글루타미터기뉴런과 소아 고학년 신경교세포의 공동 배양을 미세유체 장치로 결합하여 전기 적 상호 작용을 평가합니다.

요약

최근 작품은 고급 소아 신경 교종에 신경 영향을 발견 (pHGG) 세포와 그들의 상호 작용. 본 작품은 생체 외 모델의 발달을 pHGG 세포와 글루타미터기뉴런과 기록하여 그 간 작용을 모방하였다.

초록

소아 고급 진모 (pHGG)는 급속한 음이없는 예후를 운반하는 유년기 및 사춘기 뇌암을 나타냅니다. 현재 치료에 대한 저항을 극복하고 새로운 치료법을 찾을 필요가 있기 때문에, 새로운 약물과 치료 절차를 테스트하기 위해 체외 설정에서 가능한 한 가까운 질병을 모델링하는 것은 매우 까다롭습니다. 글루타마테어기신경 과민성 을 포함한 그들의 근본적인 병리학 적 과정을 공부하는 것은 환경 두뇌와 pHGG 세포 사이 상호 작용을 이해하는 실제적인 진보가 될 것입니다. 따라서, 뉴런/pHGG 세포 상호 작용을 재현하기 위하여, 이 작품은 인간 유도한 다능성 줄기(hiPS)-유래 된 피질 글루타마테릭 뉴런 pHGG 세포를 구획화된 미세 유체 장치로 pHGG 세포와 그들의 전기생리학적 수정을 기록하는 프로세스를 공동 배양하는 시험관 내 모델의 발달을 보여줍니다. 첫 번째 단계는 인간의 글루타미터기 뉴런을 분화하고 특성화하는 것이었습니다. 둘째, 세포는 pHGG 유래 세포주를 가진 미세유체 장치에서 배양되었다. 뇌 미세 환경과 뉴런 활동은 이러한 마이크로 환경 뉴런에 pHGG 세포의 전기적 영향을 분석하기 위해 이 모델에 포함되었다. 전기 생리학적 기록은 이러한 미세 유체 장치에 다중 전기 분해 어레이(MEA)를 사용하여 생리적 조건을 모방하고 전체 신경망의 전기 활성을 기록합니다. 뉴런 흥분성에 있는 중요한 증가는 종양 세포의 존재에서 밑줄이 있었습니다.

서문

소아 고급 진모(pHGG)는 환자 연령, 종양 해부학적 위치 및 확장 및 분자 동인¹에 따라 확장된 지노티픽 및 페노티픽 다이버시티를 나타낸다. 그(것)들은 현재 유효한 처리 선택권으로 제대로 통제되고 아이들과 청소년에 있는 두뇌 암과 관련되되되는 죽음의 주요한 원인인 공격적인 두뇌 종양입니다². 따라서 환자의 80 % 이상이 진단 후 2 년 이내에 재발하고 있으며, 뇌 위치와 운전자 돌연변이에 따라 평균 생존율은 9-15 개월입니다. 치료 치료의 부재는 실험실 연구를위한 주요 충동이며 새로운 혁신적인 치료 접근 에 대한 즉각적인 필요성을 강조합니다. 이를 위해, 환자 유래 세포주(PDCL)는 2차원(2D) 라인 및/또는 3차원(3D) 신경구에서 pHGG 다이버시티³ 를 제공한다는 희망으로 개발되었다. 그럼에도 불구 하 고, 그 환자 파생 된 체 외 세포 배양 모든 뇌 변수 상황을 모방 하지 않습니다. 이러한 모델은 일반적으로 pHGG에 기술된 거시적 및 현미경 신경 해부학 환경을 고려하지 않습니다.

