlk olarak, hiPS türevi kortikal glutamaterjik nöronlar, kültürün farklı aşamalarında mikroakışkan cihazlarda [gün 4 (D4), hiPS hücreleri olarak ve 21. Ortak kültürün ikinci adımı için iki pHGG modeli kullanıldı: H3.3 K27M sürücü mutasyonu taşıyan bir hasta tümöründen (BT35)³ başlatılan ticarileştirilmiş pediatrik UW479 hattı ve pHGG hücreleri. Son olarak, pHGG hücre tohumlamadan önce D21'de glutamaterjik hücrelerin elektrofizyolojik kayıtlarını ve aynı mikroakışkan cihaza 48 saat birlikte kültürden sonra D23'ü gerçekleştirdik. Glutamaterjik nöronlar ve pHGG hücreleri arasındaki etkileşimler, kaydedilen elektrofizyolojik aktivitede önemli bir artış ile karakterize edildi.

Protokol

Bu protokol için insan malzemelerinin kullanımı ile ilgili akreditasyon numarası DC-2020-4203'tür.

1. Mikroakışkan cihaz imalatı, hazırlanması ve tedavisi

1. Geleneksel fotolithografi tekniklerini kullanarak SU-8 kalıpları ^üretin18.
   NOT: Bu amaçla, iki fotolithografi maskesi, silikon gofret substratı üzerinde iki fotoresist yapı katmanı ve SU-8 2100'de (200 μm yüksekliğinde) yapılan ana kanalların deseni altında asimetrik mikrogroovları tanımlayan ince bir SU-8 2005 fotoresist katmanı (3,2 μm yüksekliğinde ve 6 ± 1 μm genişliğinde) oluşturmak için tasarlanmıştır. 1 mm genişliğinde, ve 13 mm uzunluğunda) (bkz. Ek Şekil S1).
2. 1 dakika boyunca bir plazma temizleyici (5.00e-1 torr, yüksek radyo frekansı (RF) seviyesi) kullanarak gofreti etkinleştirin ve alüminyum bir klasörde 30 dakika boyunca bir desiccator içine 1 mL (trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane kullanarak silenize edin.
3. 10:1 polidimetilsiloksisan (PDMS) oranı hazırlayın, prepolimeri katalizörle karıştırın, sıkışmış kabarcıkları çıkarmak için vakumlu bir kurutucuya geçirin ve 40 dakika boyunca 80 ° C'de bir fırında kürlenmeden önce yavaşça kalıba atın.
4. Bundan sonra kalıbı soymadan önce istenen boyutta bir jilet kullanarak kesin. 3 mm genişliğinde delikler elde etmek için girişi ve çıkış bölgelerini delin, PDMS'yi temizleyin ve yapışkan bant kullanarak koruyun.
   NOT: Son PDMS cihazının kalınlığı yaklaşık 5 mm'dir.
5. Cihazı bir plazma temizleyici (5.00e-1 torr, ¹ dakika boyunca Yüksek RF seviyesi) kullanarak tedavi edin, bir polistiren Petri kabı ile monte edin ve vakumun UV ışığı altında 30 dakika boyunca maruz bırakılın.
6. %70 etanol kullanmadan önce mikroakışkan cihazın giriş kısmını pipetle doldurun ve pipet aspirasyonu ile boşaltın.
7. Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS) giriş rezervuarlarını ekleyerek mikroakışkan cihazı yıkayın ve aspirasyonu art arda üç kez pipetleyarak boşaltın.
8. Cihazı 0,05 mg/mL Poli-D-Lizin kullanarak kaplayıp bir inkübatöre (%37 °C, %5 _CO2) yerleştirin. 24 saat sonra, cihazı giriş haznesine nörobakal ortamı ekleyerek durulayın ve aspirasyonu art arda üç kez pipetleyarak boşaltın.
9. Mikroakışkan çipi hücre kültürü ortamıyla doldurun ve maksimum 2 saat kullanıma kadar oda sıcaklığında kalmasını kesin.

