Kokultur von glutamatergen Neuronen und pädiatrischen hochgradigen Gliomzellen in mikrofluidische Geräte zur Beurteilung elektrischer Wechselwirkungen

Zusammenfassung

Neuere Arbeiten decken die neuronalen Auswirkungen auf hochgradige pädiatrische Gliomzellen (pHGG) und ihre wechselseitigen Interaktionen auf. Die vorliegende Arbeit zeigt die Entwicklung eines In-vitro-Modells , das pHGG-Zellen und glutamaterge Neuronen kokulturiert und ihre elektrophysiologischen Interaktionen aufzeichnet, um diese Wechselwirkungen nachzuahmen.

Zusammenfassung

Pädiatrische hochgradige Gliome (pHGG) repräsentieren Hirntumore im Kindes- und Jugendalter, die eine schnelle düstere Prognose haben. Da es notwendig ist, die Resistenz gegen aktuelle Behandlungen zu überwinden und einen neuen Weg der Heilung zu finden, ist es sehr anspruchsvoll, die Krankheit in einem In-vitro-Setting so nah wie möglich zu modellieren, um neue Medikamente und therapeutische Verfahren zu testen. Die Untersuchung ihrer grundlegenden pathologischen Prozesse, einschließlich der Übererregbarkeit von glutamatergen Neuronen, wird ein echter Fortschritt beim Verständnis der Wechselwirkungen zwischen dem Umweltgehirn und den pHGG-Zellen sein. Um Neuronen/ pHGG-Zellinteraktionen nachzubilden, zeigt diese Arbeit die Entwicklung eines funktionellen In-vitro-Modells , das human-induzierte pluripotente Stamm (hiPS) -abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen pHGG-Zellen in kompartimentierte mikrofluidische Geräte und einen Prozess zur Aufzeichnung ihrer elektrophysiologischen Modifikationen kokulturiert. Der erste Schritt bestand darin, menschliche glutamaterge Neuronen zu differenzieren und zu charakterisieren. Zweitens wurden die Zellen in mikrofluidischen Geräten mit pHGG-abgeleiteten Zelllinien kultiviert. Die Mikroumgebung des Gehirns und die neuronale Aktivität wurden dann in dieses Modell einbezogen, um die elektrischen Auswirkungen von pHGG-Zellen auf diese Mikroumgebungsneuronen zu analysieren. Elektrophysiologische Aufzeichnungen werden unter Verwendung von Multielektrodenarrays (MEA) an diese mikrofluidischen Geräte gekoppelt, um physiologische Bedingungen nachzuahmen und die elektrische Aktivität des gesamten neuronalen Netzwerks aufzuzeichnen. Eine signifikante Erhöhung der Neuronenerregbarkeit wurde in Gegenwart von Tumorzellen unterstrichen.

Einleitung

Pädiatrische hochgradige Gliome (pHGG) weisen eine erweiterte genotypische und phänotypische Vielfalt auf, abhängig vom Alter des Patienten, der anatomischen Lage und Erweiterung des Tumors sowie den molekularen ^Treibern1. Es handelt sich um aggressive Hirntumore, die mit den derzeit verfügbaren Behandlungsmöglichkeiten schlecht kontrolliert werden und die häufigste Todesursache im Zusammenhang mit Hirntumoren bei Kindern und Jugendlichen ^sind2. So erleiden mehr als 80% der Patienten innerhalb von 2 Jahren nach ihrer Diagnose einen Rückfall, und ihr medianes Überleben beträgt 9-15 Monate, abhängig von Gehirnstandorten und Treibermutationen. Das Fehlen einer kurativen Behandlung ist der primäre Drang zur Laborforschung und unterstreicht den unmittelbaren Bedarf an neuen innovativen Therapieansätzen. Zu diesem Zweck wurden patientenabgeleitete Zelllinien (PDCL) mit der Hoffnung entwickelt, die pHGG-Diversität3 in zweidimensionalen (2D) Linien und/oder dreidimensionalen (3D) Neurosphären bereitzustellen. Dennoch ahmen diese von Patienten abgeleiteten In-vitro-Zellkulturen nicht alle variablen Situationen des Gehirns nach. Diese Modelle berücksichtigen nicht die makroskopischen und mikroskopischen neuroanatomischen Umgebungen, die typischerweise in pHGG beschrieben werden.