일반적으로, 어린 아이들의 pHGG는 주로 pontine 및 thalamic 지역에서 발전하고 있는 반면, 사춘기와 젊은 성인의 HGG는 피질 지역에 집중하는 반면, 특히 정면 엽¹에서. 소아 시대에 걸친 이러한 위치 특이성은 신경종과 종양 세포 와 특정 신경 활동 사이의 복잡한 네트워크로 이어지는 다른 환경을 수반하는 것으로 보입니다^4,5,6. 메커니즘은 아직 확인되지 않지만, pHGG는 주로 천체 글리 올과 올리고 의 분화 궤적을 따라 신경 전구체 세포에서 개발. 이러한 신경교 혈통의 역할은 뉴런에 대한 간단한 구조적 지원에 오랫동안 제한되어 왔지만, 이제 는 신경 회로에 완전히 통합하고 뇌의 구조 영역을 재구성하고 뉴런 회로를 리모델링 할 수있는 복잡한 양방향 신경교신경 상호 작용을 나타낸다는 것이 명확합니다^4,7,8 . 더욱이, 증거의 파쇄를 증가하는 것은 중추 신경계 (CNS)가 뇌암 개시 및 진행에 중요한 역할을한다는 것을 나타냅니다. 최근 의외의 성장 인자와 직접 전기화학적 시냅스 통신^6,9을 통해 글리아 악성종양의 성장과 미토시스를 유도하는 것으로 보이는 신경 활동에 초점을 맞춘 최근 작품. 회귀적으로, 고급 신경교종 세포는 증가하는 글루타머지 뉴런 활동으로 신경 기능에 영향을 미치고 구조적으로 그리고 전기적으로 통합되는 회로의 작동을 조절하는 것처럼 보입니다⁹. 따라서, 환자 유래 모델과 뉴런 작용을 제어하는 새로운 신경 과학 도구를 사용하여 연구는 신경교종 위치, 성장 및 진행에 신경 활동의 회로 특정 효과를 입증했다. 교종에 관련 된 이러한 신경 투영의 대부분은 글루타머게틱 과 조미료 분비를 통해 의사 소통. mGluR2 또는 vGlut1/2와 같은 특정 글루타마테르기브 바이오마커는 일반적으로 설명되어 있습니다⁶.

흥미롭게도, 그들의 분자 이질성에도 불구하고, 소아및 성인 고학년 진모는 글루타민간 신경 활동 및 neuroligin-3 또는 BDNF (두뇌 유래 신경 영양인자)와 같은 그밖 분비한 요인에 전형적인 증식 반응을 보여줍니다 (두뇌 유래 신경 영양 인자)4,6,10,11,12,13 . 피질 영역에서, 소아 및 성인 HGGs 증가 된 조미료 분 비를 통해 신경 과민성을 유도 하 고 간 질 네트워크 활동과 관련 된 교감으로 이어지는 GABA 인터뉴런을 억제 할 수 있습니다^14,15. 그 위에, 신경 회로는 특정 신경 학 작업을 추진 하는 gliomas에 의해 리모델링 될 수 있습니다., 예를 들어, 언어, 그리고 추가 조직 된 신경 활동을 요구할 수 있습니다⁹.

이 근거에 근거하여, 신경교종 세포와 신경 사이 양방향 커뮤니케이션의 이해를 전진하는 것은 완전히 해명되고 체외 pHGG 접근의 초기 단계와 통합되어야 합니다. 이러한 혁신적인 모델링은 약물 테스트 중 뉴런 전기 활동 영향을 이해하고 측정하고 뇌 회로에 pHGG 반응을 예측하는 데 매우 중요합니다. 미세 유체 장치 및 pHGG 연구 작품과 같은 신경 과학 도구의 최근 개발은 새로운 모델링 접근 법을 개발하고 이제 체외 pHGG 모델^{3,16,17,18,19}에 뇌 미세 환경을 통합 할 수 있습니다. 다중 전기 극어(MEA)를 이용한 전기생리학적 기록과 결합된 미세유체 장치^20,21,22는 전체 신경망의 전기 적 활성을 기록하고 여러 조건하에서 네트워크 연결 파라미터를 추출하면서 생리학적 조건을 모방할 수 있는 가능성을 제공한다. 이 장치^23,24는 먼저 MEA에 직접 챔버에서 세포의 정확한 증착을 허용한다. 이 기술은 MEA에 세포 파종 밀도 및 균질성을 제어하고 인간 신경 전조자가 장치로 직접 분화하는 중요한 단계인 미디어 교환의 미세 한 제어를 가능하게합니다. 더욱이, 본 증착 챔버는 상이한 시점에서 다중 세포로 시드될 수 있다.