2. Mikroakışkan cihazda hücre hazırlama ve tohumlama

1. İnsan hiPS türevi kortikal glutamaterjik nöronların kültürü, tohumlanması ve immünofluoresan karakterizasyonu
   NOT: Ticarileştirilmiş hiPS türevi kortikal glutamaterjik nöronlar (Şekil 1A). İnsan kaynaklı malzemeleri koruyun ve bunları onay ile ve mevzuat kuralları çerçevesinde ele alın.
   1. Mikroakışkan cihazın giriş ve çıkış rezervuarlarını tohumlamadan önce pipet aspirasyonu ile boşaltın, böylece sadece cihazın kanalları orta ile doldurulur.
   2. HiPS hücrelerini, kompozisyonu Tablo 1'de verilen ortamla birlikte 6,5 x ¹⁰⁶ hiPS hücre/mL süspansiyonun 10 μL'si (örneğin, 900 hücre/^mm2 konsantrasyonu) koyarak 0.Gün'de (D0) tohumlayın ve hücrelerin takılmasını sağlamak için cihazın 15 dakika boyunca kaputun altında (oda sıcaklığında) olmasını kesin.
   3. 15 dakika sonra, hem giriş hem de çıkış rezervuarlarını, tüm bileşimi Tablo 1'de verilen 50 μL D4 kültür ortamı ile doldurun ve cihazı inkübatöre aktarın (%37 °C, %5 _CO2).
   4. Glutamaterjik nöron farklılığını kontrollü bir ortamda (%37 °C, %5 CO2) ve bileşimi Tablo 1'de açıklanan belirli bir hücre kültürü ortamı ile ₂₃ gün boyunca koruyun (Şekil 1A(1), mikroskopi). Ortamı bir sonraki adım 5'te ayrıntılı olarak belirtildiği gibi düzenli olarak değiştirin. hemen aşağıda ve Şekil 1B'deki gibi adımları izleyin.
   5. Tablo 1 kompozisyonunu izleyen her 3 ila 4 günde bir ortamı değiştirin. D4'e kadar tohumlama ortamı, D7'ye kadar D4 ortamı, D11'e kadar D7 ortamı ve kültürün kalan süresi için D11 ortamını kullanın.
   6. Hücre canlılığını değerlendirmek ve hücre sayımına izin vermek için standart faz kontrastlı mikroskop kullanarak D4, D21 ve D23'te mikroskobik fotoğraflar çekin.
   7. Karakterizasyon için, farklılaştırılmış glutamaterjik nöronları orta aspirasyondan sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehitte (PFA) sabitlayın ve immünoresans boyama protokolünü izleyin.
   8. Hücreleri Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile üç kez yıkayın ve %0,1 Triton-X ile 10 dakika, ardından %3 Sığır Serum Albümin (BSA) ile 30 dakika permeabilize edin. Birincil antikorları ekleyin ve cihazı 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
   9. Hücreleri PBS ile üç kez durulayın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca karşılık gelen ikincil antikorlarla daha fazla kuluçkaya yatırın.
      NOT: Çalışmada kullanılan immünofluoresan antikorlar Tablo 2'de listelenmiştir.
   10. Hücreleri PBS ile üç kez durulayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DAPI (4',6-diamino-2-fenylindole) ile karşıt çizgi.
   11. CMOS (Tamamlayıcı metal-oksit-yarı iletken) kamera ile donatılmış ters epifluoresans mikroskobu ile görüntüler elde edin ve uygun görüntü analiz yazılımını kullanarak analiz edin.
   12. DAPI lekeli görüntüleri açın ve yazılımdaki eşik yordamıyla binarize edin. Bunu yapmak için , Görüntü > > Eşiğini Ayarla'yı tıklatın ve çekirdeği arka plandan ayırmak için uygun parametreleri ayarlayın. Ardından, toplam çekirdeği bölmek için > İşlem uygula > Su Havzası'na tıklayın.
   13. Bundan sonra, ikili görüntüleri yorumlamak için Parçacıkları Analiz Et yazılımının işlevini kullanın. Bunu yapmak için, Analiz et'e ve ardından Parçacıkları Analiz Et'e tıklayın ve bundan sonra uygun parametreleri ayarlayın: boyut ve döngüsellik filtresi (7 μm'den küçük, 20 μm'den büyük veya 0,1 μm'den küçük bir döngüselliğe sahip analiz nesnelerinden hariç tutun).
   14. Doğru boyamayı doğrulamak için DAPI analizinden elde edilen kontur görüntülerini muhabir immünofluoresan resimlerle birleştirin.
   15. Son olarak, farklı biyobelirteçler için ilişkili verileri (nesne sayısı, ortalama alan, kapsama alanı yüzdesi vb.) kaydedin ve uygun niceleme yazılımını kullanarak D4 ve/veya D21'deki ifadeyi ölçün.
2. Ticarileştirilmiş pHGG hattı, UW479 ve hasta türevi hücre hattının hücre kültürü, ^BT353
   1. DMEM/F-12 GlutaMAX'teki her iki hücre hattını da bir hücre kültürü şişesinde %10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile desteklenerek kültür edin. Şekil 1C'de sunulduğu gibi her hücre hattının %80 birleştiği yer için bekleyin.
   2. Deneyler boyunca bu pHGG hücrelerini 37 °C'de kontrollü bir ortamda normoksik koşullarda muhafaza edin.