Normalerweise entwickelt sich pHGG bei jüngeren Kindern hauptsächlich in pontinen und thalamischen Regionen, während sich das HGG von Jugendlichen und jungen Erwachsenen in den kortikalen Bereichen konzentriert, insbesondere in frontotemporalen ^Lappen1. Diese Standortspezifitäten im pädiatrischen Alter scheinen verschiedene Umgebungen zu umfassen, die zu Gliomagenese und einem sich verbindenden Netzwerk zwischen Tumorzellen und spezifischer neuronaler Aktivität ^führen4,5,6. Obwohl Mechanismen noch nicht identifiziert sind, entwickelt sich pHGG hauptsächlich aus neuronalen Vorläuferzellen entlang der Differenzierungsbahn von astroglialen und oligodendroglialen Linien. Während die Rolle dieser Glialinien lange Zeit auf einfache strukturelle Unterstützung für Neuronen beschränkt war, ist es jetzt klar erwiesen, dass sie sich vollständig in neuronale Schaltkreise integrieren und komplexe bidirektionale glia-neuronale Interaktionen aufweisen, die in der Lage sind, strukturelle Regionen des Gehirns zu reorganisieren und neuronale Schaltkreise umzugestalten4,7,8 . Darüber hinaus deuten zunehmende Fetzen von Beweisen darauf hin, dass das zentrale Nervensystem (ZNS) eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und progression von Hirntumoren spielt. Jüngste Arbeiten konzentrierten sich auf neuronale Aktivität, die das Wachstum und die Mitose von glialen Malignomen durch sezernierte Wachstumsfaktoren und direkte elektrochemische synaptische Kommunikation ^{anzutreiben scheint6,9}. Reziprok umgekehrt scheinen hochgradige Gliomzellen die neuronale Funktion mit zunehmender glutamaterger neuronaler Aktivität zu beeinflussen und modulieren den Betrieb der Schaltkreise, in die sie strukturell und elektrisch integriert ^sind9. Studien, die von Patienten abgeleitete Modelle und neuartige neurowissenschaftliche Werkzeuge zur Kontrolle der Neuronenwirkung verwendeten, zeigten eine schaltkreisspezifische Wirkung der neuronalen Aktivität auf die Lage, das Wachstum und die Progression von Gliomen. Die meisten dieser neuronalen Projektionen, die an Gliomen beteiligt sind, sind glutamaterg und kommunizieren über Glutamatsekretionen. Spezifische glutamaterge Biomarker wie mGluR2 oder vGlut1/2 werden häufig ^beschrieben6.

Interessanterweise zeigen pädiatrische und adulte hochgradige Gliome trotz ihrer molekularen Heterogenität eine typische proliferative Reaktion auf glutamaterge neuronale Aktivität und andere sezernierte Faktoren wie Neuroligin-3 oder BDNF (brain-derived neurotrophic factor)4,6,10,11,12,13 . In kortikalen Regionen können pädiatrische und erwachsene HGGs durch eine erhöhte Glutamatsekretion neuronale Übererregbarkeit induzieren und GABA-Interneuronen hemmen, was zu Gliomen führt, die mit epileptischer Netzwerkaktivität assoziiert ^sind14,15. Darüber hinaus können neuronale Schaltkreise durch Gliome, die bestimmte neurologische Aufgaben, z. B. Sprache, vorantreiben, umgestaltet werden und zusätzliche organisierte neuronale Aktivitäten ^erfordern9.