그래서, 이 연구는 인간 다능성 줄기 (hiPS)유래 된 피질 글루타마테기신경 및 pHGG 유래 세포를 미세 유체 장치로 공동 배양하고 두 세포 집단 사이의 전기 적 상호 작용을 평가하기 위해 전기 활동을 기록하는 기능적 인 시험관 내 모델을 개발하는 것을 목표로했습니다. 첫째, hiPS 유래 피질 글루타마테기닉 뉴런은 다양한 배양 단계[일 4일(D4), hiPS 세포로서, 21일(D21) 및 23일(D23) 및 23일(D23)에서 글루타머기틱 성숙뉴런으로 마이크로유체 장치에서 수득및 특징지어졌다. 공동 배양의 두 번째 단계를 위해, 두 개의 pHGG 모델이 사용되었다: 상용화 된 소아 UW479 라인과 pHGG 세포는 환자 종양에서 시작 (BT35)³, H3.3 K27M 드라이버 돌연변이를 베어링. 마지막으로, 동일한 미세 유체 장치에 공동 배양의 48 h 후 pHGG 세포 파종 및 D23 전에 D21에서 글루타미테르기 세포의 전기 생리학적 기록을 수행했습니다. 글루타미터기뉴런과 pHGG 세포 간의 상호작용은 기록된 전기생리활성의 현저한 증가를 특징으로 하였다.

프로토콜

이 프로토콜의 경우, 인간 물질의 사용과 관련된 인증 번호는 DC-2020-4203입니다.

1. 미세 유체 장치 제조, 준비 및 치료

1. 기존의 포토리소그래피 기법을 사용하여 SU-8 금형을 제작^합니다18.
   참고: 이를 위해 2개의 포토리소그래피 마스크는 실리콘 웨이퍼 기판에 포토레지스트 구조의 두 층과 얇은 SU-8 2005 포토레지스트 층(3.2 μm 높이 및 6 ± 1 μm 폭)을 구성하도록 설계되었으며, SU-8 2100(20μm, 1mm) 에서 만든 주요 채널의 패턴으로 비대칭 마이크로그루브를 정의합니다. 길이 13mm)( 보충 도면 S1 참조).
2. 1분 동안 플라즈마 클리너(5.00e-1 토르, 고무선 주파수(RF) 레벨을 사용하여 웨이퍼를 활성화하고 알루미늄 폴더에 1mL(트리클로로,1H,2H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)를 사용하여 30분 동안 데시카이터로 탈옥을 한다.
3. 폴리디메틸실록산(PDMS)의 10:1 비율을 준비하고, 프리폴리머를 촉매와 혼합하고, 진공 건조기에서 전달하여 갇힌 기포를 제거하고, 80°C에서 오븐에서 40분 동안 경화되기 전에 금형에 천천히 캐스팅한다.
4. 금형을 벗겨내기 전에 원하는 크기로 면도기를 사용하여 그 후에 잘라냅니다. 입구와 콘센트 영역을 펀치하여 3mm 너비의 구멍을 확보하고 PDMS를 청소하고 접착제 테이프를 사용하여 보호하십시오.
   참고: 최종 PDMS 장치의 두께는 약 5mm입니다.
5. 플라즈마 클리너(5.00e-1 토르, 1분 동안 높은 RF 레벨)를 사용하여 장치를 처리하고 폴리스티렌 페트리 접시로 조립하고 30분 동안 UV 광 아래에서 진공을 노출시다.
6. 70% 에탄올로 사용하기 전에 미세 유체 장치의 입구인 파이펫을 채우고 포부를 피펫팅하여 비웁니다.
7. 입구 저수지 를 추가하여 미세 유체 장치를 세척 덜벡코의 인산염 버퍼 살린 (D-PBS) 세 번 연속 포부를 피펫하여 비우십시오.
8. 0.05 mg/mL 폴리-D-리신을 사용하여 장치를 코팅하고 인큐베이터(37°C, 5% _CO2)에 넣습니다. 24시간 후, 유입구에 신경물질 배지를 추가하여 장치를 헹구고 포부를 3회 연속으로 피펫팅하여 비우게 한다.
9. 세포 배양 배지로 미세 유체 칩을 채우고 최대 2 시간 동안 사용할 때까지 실온에 남아 있게하십시오.

