תרבית משותפת של נוירונים גלוטמטריים ותאי גליומה ברמה גבוהה לילדים למכשירים מיקרופלואידיים להערכת אינטראקציות חשמליות

Quentin Fuchs; Aurélie Batut; Mélanie Gleyzes; Jessica Rontard; Louise Miny; Margot Libralato; Janaina Vieira; Delphine Debis; Florian Larramendy; Thibault Honegger; Melissa Messe; Marina Pierrevelcin; Benoit Lhermitte; Monique Dontenwill; Natacha Entz-Werlé

doi:10.3791/62748

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

עבודות אחרונות לחשוף את ההשפעה העצבית על גליומה ילדים ברמה גבוהה (pHGG) תאים ואינטראקציות הדדיות שלהם. העבודה הנוכחית מראה את ההתפתחות של מודל אין ויטרו פולחן תאי pHGG cohGG נוירונים גלוטמטרגיים ותיעדה את האינטראקציות האלקטרופיזיולוגיות שלהם כדי לחקות את האינטראקטיביות האלה.

Abstract

גליומות ילדים ברמה גבוהה (pHGG) מייצגות סרטן מוח בילדות ובמתבגרים הנושאים פרוגנוזה עגומה מהירה. מכיוון שיש צורך להתגבר על ההתנגדות לטיפולים הנוכחיים ולמצוא דרך חדשה לריפוי, מידול המחלה קרוב ככל האפשר במסגרת מבישה לבדיקת תרופות חדשות והליכים טיפוליים הוא תובעני מאוד. לימוד התהליכים הפתוביולוגיים הבסיסיים שלהם, כולל רגישות יתר של נוירונים גלוטמטרגיים, יהיה התקדמות אמיתית בהבנת אינטראקציות בין המוח הסביבתי לתאי pHGG. לכן, כדי לשחזר נוירונים / אינטראקציות תא pHGG, עבודה זו מראה את ההתפתחות של מודל במבחנה פונקציונלי פולחן שיתוף פולחן גזע Pluripotent המושרה על ידי האדם (hiPS) נגזר נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח pHGG תאים לתוך התקנים microfluidic ממודר ותהליך כדי לתעד את השינויים האלקטרופיזיולוגיים שלהם. הצעד הראשון היה להבדיל ולאפיין נוירונים גלוטמטרגיים אנושיים. שנית, התאים היו בתרבית במכשירים מיקרופלואידיים עם קווי תאים נגזרים pHGG. מיקרו-סביבה מוחית ופעילות עצבית נכללו אז במודל זה כדי לנתח את ההשפעה החשמלית של תאי pHGG על הנוירונים המיקרו-סביבתיים האלה. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מצמידות באמצעות מערכים רב-אלקטרוניים (MEA) למכשירים מיקרופלואידיים אלה כדי לחקות תנאים פיזיולוגיים ולתעד את הפעילות החשמלית של הרשת העצבית כולה. עלייה משמעותית בעירור הנוירונים הודגשה בנוכחות תאים סרטניים.

Introduction

גליומות ילדים ברמה גבוהה (pHGG) מציגות מגוון גנוטיפי ופנוטיפי מורחב בהתאם לגיל המטופל, מיקום גידול אנטומי והרחבה, ונהגים ^{מולקולריים1}. הם גידולים אגרסיביים במוח הנשלטים בצורה גרועה עם אפשרויות הטיפול הקיימות כיום והם הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן המוח אצל ילדים ^{ומתבגרים2}. אז, יותר מ -80% מהחולים מתדרדרים בתוך 2 שנים לאחר האבחון שלהם, וההישרדות החציונית שלהם היא 9-15 חודשים, בהתאם למיקומים במוח ולמוטציות הנהג. היעדר טיפול מרפא הוא הדחף העיקרי למחקר במעבדה ומדגיש את הצורך המיידי בגישות טיפוליות חדשניות חדשות. לשם כך פותחו קווי תאים שמקורם במטופלים (PDCL) בתקווה לספק את מגוון ה-pHGG3 בקווים דו-ממדיים (דו-ממדיים) ו/או נוירוספרות תלת-ממדיות. עם זאת, תרביות תאי ההחמקה שמקורן בחולה אינן מחקות את כל מצבי משתני המוח. מודלים אלה אינם מתייחסים לסביבות הנוירו-אנטומיות המקרוסקופיות והמיקרוסקופיות המתוארות בדרך כלל ב- pHGG.