Basierend auf dieser Begründung muss das Verständnis der bidirektionalen Kommunikation zwischen Gliomzellen und Neuronen vollständig aufgeklärt und in die frühen Stadien der In-vitro-pHGG-Ansätze integriert werden. Eine solche innovative Modellierung ist entscheidend für das Verständnis und die Messung der Auswirkungen der neuronalen elektrischen Aktivität während des Drogentests und die Antizipation der pHGG-Reaktion in die Schaltkreise des Gehirns. Jüngste Entwicklungen in neurowissenschaftlichen Werkzeugen, wie mikrofluidische Geräte und pHGG-Forschungsarbeiten, sind das Fundament, um neue Modellierungsansätze zu entwickeln und nun in der Lage zu sein, die Mikroumgebung des Gehirns in In-vitro-pHGG-Modelle zu integrieren3,16,17,18,19. Gekoppelt mit elektrophysiologischen Aufzeichnungen unter Verwendung von Multielektrodenarrays (MEA) bieten mikrofluidische Bauelemente20,21,22 die Möglichkeit^, physiologische Bedingungen nachzuahmen, während die elektrische Aktivität des gesamten neuronalen Netzwerks aufgezeichnet und Netzwerkkonnektivitätsparameter unter verschiedenen Bedingungen extrahiert werden. Dieses ^Gerät23,24 ermöglicht zunächst die präzise Abscheidung von Zellen in einer Kammer direkt auf MEA. Diese Technologie ermöglicht die Kontrolle der Zellsaatdichte und -homogenität auf MEA und die Feinsteuerung des Medienaustauschs, was ein kritischer Schritt für die Differenzierung des menschlichen neuronalen Vorläufers direkt in Geräte ist. Darüber hinaus kann die vorliegende Abscheidungskammer mit mehreren Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten ausgesät werden.

Daher zielte diese Studie darauf ab, ein funktionelles In-vitro-Modell zu entwickeln, das menschliche pluripotente Stamm (hiPS) -abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen und pHGG-abgeleitete Zellen in mikrofluidische Geräte kokulturiert und ihre elektrische Aktivität aufzeichnet, um elektrische Wechselwirkungen zwischen beiden Zellpopulationen zu bewerten. Zuerst wurden hiPS-abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen in mikrofluidischen Geräten in verschiedenen Stadien der Kultur [Tag 4 (D4) als hiPS-Zellen und Tag 21 (D21) und Tag 23 (D23) als glutamaterge gereifte Neuronen] erhalten und charakterisiert. Für den zweiten Schritt der Kokultur wurden zwei pHGG-Modelle verwendet: kommerzialisierte pädiatrische UW479-Linie und pHGG-Zellen, die von einem Patiententumor (BT35)³ initiiert wurden, der eine H3.3 K27M-Treibermutation trug. Schließlich führten wir elektrophysiologische Aufnahmen von glutamatergen Zellen bei D21 vor der pHGG-Zellaussaat und D23 nach 48 h Kokultur in dasselbe mikrofluidische Gerät durch. Die Wechselwirkungen zwischen glutamatergen Neuronen und pHGG-Zellen waren durch einen signifikanten Anstieg der aufgezeichneten elektrophysiologischen Aktivität gekennzeichnet.

Protokoll

Für dieses Protokoll lautet die Akkreditierungsnummer für die Verwendung menschlicher Materialien DC-2020-4203.