2. 미세 유체 장치에서 세포 준비 및 파종

1. 인간 hiPS 유래 피질 글루타머기뉴런의 배양, 파종 및 면역형 특성화
   참고: 상용화된 hiPS 유래 피질 글루타마테기뉴런으로 실험을 수행합니다(그림 1A). 인간이 파생한 자료를 보존하고 승인 및 입법 지침에 따라 처리하십시오.
   1. 파종 하기 전에 파이펫 포부로 미세 유체 장치의 입구 및 콘센트 저장소를 비우고 장치의 채널만 매체로 채워집니다.
   2. 0일(D0)에서 hiPS 세포를 종자(D0)는 6.5 x ¹⁰⁶ hiPS 세포/mL 현탁액(예를 들어, 900 셀/^mm2 농도)의 10μL을 매체와 함께 넣고, 그 조성물은 표 1에 주어지며, 세포가 15분 동안 후드(실온에서) 아래에 있게 한다.
   3. 15분 후, 입구와 콘센트 저장소를 모두 50 μL의 D4 배양 배지로 채우고, 전체 조성물은 표 1에 주어지며, 장치를 인큐베이터(37°C, 5% _CO2)로 이송한다.
   4. 대조되는 환경(37°C, 5% _CO2) 및 특정 세포 배양 배지하에서 23일 동안 글루타미터기뉴런 분화를 유지하며, 그의 조성물은 표 1에 기재되어 있다. 다음 단계 5에서 자세히 설명된 대로 미디어를 정기적으로 교체합니다. 바로 아래 그림 1B에서와 같이 단계를 따르십시오.
   5. 표 1 컴포지션 다음 3~4일마다 배지를 교체합니다. D4까지 시드 배지를 사용, D4 배지까지 D7, D7 배지까지 D11, 및 D11 배지는 문화의 나머지 시간 동안.
   6. 표준 위상 대비 현미경을 사용하여 D4, D21 및 D23에서 현미경 사진을 찍어 세포 생존 가능성을 평가하고 세포 계산을 허용하십시오.
   7. 특성화의 경우, 분화 된 글루타미터제닉 뉴런을 4% 파라포름데히드(PFA)에서 중간 포부 후 실온에서 30분 동안 수정하고 면역 불피성 염색 프로토콜을 따릅니다.
   8. 포스페이트 버퍼살린 살린(PBS)으로 3회 세척하고, 트리톤-X0.1%로 10분 동안 30분, 30분 동안 30분동안 소세럼 알부민(BSA)을 세척한다. 1 차적인 항체를 추가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 장치를 배양하십시오.
   9. PBS로 세포를 세 번 헹구고 실온에서 2h에 해당하는 이차 항체와 함께 더 배양한다.
      참고: 연구에서 사용되는 면역 형광 항체는 표 2에 나열됩니다.
   10. 실온에서 10분 동안 PBS와 카운터스테인(4',6-디아미노-2-페닐린돌)으로 세포를 세 번 헹구는다.
   11. CMOS(보완 금속-산화물-반도체) 카메라가 장착된 반전 된 상피 불피 현미경으로 이미지를 획득하고 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하십시오.
   12. DAPI 염색 된 이미지를 열고 소프트웨어의 임계값 루틴으로 비나이즈합니다. 이렇게 하려면 이미지 > > 임계값 조정을 클릭하고 적절한 매개 변수를 설정하여 핵을 배경과 구별합니다. 그런 다음 유 역 > > 프로세스 적용 을 클릭하여 집계 핵을 분할합니다.
   13. 그 후, 이진 이미지를 해석하는 입자 분석 소프트웨어의 기능을 사용합니다. 이렇게 하려면 입자 분석 분석을 클릭한 다음 크기 및 순환 필터(7 μm보다 작은 분석 개체, 20 μm 보다 크거나 0.1 μm 보다 작은 원형)와 같은 적절한 매개 변수를 설정합니다.
   14. DAPI 분석에서 얻은 윤곽 이미지를 면역 형광 사진으로 병합하여 올바른 염색을 검증합니다.
   15. 마지막으로, 상이한 바이오마커에 대해 관련 데이터(개체 수, 평균 면적, 커버리지%등)를 저장하고 적절한 정량화 소프트웨어를 사용하여 D4 및/또는 D21에서 발현을 정량화한다.
2. 상용화된 pHGG 라인, UW479 및 환자 유래 세포주, ^BT353의 세포 배양
   1. DMEM/F-12 글루타맥스의 두 세포주를 세포 배양물에서 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충하였다. 도 1C에 제시된 바와 같이 각 세포주 80% 합류를 기다립니다.
   2. 실험 전반에 걸쳐 노목조건에서 37°C의 제어된 환경에서 이러한 pHGG 세포를 유지한다.