3. Ortak kültür protokolü

1. UW479 ve BT35 hücre hatları için tohumlama gününü ve konsantrasyonu, birlikte kültürün başlaması gerektiğinde, glutamaterjik nöronlar için 21 günlük kültüre karşılık gelen konfüçyüs hücrelerinin% 80'ine ulaşacak şekilde ayarlayın.
2. Trypsinize UW479 ve BT35 hücrelerini deneyin ve pHGG hücrelerini olgun glutamaterjik nöronlar içeren mikroakışkan cihaza tohumlamadan önce her özel mikroakışkan cihazda (her hücre tipi için 900 hücre / ^mm2 hedef yoğunluğu ile) glutamaterjik nöronların üstüne tohumlayın.
3. Tablo 1'de ayrıntılı olarak açıklanan glutamaterjik nöron D11 ve ileriye dönük ortam ile ortak kültürleri kontrollü bir ortamda (%37 °C, %5 _{CO2) 2} gün boyunca koruyun.
4. Canlılıklarını değerlendirmek için bir görüntü analiz yazılımı ile analiz edilen mikroskobik resimleri kullanarak pHGG hücrelerini sayın. Hücrelerin yüzdesini hesaplayın.
   NOT: Aşağıdaki formülü kullanın: 100 - ((D23'teki hücre sayısı / D21'deki hücre sayısı) x 100).

4. Elektrofizyolojik kayıt

1. Elektrofizyolojik kaydı ticari bir sistem ve piyasada bulunan bir yazılımla gerçekleştirin.
   NOT: Deneyler, 100 μm aralıklı 30 μm çapında elektrotlardan oluşan bir MEA ile gerçekleştirildi.
2. PHGG hücrelerinin tohumlanmadan önce D21'de glutamaterjik nöronlar üzerinde ilk elektrofizyolojik kaydı gerçekleştirin. Farklılaştırılmış glutamaterjik nöronları kontrol olarak kullanın ve ortak kültüre paralel olarak tek başına kültür edin. 3 numaralı sonraki adımda açıklandığı gibi her iki koşul için de ikinci bir kayıt yapın.
3. D23'te ikinci bir elektrofizyolojik kayıt gerçekleştirin (2 günlük ortak kültürden sonra).