1. Herstellung, Herstellung und Behandlung mikrofluidischer Geräte

1. Herstellung von SU-8-Formen mit herkömmlichen ^{Photolithographietechniken18}.
   HINWEIS: Zu diesem Zweck wurden zwei Photolithographiemasken entwickelt, um zwei Schichten von Fotolackstrukturen auf Siliziumwafersubstrat und eine dünne SU-8 2005-Fotolackschicht (3,2 μm hoch und 6 ± 1 μm breit) zu konstruieren, die asymmetrische Mikronebel unter der Strukturierung von Hauptkanälen definiert, die in SU-8 2100 (200 μm hoch, 1 mm breit, und 13 mm lang) (siehe ergänzende Abbildung S1).
2. Aktivieren Sie den Wafer unter Verwendung eines Plasmareinigers (5,00e-1 torr, Hochradiofrequenz (RF) für 1 min und silanisieren Sie ihn mit 1 ml (Trichlor (1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan in einem Aluminiumordner zu einem Exsikkator für 30 min.
3. Bereiten Sie ein 10: 1-Verhältnis von Polydimethylsiloxan (PDMS) vor, mischen Sie das Prepolymer mit Katalysator, geben Sie es in einen Vakuum-Exsikkator, um eingeschlossene Blasen zu entfernen, und gießen Sie es langsam auf die Form, bevor es in einem Ofen bei 80 ° C für 40 min ausgehärtet wird.
4. Schneiden Sie es danach mit einem Rasiermesser in der gewünschten Größe, bevor Sie die Form abziehen. Stanzen Sie die Einlass- und Auslasszonen aus, um 3 mm breite Löcher zu erhalten, reinigen Sie das PDMS und schützen Sie es mit Klebeband.
   HINWEIS: Die Dicke des endgültigen PDMS-Geräts beträgt ca. 5 mm.
5. Behandeln Sie das Gerät mit einem Plasmareiniger (5.00e-1 torr, hoher ^HF-Pegel während 1 min), montieren Sie es mit einer Polystyrol-Petrischale und setzen Sie das Vakuum 30 min unter UV-Licht aus.
6. Füllen Sie den Einlass des mikrofluidischen Geräts vor Gebrauch mit einer Pipette mit 70% Ethanol und entleeren Sie ihn durch Pipettieren der Aspiration.
7. Waschen Sie das mikrofluidische Gerät durch Zugabe von Einlassreservoirs Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) und entleeren Sie es, indem Sie die Aspiration dreimal hintereinander pipettieren.
8. Beschichten Sie das Gerät mit 0,05 mg/ml Poly-D-Lysin und legen Sie es in einen Inkubator (37 °C, 5% _CO2). Nach 24 h spülen Sie das Gerät aus, indem Sie das neurobasale Medium in das Einlassreservoir geben und es durch dreimal hintereinander pipettierende Aspiration entleeren.
9. Füllen Sie den mikrofluidischen Chip mit dem Zellkulturmedium und lassen Sie es bis zu einem Gebrauch für maximal 2 h bei Raumtemperatur stehen.