בדרך כלל, pHGG אצל ילדים צעירים מתפתח בעיקר באזורים פונטין ותלמיים, בעוד HGG של מתבגרים וצעירים להתרכז באזורים קליפת המוח, במיוחד באונה ^{הקדמית1}. נראה כי מיקומים ספציפיים אלה בגילאי ילדים כוללים סביבות שונות המובילות לגלומות ורשת מורכבת בין תאים סרטניים ופעילות עצבית ספציפית4,5,6. למרות מנגנונים עדיין לא מזוהים, pHGG מתפתח בעיקר מתאי מבשר עצבי לאורך מסלול הבידול של שושלות אסטרוגליות ואוליגודנדרוגליות. בעוד שתפקידן של שושלות גליה אלה הוגבל במשך זמן רב לתמיכה מבנית פשוטה עבור נוירונים, כעת נקבע בבירור כי הם משתלבים לחלוטין במעגלים עצביים ומציגים אינטראקציות גליה-נוירונית דו-כיווניות מורכבות המסוגלות לארגן מחדש אזורים מבניים במוח ולעצב מחדש מעגלים עצביים4,7,8 . יתר על כן, פיסות הולכות וגדלות של ראיות מצביעות על כך שמערכת העצבים המרכזית (CNS) ממלאת תפקיד קריטי בייזום והתקדמות סרטן המוח. עבודות אחרונות התמקדו בפעילות עצבית, אשר נראה להניע צמיחה ומיטוזה של ממאירות גליה באמצעות גורמי גדילה מופרשים ותקשורת סינפטית אלקטרוכימית ^{ישירה6,9}. באופן הדדי, תאי גליומה בדרגה גבוהה נראה להשפיע על תפקוד עצבי עם פעילות עצבית גלוטמטרגית גוברת לווסת את הפעולה של המעגלים שבהם הם משולבים מבנית ^{וחשמלית9}. לכן, מחקרים שהשתמשו במודלים שמקורם במטופל ובכלים חדשניים למדעי המוח השולטים בפעולה של נוירונים הדגימו השפעה ספציפית למעגל של פעילות עצבית על מיקום גליומה, צמיחה והתקדמות. רוב התחזיות העצביות המעורבות גליומות הן גלוטמטרגיות ומתקשרות באמצעות הפרשות גלוטמט. סמנים ביולוגיים גלוטמטריים ספציפיים כגון mGluR2 או vGlut1/2 מתוארים בדרך ^כלל6.

מעניין, למרות ההטרוגניות המולקולרית שלהם, גליומות ילדים ומבוגרים בדרגה גבוהה מראות תגובה נפוצה טיפוסית לפעילות עצבית גלוטמטרגית וגורמים מופרשים אחרים כגון נוירוליגין-3 או BDNF (גורם נוירוטרופי המופק מהמוח)4,6,10,11,12,13 . באזורים קליפת המוח, HGGs ילדים ומבוגרים יכול לגרום hyperexcitability עצבית באמצעות הפרשת גלוטמט מוגברת לעכב אינטראורונים גאבא המוביל gliomas הקשורים לפעילות רשת ^{אפילפטית14,15}. נוסף על כך, מעגלים עצביים יכולים להיות משופצים על ידי gliomas דוחף משימות נוירולוגיות ספציפיות, למשל, שפה, והוא יכול לפקיע פעילות עצבית מאורגנת ^נוספת9.