3. 공동 배양 프로토콜

1. UW479 및 BT35 세포주에 대한 파종일과 농도를 조정하여 공동 배양이 시작될 때 컨쿼티 세포의 80%에 도달하도록 조정하며, 이는 글루타머기뉴런을 위한 21일간의 배양에 해당한다.
2. 트립시네화 UW479 및 BT35 세포를 시도하고 성숙한 글루타미터지닉 뉴런을 포함하는 미세 유체 장치에 pHGG 세포를 시드하기 전에 각 전용 미세 유체 장치 (각 세포 유형에 대한 900 세포 / ^mm2 의 목표 밀도)에서 글루타마테어릭 뉴런의 상단에 시드.
3. 대조환경(37°C, 5% _CO2)에서 2일 동안 공동배양을 유지하며, 표 1에 상세되는 글루타미터기닉 뉴런 D11을 갖는다.
4. 이미지 분석 소프트웨어로 분석된 현미경 사진을 사용하여 pHGG 셀을 계산하여 생존 가능성을 평가합니다. 셀 백분율을 계산합니다.
   참고: 다음 수식을 사용하십시오: 100 - (D23의 세포 수 / D21의 세포 수) x 100).

4. 전기 생리학 기록

1. 상용 시스템과 시판 가능한 소프트웨어로 전기 생리학적 기록을 수행합니다.
   참고: 실험은 100 μm에 의해 간격이 30 μm 직경 전극으로 구성된 MEA로 수행되었다.
2. pHGG 세포의 파종 하기 전에 D21에서 글루타마테르기신경에 첫 번째 전기 생리학적 기록을 수행. 대조군으로 차별화 된 글루타머지 뉴런을 사용 하 여 공동 배양에 동호배와 병행하여 단독으로 배양. 다음 단계 번호 3에 설명된 대로 두 조건에 대해 두 번째 레코딩을 수행합니다.
3. D23(2일 후)에서 두 번째 전기생리학적 레코딩을 수행한다.