2. Zellvorbereitung und Aussaat im mikrofluidischen Gerät

1. Kultur, Seeding und immunfluoreszierende Charakterisierung menschlicher hiPS-abgeleiteter kortikaler glutamaterger Neuronen
   HINWEIS: Durchführung von Experimenten mit kommerzialisierten hiPS-abgeleiteten kortikalen glutamatergen Neuronen (Abbildung 1A). Bewahren Sie aus dem Menschen gewonnene Materialien und behandeln Sie sie mit der Genehmigung und nach den Richtlinien der Gesetzgebung.
   1. Entleeren Sie die Ein- und Auslassbehälter des mikrofluidischen Geräts vor dem Aussaaten durch Pipettenaspiration und lassen Sie nur die Kanäle des Geräts mit Medium füllen.
   2. Säen Sie die hiPS-Zellen an Tag 0 (D0) aus, indem Sie 10 μL einer 6,5 x ¹⁰⁶ hiPS-Zellen/ml-Suspension (z. B. 900 Zellen/^{mm2-Konzentration} ) mit dem Medium, dessen Zusammensetzung in Tabelle 1 angegeben ist, und lassen Sie das Gerät 15 Minuten lang unter der Haube (bei Raumtemperatur) sein, damit sich die Zellen anheften können.
   3. Füllen Sie nach 15 min sowohl die Einlass- als auch die Auslassbehälter mit 50 μL D4-Kulturmedium, dessen gesamte Zusammensetzung in Tabelle 1 angegeben ist, und geben Sie das Gerät in den Inkubator (37 °C, 5% _CO2).
   4. Aufrechterhaltung der glutamatergen Neuronendifferenzierung für 23 Tage (Abbildung 1A(1), Mikroskopie) unter kontrollierter Umgebung (37 °C, 5 % _CO2) und mit einem spezifischen Zellkulturmedium, dessen Zusammensetzung in Tabelle 1 beschrieben ist. Ersetzen Sie das Medium regelmäßig, wie im nächsten Schritt 5 beschrieben. direkt darunter, und führen Sie die Schritte wie in Abbildung 1B aus.
   5. Ersetzen Sie das Medium alle 3 bis 4 Tage nach Tabelle 1 Zusammensetzung. Verwenden Sie das Aussaatmedium bis D4, das Medium D4 bis D7, das Medium D7 bis D11 und das Medium D11 für die verbleibende Zeit der Kultur.
   6. Machen Sie mikroskopische Bilder an D4, D21 und D23 mit einem Standard-Phasenkontrastmikroskop, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen und die Zellzählung zu ermöglichen.
   7. Zur Charakterisierung fixieren Sie die differenzierten glutamatergen Neuronen in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bei Raumtemperatur nach mittlerer Aspiration und befolgen Sie das Protokoll für die Immunfluoreszenzfärbung.
   8. Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen und 10 min mit 0,1% Triton-X permeabilisieren, gefolgt von 30 min mit 3% Rinderserumalbumin (BSA). Fügen Sie primäre Antikörper hinzu und inkubieren Sie das Gerät über Nacht bei 4 °C.
   9. Spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS und inkubieren Sie weiter mit den entsprechenden sekundären Antikörpern für 2 h bei Raumtemperatur.
      ANMERKUNG: Die in der Studie verwendeten immunfluoreszierenden Antikörper sind in Tabelle 2 aufgeführt.
   10. Spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS ab und enthalten Sie sie mit DAPI (4',6-Diamino-2-phenylindol) für 10 min bei Raumtemperatur.
   11. Erfassen Sie Bilder mit einem inversen Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer CMOS-Kamera (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) ausgestattet ist, und analysieren Sie sie mit einer geeigneten Bildanalysesoftware.
   12. Öffnen Sie die DAPI-gefärbten Bilder und binarisieren Sie mit der Thresholding-Routine in der Software. Klicken Sie dazu auf Bild > > Schwellenwert anpassen und stellen Sie die entsprechenden Parameter ein, um den Kern vom Hintergrund zu unterscheiden. Klicken Sie dann auf Apply > Process > Watershed , um den aggregierten Kern zu teilen.
   13. Verwenden Sie anschließend die Funktion der angeborenen Software Analyze Particles , um die Binärbilder zu interpretieren. Klicken Sie dazu auf Analysieren und dann auf Partikel analysieren und legen Sie danach die entsprechenden Parameter fest: Größen - und Zirkularitätsfilter (Objekte kleiner als 7 μm, größer als 20 μm oder mit einer Zirkularität kleiner als 0,1 μm von der Analyse ausschließen).
   14. Führen Sie die aus der DAPI-Analyse erhaltenen Konturbilder mit entsprechenden Immunfluoreszenzbildern zusammen, um die korrekte Färbung zu validieren.
   15. Speichern Sie abschließend die zugehörigen Daten (Anzahl der Objekte, mittlere Fläche, % der Abdeckung usw.) für die verschiedenen Biomarker und quantifizieren Sie die Expression bei D4 und/oder D21 mit geeigneter Quantifizierungssoftware.
2. Zellkultur der kommerzialisierten pHGG-Linie, UW479, und der vom Patienten abgeleiteten Zelllinie ^BT353
   1. Kultur beider Zelllinien in DMEM/F-12 GlutaMAX ergänzt mit 10% Fetal Bovine Serum (FBS) in einem Zellkulturkolben. Warten Sie auf 80% Konfluenz jeder Zelllinie, wie in Abbildung 1C dargestellt.
   2. Halten Sie diese pHGG-Zellen während der gesamten Experimente unter einer kontrollierten Umgebung bei 37 °C unter normoxischen Bedingungen aufrecht.