בהתבסס על רציונל זה, קידום ההבנה של תקשורת דו-כיוונית בין תאי גליומה נוירונים חייב להיות מואר לחלוטין בשילוב עם השלבים המוקדמים של גישות pHGG במבחנה. מידול חדשני כזה חיוני להבנת ומדידת השפעת הפעילות החשמלית העצבית במהלך בדיקות סמים וחיזוי תגובת pHGG למעגלים מוחיים. ההתפתחויות האחרונות בכלי מדעי המוח, כגון מכשירים מיקרופלואידיים ועבודות מחקר pHGG, הן המיטה לפתח גישות מידול חדשות ולהיות מסוגל עכשיו לשלב מיקרו-סביבה במוח במודלים של pHGG במבחנה3,16,17,18,19. יחד עם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות מערכים multielectrode (MEA), התקנים microfluidic20,21,22 מציעים את האפשרות לחקות תנאים פיזיולוגיים תוך רישום הפעילות החשמלית של הרשת העצבית כולה לחלץ פרמטרי קישוריות רשת במספר תנאים. מכשיר זה ^23,24 מאפשר תחילה את התצהיר המדויק של תאים בתא ישירות על MEA. טכנולוגיה זו מאפשרת שליטה על צפיפות זריעת תאים והומוגניות על MEA ושליטה עדינה של חילופי מדיה, המהווה צעד קריטי לבידול צאצא עצבי אנושי ישירות למכשירים. יתר על כן, תא התצהיר הנוכחי יכול להיות זרע עם תאים מרובים בנקודות זמן שונות.

לכן, מחקר זה נועד לפתח מודל במבחנה מודל co-culturing גזע Pluripotent אנושי (hiPS) נגזר גלוטמטרגי תאים שמקורם pHGG לתוך מכשירים microfluidic ותיעוד הפעילות החשמלית שלהם כדי להעריך אינטראקציות חשמליות בין שתי אוכלוסיות התא. ראשית, נוירונים גלוטמטרגיים בקליפת המוח הושגו ואופיינו במכשירים מיקרופלואידיים בשלבים שונים של תרבית [יום 4 (D4), כתאי hiPS, וביום 21 (D21) וביום 23 (D23), כמו נוירונים התבגר גלוטמטרגי]. עבור השלב השני של תרבות משותפת, נעשה שימוש בשני דגמי pHGG: קו UW479 ילדים ממוסחר ותאי pHGG יזם מגידול חולה (BT35)³, נושא מוטציה נהג H3.3 K27M. לבסוף, ביצענו הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של תאים גלוטמטרגיים ב- D21 לפני זריעת תאי pHGG ו- D23 לאחר 48 שעות של תרבית משותפת לאותו מכשיר מיקרופלואידי. האינטראקציות בין נוירונים גלוטמטרגיים לתאי pHGG התאפיינו בעלייה משמעותית בפעילות האלקטרופיזיולוגית המתועדת.

Protocol

עבור פרוטוקול זה, מספר ההסמכה הקשור לשימוש בחומרים אנושיים הוא DC-2020-4203.