5. 전기 생리학적 데이터 처리

1. 2^차 대역 패스 버터워스 필터(100Hz 및 2500Hz의 패스밴드 주파수)로 원시 데이터를 필터링합니다.
2. 스파이크 검출의 경우 각 전극에 대해 10분 동안 신호의 루트 평균 사각형을 계산하고 이 루트 평균의 제곱값의 8배에 해당하는 진폭 임계값을 설정합니다.
3. 하나의 작업 잠재력에 대해 최대 2ms의 지속 시간을 고려하여 PTSD(정밀 타이밍 스파이크 감지²⁵) 알고리즘을 적용합니다.
4. 활성 전극으로 간주, 각 전극은 적어도 5 스파이크 / 분 감지. 기록 전극의 10% 이상이 활성 상태인 경우 분석서를 계속합니다.
5. 각 활성 전극의 평균 발사 속도를 계산하기 위해 검출된 스파이크 수를 기록 기간별로 나눕니다. 각 독립 실험에 대한 평균 평균 평균 발사 속도를 계산합니다. 궁극적으로 조건(±SEM)별로 평균을 계산하고 기록 당일 함수로 표현합니다.
6. 각 활성 전극에 대해 감지된 이벤트를 나타내는 각 실험에 대해 래스터 플롯을 시간 함수로 계산합니다. 그런 다음 모든 활성 전극의 시간적 배열 전체 발사 속도(또는 즉각적인 발사 속도)를 계산하여 신경망 활동의 동시성을 모니터링할 수 있습니다.
7. 마지막으로 정량화 소프트웨어를 사용하여 막대 그래프를 생성하고 Kruskal Wallis 테스트를 사용하여 비교를 수행합니다.

결과

글루타미터기뉴런과 신경교종 세포 간의 전기적 상호작용을 연구하기 전에 hiPS 유래 피질 글루타머기뉴런은 미세유체 장치에서 배양할 수 있는 타당성을 검증하는 것이 특징이었습니다(그림 1A). 이들의 특성화는 네스티닌, 삭스2, mGlurR2(대사위픽 글루타민체 수용체 2) 및 vGLUT1 면역스테인링을 사용하여 평가되었으며, 도 1A(2-7)<...

토론

이 작품은 미세 유체 장치에서 인간 hiPS 파생 된 피질 글루타머기신경과 뇌 종양 세포 사이의 상호 작용을 평가하기 위해 정확한 기능적 인 체외 모델을 설명합니다. 본 프로토콜에서 중요한 단계 중 하나는 글루타머기 뉴런의 hiPS 분화였으며, 네스티닌과 Sox2 면역 형광염색 의 감소및 mGluR2 및 vGLUT1 염색의 동시 출현에 의해 확인되었다. 그럼에도 불구 하 고, 몇 가지 신경 선조 는 글루타머?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
256MEA100/30iR-ITO-w/o	MCS	256MEA100/30iR-ITO-w/o
40 µm probe for Scepter counter	Dutscher	53750
60 µm probe for Scepter counter	Dutscher	51999
Accutase	Sigma	A6964
Ala -Gln (GlutaMAX)	Sigma	G8541
Axel Observer 7 Microscope	Zeiss	431007-9904-000
Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon®	Dutscher	353109
Class II Biological Safety Cabinet	Thermo Scientific	HERASafe type KS12
Colibri 7 LED	Zeiss	4230529710-000
Cortical Glutamatergic Neurons	BrainXell	BX-0300
DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX	Gibco	31331-028
DMEM/F12 Medium	Sigma	D8437
DPBS 1X	Dutscher	L0615-500
EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3	Nunc	156499
Foetal Bovine Serum (FBS)	Dutscher	500105
GDNF	Peprotech	450-10
Geltrex	Life Technologies	A1413201
Human BDNF	Peprotech	450-02
Incubator	Memmert	IC0150med
MCS InterFace Boarder	MCS	181205-MEA2100-11240
MEA2100	MCS	181205-MEA2100-11240
Micropipette P10	Sartorius	LH-729020
Micropipette P100	Sartorius	LH-729050
Micropipette P1000	Sartorius	LH-729070
Micropipette P200	Sartorius	LH-729060
Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock	Dutscher	33290
MultiChannel Experimenter	MCS	-
N2 Supplement-A	StemCell	7152
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
Neurocult SM1 neuronal supplement	StemCell	5711
Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	030570ACL
Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	032260CL
Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	134760CL
Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine	Dutscher	X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity	Drummond	4000202/4038202
Pipette for cell culture 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
Pipette for cell culture 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
Plaque chauffante (CultureTemp)	Belart	370151000
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Primovert microscope	Zeiss	415510-1100-000
Scepter (Handheld Automated Cell Counter)	Millipore	PHCC00000
TGF-β1	Peprotech	100-21C
Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352096
Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352070