3. Co-Culture-Protokoll

1. Passen Sie den Seeding-Tag und die Konzentration für UW479- und BT35-Zelllinien an, um 80% der konfluenten Zellen zu erreichen, wenn die Kokultur beginnen sollte, was 21 Tagen Kultur für glutamaterge Neuronen entspricht.
2. Trypsinisieren Sie UW479- und BT35-Zellen und säen Sie sie auf die Oberseite der glutamatergen Neuronen in jedem dedizierten mikrofluidischen Gerät (mit einer Zieldichte von 900 Zellen / ^mm2 für jeden Zelltyp), bevor Sie die pHGG-Zellen in das mikrofluidische Gerät säen, das gereifte glutamaterge Neuronen enthält.
3. Halten Sie die Co-Kulturen 2 Tage lang unter einer kontrollierten Umgebung (37 °C, 5% _CO2) mit dem glutamatergen Neuron D11 und dem in Tabelle 1 beschriebenen Medium weiter.
4. Zählen Sie pHGG-Zellen anhand der mikroskopischen Bilder, die mit einer Bildanalysesoftware analysiert wurden, um ihre Lebensfähigkeit zu beurteilen. Berechnen Sie den Prozentsatz der Zellen.
   HINWEIS: Verwenden Sie die folgende Formel: 100 - ((Anzahl der Zellen bei D23 / Anzahl der Zellen bei D21) x 100).

4. Elektrophysiologische Aufzeichnung

1. Führen Sie die elektrophysiologische Aufzeichnung mit einem kommerziellen System und handelsüblicher Software durch.
   HINWEIS: Die Experimente wurden mit einem MEA durchgeführt, das aus Elektroden mit einem Durchmesser von 30 μm im Abstand von 100 μm bestand.
2. Führen Sie eine erste elektrophysiologische Aufzeichnung an glutamatergen Neuronen bei D21 durch, bevor Sie pHGG-Zellen aussäen. Nutzen Sie die differenzierten glutamatergen Neuronen als Kontrolle und kultivieren Sie sie allein parallel zur Kokultur. Führen Sie eine zweite Aufzeichnung für beide Bedingungen durch, wie im nächsten Schritt mit der Nummer 3 beschrieben.
3. Führen Sie eine zweite elektrophysiologische Aufnahme bei D23 durch (nach 2 Tagen Kokultur).

5. Elektrophysiologische Datenverarbeitung

1. Filtern Sie die Rohdaten mit einem Bandpass-Butterworth-Filter 2^. Ordnung (mit Passbandfrequenzen von 100 Hz und 2500 Hz).
2. Berechnen Sie für die Spike-Erkennung das mittlere Quadrat des Signals über die 10-minütige Aufzeichnung für jede Elektrode und legen Sie einen Amplitudenschwellenwert fest, der dem Achtfachen des quadratischen Wertes dieses Mittelwerts entspricht.
3. Wenden Sie einen PTBS-Algorithmus (Precision Timing Spike ^Detection25) an und berücksichtigen Sie eine maximale Dauer von 2 ms für ein Aktionspotential.
4. Betrachten Sie als aktive Elektrode jede Elektrode, die mindestens 5 Spikes / min erkennt. Setzen Sie den Test fort, wenn mindestens 10% der Aufzeichnungselektroden aktiv sind.
5. Teilen Sie die Anzahl der erkannten Spitzen durch den Zeitraum der Aufzeichnung, um die mittlere Zündrate jeder aktiven Elektrode zu berechnen. Berechnen Sie eine durchschnittliche mittlere Feuerrate für jedes unabhängige Experiment. Berechnen Sie letztendlich einen Durchschnitt nach Bedingung (±SEM) und drücken Sie ihn als Funktion am Tag der Aufzeichnung aus.
6. Berechnen Sie ein Rasterdiagramm für jedes Experiment, das die für jede aktive Elektrode detektierten Ereignisse als Funktion der Zeit darstellt. Berechnen Sie dann die zeitlichen Array-weiten Feuerungsraten (oder momentanen Feuerraten) aller aktiven Elektroden, um die Synchronizität der neuronalen Netzwerkaktivität zu überwachen.
7. Generieren Sie schließlich Balkendiagramme mit der Quantifizierungssoftware und führen Sie Vergleiche mit Kruskal Wallis-Tests durch.