1. ייצור, הכנה וטיפול של מכשיר מיקרופלואידי

פברק תבניות SU-8 בטכניקות פוטוליתוגרפיה קונבנציונליות18.
הערה: למטרה זו, שתי מסכות פוטוליתוגרפיה תוכננו לבנות שתי שכבות של מבנים פוטוארסיסטיים על מצע רקיק סיליקון ושכבה פוטורסיסטית דקה SU-8 2005 (גובה 3.2 מיקרומטר ו 6 ± 1 מיקרומטר רוחב) המגדיר מיקרוגרובים אסימטריים תחת דפוס של ערוצים ראשיים שנעשו SU-8 2100 (200 מיקרומטר גבוה, 1 מ"מ רוחב, ובאורך 13 מ"מ) (ראו איור משלים S1).
הפעל את הוופל באמצעות מנקה פלזמה (5.00e-1 torr, תדר רדיו גבוה (RF) רמה) במשך 1 דקות וסילאניזציה אותו באמצעות 1 מ"ל של (טריכלורו(1H,1H,2H,2H,2H-perfluorooctyl)סילאן בתיקיית אלומיניום לתוך דיסקלור במשך 30 דקות.
הכן יחס של 10:1 של Polydimethylsiloxane (PDMS), לערבב את preפולימר עם זרז, להעביר אותו בחיטוי ואקום כדי להסיר בועות לכודות, ולהטיל אותו לאט על התבנית לפני נרפא בתנור ב 80 °C (40 דקות).
חותכים אותו לאחר מכן באמצעות סכין גילוח בגודל הרצוי לפני קילוף התבנית. חבטו את המפרצון ואת אזורי השקע כדי להשיג חורים ברוחב 3 מ"מ, לנקות את ה-PDMS ולהגן עליו באמצעות סרט הדבקה.
הערה: עובי התקן PDMS הסופי הוא כ 5 מ"מ.
לטפל במכשיר באמצעות מנקה פלזמה (5.00e-1 ^טור , רמת RF גבוהה במהלך 1 דקות), להרכיב אותו עם צלחת פטרי פוליסטירן, ולחשוף את הוואקום תחת אור UV במשך 30 דקות.
מלאו בפיפטה את חדירת המכשיר המיקרופלואידי לפני השימוש ב-70% אתנול ורוקנו אותו על ידי שאיפה.
לשטוף את המכשיר microfluidic על ידי הוספת מאגרי מפרצון של פוספט אגירה מלוחה (D-PBS) ולרוקן אותו על ידי שאיפה צנרת שלוש פעמים ברציפות.
מצפים את המכשיר באמצעות 0.05 מ"ג /מ"ל פולי-D-ליסין ומניחים אותו לתוך אינקובטור (37 °C (37 °C,5% _CO2). לאחר 24 שעות, לשטוף את המכשיר על ידי הוספת לתוך מאגר הכניסה המדיום neurobasal ולרוקן אותו על ידי שאיפה צנרת שלוש פעמים ברציפות.
מלא את השבב microfluidic עם המדיום תרבית התא ולתת לו להישאר בטמפרטורת החדר עד לשימוש לכל היותר של 2 שעות.