5. Elektrofizyolojik veri işleme

1. Ham verileri 2^. sıra Band-pass Butterworth filtresiyle filtreleyin (100 Hz ve 2500 Hz passband frekanslarıyla).
2. Ani algılama için, sinyalin kök ortalama karesini her elektrot için 10 dakikalık kayıt üzerinden hesaplayın ve bu kök ortalamanın kare değerinin sekiz katına karşılık gelen bir genlik eşiği ayarlayın.
3. Bir eylem potansiyeli için en fazla 2 ms süre göz önünde bulundurarak bir TSSB (Precision Timing Spike ^Detection25) algoritması uygulayın.
4. Aktif bir elektrot olarak düşünün, her elektrot en az 5 çivi / dk algılar. Kayıt elektrotlarının en az %10'u aktifse teste devam edin.
5. Her aktif elektrodun ortalama atış hızını hesaplamak için algılanan ani artışların sayısını kayıt süresine bölün. Her bağımsız deney için ortalama atış hızını hesaplayın. Sonuçta, bir ortalamayı koşula göre hesaplayın (±SEM) ve kayıt gününde bir işlev olarak ifade edin.
6. Zamanın bir işlevi olarak her etkin elektrot için algılanan olayları temsil eden her deneme için bir raster çizimi hesaplayın. Ardından, tüm aktif elektrotların zamansal dizi çapındaki ateşleme hızlarını (veya anlık ateşleme hızlarını) hesaplayarak sinir ağı aktivitesinin eşzamanlılığını izlemeyi sağlar.
7. Son olarak, nicelik yazılımını kullanarak çubuk grafikler oluşturun ve Kruskal Wallis testlerini kullanarak karşılaştırmalar yapın.

Sonuçlar

Glutamaterjik nöronlar ve glioma hücreleri arasındaki elektriksel etkileşimleri incelemeden önce, hiPS türevi kortikal glutamaterjik nöronlar mikroakışkan cihazlarda kültlemenin fizibilitesini doğrulamak için karakterize edildi (Şekil 1A). Karakterizasyonları Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotropik Glutamat Reseptörleri 2) ve Şekil 1A(2-7)'de temsil edilen vGLUT1 immünostaining kullanılarak değerlendirildi...

Tartışmalar

Bu çalışma, mikroakışkan cihazlarda insan hiPS türevi kortikal glutamaterjik nöronlar ve beyin tümöral hücreleri arasındaki etkileşimi değerlendirmek için doğru bir fonksiyonel in vitro modeli açıklamaktadır. Mevcut protokoldeki önemli adımlardan biri, Nestin ve Sox2 immünofluoresan lekelenmenin azalması ve mGluR2 ve vGLUT1 lekelemenin eşzamanlı görünümü ile doğrulanan glutamaterjik nöronlardaki hiPS farklılaşmasıydı. Bununla birlikte, glutaterjik hücrelerin sadece yarısı het...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
256MEA100/30iR-ITO-w/o	MCS	256MEA100/30iR-ITO-w/o
40 µm probe for Scepter counter	Dutscher	53750
60 µm probe for Scepter counter	Dutscher	51999
Accutase	Sigma	A6964
Ala -Gln (GlutaMAX)	Sigma	G8541
Axel Observer 7 Microscope	Zeiss	431007-9904-000
Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon®	Dutscher	353109
Class II Biological Safety Cabinet	Thermo Scientific	HERASafe type KS12
Colibri 7 LED	Zeiss	4230529710-000
Cortical Glutamatergic Neurons	BrainXell	BX-0300
DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX	Gibco	31331-028
DMEM/F12 Medium	Sigma	D8437
DPBS 1X	Dutscher	L0615-500
EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3	Nunc	156499
Foetal Bovine Serum (FBS)	Dutscher	500105
GDNF	Peprotech	450-10
Geltrex	Life Technologies	A1413201
Human BDNF	Peprotech	450-02
Incubator	Memmert	IC0150med
MCS InterFace Boarder	MCS	181205-MEA2100-11240
MEA2100	MCS	181205-MEA2100-11240
Micropipette P10	Sartorius	LH-729020
Micropipette P100	Sartorius	LH-729050
Micropipette P1000	Sartorius	LH-729070
Micropipette P200	Sartorius	LH-729060
Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock	Dutscher	33290
MultiChannel Experimenter	MCS	-
N2 Supplement-A	StemCell	7152
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
Neurocult SM1 neuronal supplement	StemCell	5711
Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	030570ACL
Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	032260CL
Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	134760CL
Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine	Dutscher	X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity	Drummond	4000202/4038202
Pipette for cell culture 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
Pipette for cell culture 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
Plaque chauffante (CultureTemp)	Belart	370151000
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Primovert microscope	Zeiss	415510-1100-000
Scepter (Handheld Automated Cell Counter)	Millipore	PHCC00000
TGF-β1	Peprotech	100-21C
Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352096
Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352070