Ergebnisse

Vor der Untersuchung elektrischer Wechselwirkungen zwischen glutamatergen Neuronen und Gliomzellen wurden hiPS-abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen charakterisiert, um die Machbarkeit ihrer Kultivierung in mikrofluidischen Geräten zu validieren (Abbildung 1A). Ihre Charakterisierung wurde unter Verwendung von Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotrope Glutamatrezeptoren 2) und vGLUT1-Immunostaining, dargestellt in Abbildung 1A(2-...

Diskussion

Diese Arbeit beschreibt ein genaues funktionelles In-vitro-Modell zur Bewertung der Interaktion zwischen humanen hiPS-abgeleiteten kortikalen glutamatergen Neuronen und Hirntumorzellen in mikrofluidischen Geräten. Einer der entscheidenden Schritte im vorliegenden Protokoll war die hiPS-Differenzierung in glutamatergen Neuronen, die durch die Abnahme der Nestin- und Sox2-Immunfluoreszenzfärbung und das gleichzeitige Auftreten von mGluR2- und vGLUT1-Färbung bestätigt wurde. Dennoch blieben nur wenige neuronale...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
256MEA100/30iR-ITO-w/o	MCS	256MEA100/30iR-ITO-w/o
40 µm probe for Scepter counter	Dutscher	53750
60 µm probe for Scepter counter	Dutscher	51999
Accutase	Sigma	A6964
Ala -Gln (GlutaMAX)	Sigma	G8541
Axel Observer 7 Microscope	Zeiss	431007-9904-000
Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon®	Dutscher	353109
Class II Biological Safety Cabinet	Thermo Scientific	HERASafe type KS12
Colibri 7 LED	Zeiss	4230529710-000
Cortical Glutamatergic Neurons	BrainXell	BX-0300
DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX	Gibco	31331-028
DMEM/F12 Medium	Sigma	D8437
DPBS 1X	Dutscher	L0615-500
EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3	Nunc	156499
Foetal Bovine Serum (FBS)	Dutscher	500105
GDNF	Peprotech	450-10
Geltrex	Life Technologies	A1413201
Human BDNF	Peprotech	450-02
Incubator	Memmert	IC0150med
MCS InterFace Boarder	MCS	181205-MEA2100-11240
MEA2100	MCS	181205-MEA2100-11240
Micropipette P10	Sartorius	LH-729020
Micropipette P100	Sartorius	LH-729050
Micropipette P1000	Sartorius	LH-729070
Micropipette P200	Sartorius	LH-729060
Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock	Dutscher	33290
MultiChannel Experimenter	MCS	-
N2 Supplement-A	StemCell	7152
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
Neurocult SM1 neuronal supplement	StemCell	5711
Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	030570ACL
Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	032260CL
Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	134760CL
Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine	Dutscher	X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity	Drummond	4000202/4038202
Pipette for cell culture 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
Pipette for cell culture 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
Plaque chauffante (CultureTemp)	Belart	370151000
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Primovert microscope	Zeiss	415510-1100-000
Scepter (Handheld Automated Cell Counter)	Millipore	PHCC00000
TGF-β1	Peprotech	100-21C
Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352096
Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352070