2. הכנת תאים וזריעה במכשיר המיקרופלואידי

תרבות, זריעה ואפיון חיסוני של נוירונים גלוטמטרגיים קורטליים שמקורם בקליפת המוח
הערה: בצע ניסויים עם נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח ממוסחרים שמקורם ב- HIPS (איור 1A). לשמר חומרים שמקורם בבני אדם ולטפל בהם באישור ובהנחיות החקיקה.
1. רוקנו את מאגרי הכניסה והשקע של המכשיר המיקרופלואידי על ידי שאיפת פיפטה לפני זריעה, ואפשרו רק לערוצי המכשיר להתמלא במדיום.
2. זרע את תאי hiPS ביום 0 (D0) על ידי הצבת 10 μL של 6.5 x ¹⁰⁶ תאי hiPS / השעיה mL (למשל, 900 תא / ריכוז ^mm2 ) עם המדיום, שהרכבו ניתן בטבלה 1, ולתת למכשיר להיות מתחת למכסה המנוע (בטמפרטורת החדר) במשך 15 דקות כדי לאפשר לתאים להתחבר.
3. לאחר 15 דקות, מלאו הן את מאגרי הכניסה והן את מאגרי השקע ב-50 מיקרו-אל של מדיום תרבות D4, שכל הרכבו ניתן בטבלה 1, והעבירו את המכשיר לחממה (37 °C (37 °C(5%, 5% _CO2).
4. שמור על בידול נוירונים גלוטמטרגיים למשך 23 ימים (איור 1A(1), מיקרוסקופיה) תחת סביבה מבוקרת (37 °C (37 °C,5% _CO2) ועם מדיום מסוים של תרבית תאים, שהרכבו מתואר בטבלה 1. החלף את המדיום באופן קבוע כמפורט בשלב הבא 5. ממש מתחת ובצע את השלבים כמו באיור 1B.
5. החלף את המדיום כל 3 עד 4 ימים לאחר הרכב טבלה 1 . יש להשתמש במדיום זריעה עד D4, D4 בינוני עד D7, D7 בינוני עד D11 ו-D11 בינוני למשך הזמן הנותר של התרבות.
6. צלם תמונות מיקרוסקופיות ב- D4, D21 ו- D23 באמצעות מיקרוסקופ רגיל של ניגודיות פאזה כדי להעריך את כדאיות התא ולאפשר ספירת תאים.
7. לאפיון, לתקן את נוירונים גלוטמטרגיים מובחנים ב 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לאחר שאיפה בינונית ופעל לפי הפרוטוקול להכתמת immunofluorescence.
8. לשטוף תאים שלוש פעמים עם תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) ולחלחל אותם במשך 10 דקות עם 0.1% טריטון-X ואחריו 30 דקות עם 3% סרומין בקר (BSA). הוסף נוגדנים ראשוניים ודגר את המכשיר למשך הלילה ב 4 °C (7 °F).
9. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ודגור עוד יותר עם נוגדנים משניים המתאימים במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
  הערה: נוגדנים אימונופלואורסצנטיים המשמשים במחקר מפורטים בטבלה 2.
10. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ו counterstain עם DAPI (4', 6-דיאמינו-2-פנילינדול) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
11. לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיות הפוכה המצויד במצלמת CMOS (מוליך למחצה משלימה של תחמוצת מתכת) ולנתח באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מתאימה.
12. פתח את התמונות המוכתמות של DAPI ולהפוך ל- binarize עם שגרת הסף בתוכנה. כדי לעשות זאת, לחץ על תמונה > התאם את סף >, והגדר את הפרמטרים המתאימים כדי להבחין בין הגרעין לרקע. לאחר מכן, לחץ על החל תהליך > > קו פרשת המים כדי לפצל את גרעין הצבירה.
13. לאחר מכן, השתמש בפונקציית התוכנה המולדת של Analyze Particles כדי לפרש את התמונות הבינאריות. כדי לעשות זאת, לחץ על נתח ולאחר מכן על לנתח חלקיקים ולהגדיר את הפרמטרים המתאימים לאחר מכן: גודל ומסנן מעגליות (לא לכלול אובייקטים ניתוח קטן מ 7 מיקרומטר, גדול מ 20 מיקרומטר, או עם מעגליות קטנה מ 0.1 מיקרומטר).
14. מזג את תמונות קווי המתאר שהתקבלו מניתוח DAPI לתמונות אימונופלואורסצנטיות של כתב כדי לאמת את הכתמים הנכונים.
15. לבסוף, שמור את הנתונים המשויכים (מספר האובייקטים, האזור הממוצע, % הכיסוי וכו ') עבור סמנים ביולוגיים שונים וכמת את הביטוי ב- D4 ו/ או D21 באמצעות תוכנת כימות מתאימה.
תרבית תאים של קו pHGG ממוסחר, UW479 וקו תאים שמקורו במטופל, BT353
1. תרבית שני קווי התא ב- DMEM /F-12 גלוטמקס בתוספת סרום בקר עוברי 10% (FBS) בבקבוק תרבית תאים. המתינו למפגש של 80% מכל קו סלולרי כפי שמוצג באיור 1C.
2. שמור על תאי pHGG אלה תחת סביבה מבוקרת בטמפרטורה של 37 °C (37 °F) בתנאים נורמוקסיים לאורך כל הניסויים.

3. פרוטוקול תרבות משותפת

התאם את יום הזריעה והריכוז עבור UW479 ו- BT35 קווי תאים כדי להגיע ל -80% מהתאים המשוחחים כאשר התרבות המשותפת אמורה להתחיל, המתאימה ל -21 ימים של תרבות עבור נוירונים גלוטמטרגיים.
Trypsinize UW479 ו- BT35 וזרע אותם על גבי נוירונים גלוטמטריים בכל מכשיר מיקרופלואידי ייעודי (עם צפיפות יעד של 900 תאים / ^mm2 עבור כל סוג תא) לפני זריעת תאי pHGG לתוך המכשיר microfluidic המכיל נוירונים גלוטמטרגיים בוגרים.
שמור על תרביות משותפות במשך יומיים תחת סביבה מבוקרת (37 °C (37 °C,5% _CO2) עם נוירון גלוטמטרגי D11 ומדיום ואילך מפורט בטבלה 1.
ספירת תאי pHGG באמצעות התמונות המיקרוסקופיות שניתחו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כדי להעריך את הכדאיות שלהם. חשב את אחוז התאים.
הערה: השתמש בנוסחה הבאה: 100 - ((מספר התאים ב- D23 / מספר תאים ב- D21) x 100).

4. הקלטה אלקטרופיזיולוגית

בצע את ההקלטה האלקטרופיזיולוגית עם מערכת מסחרית ותוכנה זמינה מסחרית.
הערה: הניסויים בוצעו עם MEA שכלל אלקטרודות בקוטר 30 מיקרומטר במרווח של 100 מיקרומטר.
בצע הקלטה אלקטרופיזיולוגית ראשונה על נוירונים גלוטמטרגיים ב- D21 לפני זריעת תאי pHGG. השתמש נוירונים גלוטמטרגיים מובחנים כמו שליטה ותרבות אותם לבד במקביל לתרבות המשותפת. בצע הקלטה שנייה עבור שני התנאים כמתואר בשלב הבא ממוספר 3.
בצע הקלטה אלקטרופיזיולוגית שנייה ב- D23 (לאחר יומיים של תרבות משותפת).

5. עיבוד נתונים אלקטרופיזיולוגיים

סנן את הנתונים הגולמיים באמצעות מסנן באטרוורת' מסדר ^שני (עם תדרי פס של 100 הרץ ו-2500 הרץ).
לזיהוי ספייק, חשב את ריבוע הממוצע השורש של האות מעל ההקלטה של 10 דקות עבור כל אלקטרודה והגדר סף משרעת המתאים לפי שמונה מהערך הריבועי של ממוצע השורש.
החל אלגוריתם PTSD (זיהוי ספייק תזמון ^מדויק25), בהתחשב במשך מרבי של 2 אלפיות שניים עבור פוטנציאל פעולה אחד.
שקול כאלקטרודה פעילה, כל אלקטרודה מזהה לפחות 5 קוצים / דקה. המשך את ההסתה אם לפחות 10% מהאלקטרודות ההקלטה פעילות.
חלק את מספר הקוצים שזוהו לפי פרק הזמן של ההקלטה כדי לחשב את קצב הירי הממוצע של כל אלקטרודה פעילה. חשב שיעור ירי ממוצע ממוצע עבור כל ניסוי עצמאי. בסופו של דבר, חשב ממוצע לפי תנאי (±SEM) והבע אותו כפונקציה ביום ההקלטה.
חשב עלילת רסטר עבור כל ניסוי המייצג את האירועים שזוהו עבור כל אלקטרודה פעילה כפונקציה של זמן. לאחר מכן, לחשב את שיעורי הירי במערך הזמן (או שיעורי ירי מיידיים) של כל האלקטרודות הפעילות, ומאפשר לפקח על סינכרוניות של פעילות הרשת העצבית.
לבסוף, ליצור גרפי עמודות באמצעות תוכנת הכימות ולבצע השוואות באמצעות בדיקות Kruskal Wallis.

תוצאות

לפני לימוד אינטראקציות חשמליות בין נוירונים גלוטמטריים לתאי גליומה, תאי עצב גלוטמטרגיים בקליפת המוח ממקור HIPS התאפיינו כדי לאמת את ההיתכנות של פולחן שלהם במכשירים מיקרופלואידיים (איור 1A). האפיון שלהם הוערך באמצעות נסטין, Sox2, mGlurR2 (קולטני גלוטמט מטאבוטרופיים 2),...

Discussion

עבודה זו מתארת מודל במבחנה תפקודית מדויקת כדי להעריך את האינטראקציה בין נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח נגזר hiPS אנושי ותאים סרטניים במוח במכשירים מיקרופלואידיים. אחד הצעדים המכריעים בפרוטוקול הנוכחי היה בידול hiPS נוירונים גלוטמטרגיים, אשר אושר על ידי הירידה של כתמים אימונופלואורסצ...

Disclosures

AB, MG, JR, LM, ML, JV, DD מועסקים על ידי NETRI, FL הוא מנהל טכנולוגיה ראשי ב- NETRI, ו- TH הוא מנהל מדעי ראשי ב- NETRI. למחברים האחרים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית Satt Conectus, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «פרנק, רון דה סוליי» ו «Semeurs d'Etoile» עמותות. אנו מודים לילדים ולמשפחות שנפגעו מהפגנים על תרומתם למחקר זה ולתמיכתם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
256MEA100/30iR-ITO-w/o	MCS	256MEA100/30iR-ITO-w/o
40 µm probe for Scepter counter	Dutscher	53750
60 µm probe for Scepter counter	Dutscher	51999
Accutase	Sigma	A6964
Ala -Gln (GlutaMAX)	Sigma	G8541
Axel Observer 7 Microscope	Zeiss	431007-9904-000
Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon®	Dutscher	353109
Class II Biological Safety Cabinet	Thermo Scientific	HERASafe type KS12
Colibri 7 LED	Zeiss	4230529710-000
Cortical Glutamatergic Neurons	BrainXell	BX-0300
DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX	Gibco	31331-028
DMEM/F12 Medium	Sigma	D8437
DPBS 1X	Dutscher	L0615-500
EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3	Nunc	156499
Foetal Bovine Serum (FBS)	Dutscher	500105
GDNF	Peprotech	450-10
Geltrex	Life Technologies	A1413201
Human BDNF	Peprotech	450-02
Incubator	Memmert	IC0150med
MCS InterFace Boarder	MCS	181205-MEA2100-11240
MEA2100	MCS	181205-MEA2100-11240
Micropipette P10	Sartorius	LH-729020
Micropipette P100	Sartorius	LH-729050
Micropipette P1000	Sartorius	LH-729070
Micropipette P200	Sartorius	LH-729060
Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock	Dutscher	33290
MultiChannel Experimenter	MCS	-
N2 Supplement-A	StemCell	7152
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
Neurocult SM1 neuronal supplement	StemCell	5711
Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	030570ACL
Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	032260CL
Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	134760CL
Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine	Dutscher	X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity	Drummond	4000202/4038202
Pipette for cell culture 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
Pipette for cell culture 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
Plaque chauffante (CultureTemp)	Belart	370151000
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Primovert microscope	Zeiss	415510-1100-000
Scepter (Handheld Automated Cell Counter)	Millipore	PHCC00000
TGF-β1	Peprotech	100-21C
Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352096
Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352070

References

Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
Ostrom, Q. T., et al. Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).
Blandin, A. F., et al. Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity. Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).
Monje, M. Synaptic communication in brain cancer. Cancer Research. 80 (14), 2979-2982 (2020).
Mount, C. W., Yalçın, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity. eLife. 18 (8), 49291 (2019).
Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).
Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders. Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
Krishna, S., et al. Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival. BioRxiv. , (2021).
Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).
Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
Venkatesh, H. S., et al. Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma. Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).
Venkatesh, H. S., et al. Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion. Cell. 161 (4), 803-816 (2015).
Buckingham, S. C., et al. Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity. Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).
Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks. Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).
Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks. BioRxiv. , (2021).
Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings. Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).
Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks. Scientific Reports. 6, 28384 (2016).
Nguyen, A., et al. Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1α axis inhibition. Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).
Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
Cerea, A., et al. Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors. Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).
Bruno, G., et al. Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).
Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
Maisonneuve, B. G. C., et al. Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework. BioRxiv. , (2021).
Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
Andreiuk, B., et al. Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo. Small. 13 (38), (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

177

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: