Кокультура глутаматергических нейронов и педиатрических клеток глиомы высокой степени в микрофлюидные устройства для оценки электрических взаимодействий

Резюме

Недавние работы раскрывают нейронное воздействие на клетки высокодипломной детской глиомы (pHGG) и их взаимные взаимодействия. Настоящая работа показывает разработку модели in vitro совместного культивирования pHGG-клеток и глутаматергических нейронов и записывающей их электрофизиологические взаимодействия для имитации этих взаимодействий.

Аннотация

Детские высокодифференцированные глиомы (pHGG) представляют собой рак мозга у детей и подростков, которые имеют быстрый мрачный прогноз. Поскольку существует необходимость преодолеть устойчивость к текущим методам лечения и найти новый способ лечения, моделирование заболевания как можно ближе в условиях in vitro для тестирования новых лекарств и терапевтических процедур является очень требовательным. Изучение их фундаментальных патобиологических процессов, включая гипервозбудимость глутаматергических нейронов, станет реальным шагом вперед в понимании взаимодействий между мозгом окружающей среды и клетками pHGG. Таким образом, чтобы воссоздать взаимодействия нейронов / клеток pHGG, эта работа показывает разработку функциональной модели in vitro , кокультурирующей индуцированные человеком плюрипотентные стволовые (hiPS) корковые глутаматергические нейроны pHGG в разделенные микрофлюидные устройства и процесс регистрации их электрофизиологических модификаций. Первым шагом была дифференциация и характеристика глутаматергических нейронов человека. Во-вторых, клетки культивировали в микрофлюидных устройствах с клеточными линиями, полученными из pHGG. Микроокружение мозга и активность нейронов были затем включены в эту модель для анализа электрического воздействия клеток pHGG на эти нейроны микросреды. Электрофизиологические записи соединяются с использованием многоэлектродных массивов (MEA) с этими микрофлюидными устройствами для имитации физиологических условий и записи электрической активности всей нейронной сети. Значительное увеличение возбудимости нейронов было подчеркнуто в присутствии опухолевых клеток.

Введение

Педиатрические высокодифференцированные глиомы (pHGG) демонстрируют расширенное генотипическое и фенотипическое разнообразие в зависимости от возраста пациента, анатомического расположения и расширения опухоли, а также молекулярных ^{драйверов1}. Это агрессивные опухоли головного мозга, которые плохо контролируются с помощью доступных в настоящее время вариантов лечения и являются основной причиной смерти, связанной с раком мозга у детей и ^{подростков2}. Так, более 80% пациентов рецидивируют в течение 2 лет после постановки диагноза, а их медиана выживаемости составляет 9-15 месяцев, в зависимости от расположения мозга и мутаций водителя. Отсутствие лечебного лечения является основным стимулом для лабораторных исследований и подчеркивает непосредственную потребность в новых инновационных терапевтических подходах. С этой целью были разработаны клеточные линии, полученные от пациента (PDCL) с надеждой обеспечить разнообразие ^pHGG3 в двумерных (2D) линиях и / или трехмерных (3D) невросферах. Тем не менее, эти клеточные культуры in vitro, полученные от пациента, не имитируют все переменные ситуации мозга. Эти модели не учитывают макроскопические и микроскопические нейроанатомические среды, обычно описываемые в pHGG.

Обычно pHGG у детей младшего возраста в основном развивается в понтиновой и таламической областях, тогда как HGG подростков и молодых людей концентрируются в кортикальных областях, особенно в лобно-височных ^долях1. Эти особенности местоположения в педиатрическом возрасте, по-видимому, связаны с различными средами, приводящими к глиомагенезу и заглубляющей сети между опухолевыми клетками и специфической нейронной активностью4,5,6. Хотя механизмы до сих пор не идентифицированы, pHGG в основном развивается из нейронных клеток-предшественников по траектории дифференцировки астроглиальных и олигодендроглиальных линий. Хотя роль этих глиальных линий долгое время ограничивалась простой структурной поддержкой нейронов, в настоящее время четко установлено, что они полностью интегрируются в нейронные цепи и демонстрируют сложные двунаправленные глиально-нейрональные взаимодействия, способные реорганизовывать структурные области мозга и реконструировать нейронные схемы4,7,8 . Более того, увеличение количества доказательств указывает на то, что центральная нервная система (ЦНС) играет решающую роль в инициации и прогрессировании рака мозга. Последние работы были сосредоточены на активности нейронов, которая, по-видимому, стимулирует рост и митоз глиальных злокачественных новообразований через секретируемые факторы роста и прямые электрохимические синаптические ^{коммуникации6,9}. Взаимно, полноценные клетки глиомы, по-видимому, влияют на функцию нейронов с увеличением глутаматергической нейронной активности и модулируют работу цепей, в которые они структурно и электрически ^{интегрированы9}. Таким образом, исследования с использованием моделей, полученных от пациента, и новых инструментов нейробиологии, контролирующих действие нейронов, продемонстрировали специфическое для схемы влияние нейронной активности на расположение, рост и прогрессирование глиомы. Большинство из этих нейронных проекций, участвующих в глиомах, являются глутаматергическими и сообщаются через секрецию глутамата. Обычно описываются специфические глутаматергические биомаркеры, такие как mGluR2 или vGlut1/²⁶.

Интересно, что, несмотря на свою молекулярную гетерогенность, детские и взрослые полноценные глиомы демонстрируют типичный пролиферативный ответ на глутаматергическую активность нейронов и другие секретируемые факторы, такие как нейролигин-3 или BDNF (нейротрофический фактор мозга)4,6,10,11,12,13 . В корковых областях детские и взрослые HGG могут индуцировать гипервозбудимость нейронов через повышенную секрецию глутамата и ингибировать интернейроны ГАМК, что приводит к глиомам, связанным с эпилептической сетевой ^{активностью14,15}. Кроме того, нейронные цепи могут быть реконструированы глиомами, подталкивающими конкретные неврологические задачи, например, язык, и могут реквизировать дополнительную организованную нейронную ^{активность9}.

Основываясь на этом обосновании, продвижение понимания двунаправленных связей между клетками глиомы и нейронами должно быть полностью выяснено и интегрировано с ранними стадиями подходов pHGG in vitro. Такое инновационное моделирование имеет решающее значение для понимания и измерения влияния электрической активности нейронов во время тестирования на наркотики и прогнозирования реакции pHGG в схему мозга. Последние разработки в области инструментов нейробиологии, такие как микрофлюидные устройства и исследовательские работы pHGG, являются основой для разработки новых подходов к моделированию и теперь могут интегрировать микросреду мозга в модели pHGG in vitro3,16,17,18,19. В сочетании с электрофизиологическими записями с использованием многоэлектродных массивов (MEA) микрофлюидные устройства20,21,22 предлагают возможность имитировать физиологические условия при записи электрической активности всей нейронной сети и извлекать параметры сетевой связности при нескольких условиях. Это ^{устройство23,24} позволяет сначала точно наносить ячейки в камеру непосредственно на MEA. Эта технология позволяет контролировать плотность и однородность посева клеток на MEA и точно контролировать обмен средами, что является критическим шагом для дифференциации нейронных предшественников человека непосредственно в устройствах. Кроме того, настоящая камера осаждения может быть засеяна несколькими клетками в разные моменты времени.

Таким образом, это исследование было направлено на разработку функциональной модели in vitro , совместно культивирующей человеческие плюрипотентные стволовые (hiPS) корковые глутаматергические нейроны и клетки, полученные из pHGG, в микрофлюидные устройства и записывающую их электрическую активность для оценки электрических взаимодействий между обеими клеточными популяциями. Во-первых, кортикальные глутаматергические нейроны, полученные из hiPS, были получены и охарактеризованы в микрофлюидных устройствах на разных стадиях культивирования [день 4 (D4), как клетки hiPS, и день 21 (D21) и день 23 (D23), как глутаматергические зрелые нейроны]. Для второго этапа совместной культивирования использовались две модели pHGG: коммерциализированная педиатрическая линия UW479 и клетки pHGG, инициированные из опухоли пациента (BT35)³, несущие мутацию драйвера H3.3 K27M. Наконец, мы выполнили электрофизиологические записи глутаматергических клеток на D21 перед посевом pHGG-клеток и D23 после 48 ч совместной культуры в одно и то же микрофлюидное устройство. Взаимодействия между глутаматергическими нейронами и pHGG-клетками характеризовались значительным увеличением регистрируемой электрофизиологической активности.

протокол

Для этого протокола номер аккредитации, связанный с использованием материалов человека, - DC-2020-4203.

1. Изготовление, подготовка и обработка микрофлюидных устройств

1. Изготовление пресс-форм СУ-8 с использованием обычных методов ^{фотолитографии18}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С этой целью были разработаны две фотолитографические маски для построения двух слоев структур фоторезиста на подложке кремниевой пластины и тонкого слоя фоторезиста SU-8 2005 (высота 3,2 мкм и ширина 6 ± 1 мкм), который определяет асимметричные микроплоты под рисунок основных каналов, выполненных в SU-8 2100 (высота 200 мкм, ширина 1 мм, и 13 мм в длину) (см. дополнительный рисунок S1).
2. Активируйте пластину с помощью плазменного очистителя (5.00e-1 torr, высокий радиочастотный (RF) уровень) в течение 1 мин и силанизируйте ее с помощью 1 мл (трихлор(1H,1H,2H,2H-перфтороктил)силана в алюминиевой папке в осушитель в течение 30 мин.
3. Приготовьте полидиметилсилоксан (PDMS) в соотношении 10:1, смешайте преполимер с катализатором, пропустите его в вакуумный осушитель для удаления захваченных пузырьков и медленно бросьте на форму перед отверждением в духовке при 80 °C в течение 40 минут.
4. Вырежьте его после этого с помощью бритвы нужного размера перед отслаиванием формы. Выбивайте входную и выходную зоны, чтобы получить отверстия шириной 3 мм, очистите PDMS и защитите его с помощью клейкой ленты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина конечного устройства PDMS составляет приблизительно 5 мм.
5. Обработайте устройство с помощью плазменного очистителя (5.00e-1 torr, высокий уровень ВЧ в течение 1 мин), соберите его с полистирольной чашкой Петри и подвергайте вакуум воздействию ультрафиолетового излучения в течение 30 мин.
6. Заполните пипеткой входное отверстие микрофлюидного устройства перед использованием 70% этанолом и опорожните его путем аспирации пипетирования.
7. Промыть микрофлюидное устройство, добавив впускные резервуары Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) и опорожнить его, пипетируя аспирацию три раза подряд.
8. Нанесите на устройство покрытие с использованием 0,05 мг/мл поли-D-лизина и поместите его в инкубатор (37 °C, 5% _CO2). Через 24 ч промыть устройство, добавив во входной резервуар нейробазальную среду и опорожнить его путем пипетирования аспирации три раза подряд.
9. Наполните микрофлюидный чип средой для культивирования клеток и оставьте его при комнатной температуре до использования в течение максимум 2 ч.

2. Подготовка и посев клеток в микрофлюидном устройстве

1. Культивирование, посев и иммунофлуоресцентная характеристика корковых глутаматергических нейронов человека, полученных из hiPS
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение экспериментов с коммерциализированными кортикальными глутаматергическими нейронами, полученными из hiPS (Рисунок 1А). Сохранять материалы, полученные от человека, и обращаться с ними с одобрения и в соответствии с руководящими принципами законодательства.
   1. Опорожняйте входной и выходной резервуары микрофлюидного устройства аспирацией пипетки перед посевом, позволяя заполнять средой только каналы устройства.
   2. Засейте hiPS-клетки на 0-й день (D0), положив 10 мкл 6,5 x ¹⁰⁶ суспензии hiPS/мл (например, концентрация 900 клеток/^мм2 ) на среду, состав которой приведен в таблице 1, и оставьте устройство под капотом (при комнатной температуре) в течение 15 мин, чтобы клетки могли прикрепиться.
   3. Через 15 мин заполняют как впускные, так и выходные резервуары 50 мкл питательной среды D4, весь состав которой приведен в таблице 1, и перекладывают устройство в инкубатор (37 °C, 5% _CO2).
   4. Поддерживать дифференцировку глутаматергических нейронов в течение 23 дней (фиг.1А(1), микроскопия) в контролируемой среде (37 °C, 5% _CO2) и с помощью специфической клеточной культуральной среды, состав которой описан в таблице 1. Регулярно заменяйте носитель, как описано в следующем шаге 5. чуть ниже и следуйте инструкциям, как показано на рисунке 1B.
   5. Заменяйте среду каждые 3 - 4 дня после таблицы 1 состава. Используйте посевную среду до D4, среду D4 до D7, среду D7 до D11 и среду D11 в течение оставшегося времени культуры.
   6. Делайте микроскопические снимки на D4, D21 и D23 с помощью стандартного фазово-контрастного микроскопа для оценки жизнеспособности клеток и подсчета клеток.
   7. Для характеристики зафиксируйте дифференцированные глутаматергические нейроны в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 30 мин при комнатной температуре после аспирации среды и следуйте протоколу иммунофлуоресцентного окрашивания.
   8. Промыть клетки три раза фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и пропитать их в течение 10 мин с 0,1% Triton-X, а затем 30 мин с 3% бычьим сывороточным альбумином (BSA). Добавьте первичные антитела и инкубируйте устройство в течение ночи при 4 °C.
   9. Промыть клетки три раза PBS и инкубировать далее с соответствующими вторичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресцентные антитела, используемые в исследовании, перечислены в таблице 2.
   10. Промыть клетки три раза PBS и противопачкать DAPI (4',6-диамино-2-фенилиндол) в течение 10 мин при комнатной температуре.
   11. Получайте изображения с помощью инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного CMOS-камерой (Complementary metal-oxide-semiconductor), и анализируйте с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений.
   12. Откройте окрашенные изображения DAPI и выполните бинаризацию с помощью процедуры пороговых значений в программном обеспечении. Для этого нажмите на Image > Adjust > Threshold, и задайте соответствующие параметры, чтобы отличить ядро от фона. Затем нажмите «Применить > процесс > водоразделе, чтобы разделить совокупное ядро.
   13. После этого используйте функцию врожденного программного обеспечения Analyze Particles для интерпретации двоичных изображений. Для этого нажмите « Анализировать», а затем « Анализировать частицы» и после этого задайте соответствующие параметры: фильтр размера и цикличности (исключить из анализа объекты размером менее 7 мкм, размером более 20 мкм или с окружностью менее 0,1 мкм).
   14. Объедините контурные изображения, полученные в результате анализа DAPI, с соответствующими иммунофлуоресцентными изображениями для проверки правильности окрашивания.
   15. Наконец, сохраните связанные данные (количество объектов, средняя площадь, % покрытия и т.д.) для различных биомаркеров и количественно оцените экспрессию на D4 и/или D21 с использованием соответствующего программного обеспечения для количественной оценки.
2. Клеточная культура коммерциализированной линии pHGG, UW479, и клеточной линии, полученной от пациента, BT353
   1. Культивируйте обе клеточные линии в DMEM/F-12 GlutaMAX с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в колбе для клеточной культуры. Дождитесь 80% слияния каждой клеточной линии, как показано на рисунке 1С.
   2. Поддерживайте эти pHGG-клетки в контролируемой среде при 37 °C в нормоксических условиях на протяжении всех экспериментов.

3. Протокол совместного культивирования

1. Скорректируйте день посева и концентрацию для клеточных линий UW479 и BT35, чтобы достичь 80% сливающихся клеток, когда должна начаться кокультура, что соответствует 21 дню культивирования для глутаматергических нейронов.
2. Трипсинизируют клетки UW479 и BT35 и засевают их поверх глутаматергических нейронов в каждом выделенном микрофлюидном устройстве (с целевой плотностью 900 клеток / ^мм2 для каждого типа клеток) перед посевом клеток pHGG в микрофлюидное устройство, содержащее зрелые глутаматергические нейроны.
3. Поддерживать кокультуры в течение 2 дней в контролируемой среде (37 °C, 5% _CO2) с глутаматергическим нейроном D11 и последующей средой, подробно описанной в таблице 1.
4. Подсчитайте клетки pHGG с помощью микроскопических изображений, проанализированных с помощью программного обеспечения для анализа изображений, чтобы оценить их жизнеспособность. Рассчитайте процент ячеек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующую формулу: 100 - ((количество ячеек при D23 / количество ячеек при D21) x 100).

4. Электрофизиологический учет

1. Выполните электрофизиологическую запись с помощью коммерческой системы и коммерчески доступного программного обеспечения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты проводились с МЭА, который состоял из электродов диаметром 30 мкм, расположенных на 100 мкм.
2. Выполните первую электрофизиологическую запись на глутаматергических нейронах в D21 перед посевом клеток pHGG. Используйте дифференцированные глутаматергические нейроны в качестве контроля и культивируйте их отдельно параллельно с кокультурой. Выполните вторую запись для обоих условий, как описано в следующем шаге под номером 3.
3. Выполните вторую электрофизиологическую запись на D23 (после 2 дней совместной культивации).

5. Электрофизиологическая обработка данных

1. Фильтруйте необработанные данные с помощью полосового фильтра Баттерворта ^2-го порядка (с частотами полосы пропускания 100 Гц и 2500 Гц).
2. Для обнаружения шипов вычислите средний квадрат корня сигнала за 10 минут записи для каждого электрода и установите порог амплитуды, соответствующий восьмикратному квадратному значению этого среднего корня.
3. Примените алгоритм PTSD (Precision Timing Spike ^Detection25), учитывая максимальную продолжительность 2 мс для одного потенциала действия.
4. Рассмотрим как активный электрод, каждый электрод обнаруживает не менее 5 шипов/мин. Продолжайте анализ, если активны не менее 10% регистрирующих электродов.
5. Разделите количество обнаруженных всплесков на период регистрации, чтобы рассчитать среднюю скорость срабатывания каждого активного электрода. Рассчитайте среднюю скорость стрельбы для каждого независимого эксперимента. В конечном счете, вычислите среднее значение по условию (±SEM) и выразите его как функцию в день записи.
6. Вычислите растровую диаграмму для каждого эксперимента, представляющую события, обнаруженные для каждого активного электрода в зависимости от времени. Затем рассчитайте временные скорости срабатывания (или мгновенные скорости срабатывания) всех активных электродов, что позволит контролировать синхронность активности нейронной сети.
7. Наконец, генерируйте гистограммы с помощью программного обеспечения для количественной оценки и выполняйте сравнения с помощью тестов Kruskal Wallis.

Результаты

До изучения электрических взаимодействий между глутаматергическими нейронами и клетками глиомы были охарактеризованы корковые глутаматергические нейроны, полученные из hiPS, для проверки возможности их культивирования в микрофлюидных устройствах (рисунок 1A

Обсуждение

В этой работе описывается точная функциональная модель in vitro для оценки взаимодействия между кортикальными глутаматергическими нейронами человека, полученными из hiPS, и опухолевыми клетками головного мозга в микрофлюидных устройствах. Одним из важнейших шагов в настоящем проток?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
256MEA100/30iR-ITO-w/o	MCS	256MEA100/30iR-ITO-w/o
40 µm probe for Scepter counter	Dutscher	53750
60 µm probe for Scepter counter	Dutscher	51999
Accutase	Sigma	A6964
Ala -Gln (GlutaMAX)	Sigma	G8541
Axel Observer 7 Microscope	Zeiss	431007-9904-000
Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon®	Dutscher	353109
Class II Biological Safety Cabinet	Thermo Scientific	HERASafe type KS12
Colibri 7 LED	Zeiss	4230529710-000
Cortical Glutamatergic Neurons	BrainXell	BX-0300
DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX	Gibco	31331-028
DMEM/F12 Medium	Sigma	D8437
DPBS 1X	Dutscher	L0615-500
EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3	Nunc	156499
Foetal Bovine Serum (FBS)	Dutscher	500105
GDNF	Peprotech	450-10
Geltrex	Life Technologies	A1413201
Human BDNF	Peprotech	450-02
Incubator	Memmert	IC0150med
MCS InterFace Boarder	MCS	181205-MEA2100-11240
MEA2100	MCS	181205-MEA2100-11240
Micropipette P10	Sartorius	LH-729020
Micropipette P100	Sartorius	LH-729050
Micropipette P1000	Sartorius	LH-729070
Micropipette P200	Sartorius	LH-729060
Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock	Dutscher	33290
MultiChannel Experimenter	MCS	-
N2 Supplement-A	StemCell	7152
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
Neurocult SM1 neuronal supplement	StemCell	5711
Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	030570ACL
Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	032260CL
Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack	Dutscher	134760CL
Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine	Dutscher	X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity	Drummond	4000202/4038202
Pipette for cell culture 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
Pipette for cell culture 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
Plaque chauffante (CultureTemp)	Belart	370151000
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Primovert microscope	Zeiss	415510-1100-000
Scepter (Handheld Automated Cell Counter)	Millipore	PHCC00000
TGF-β1	Peprotech	100-21C
Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352096
Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon®	Dutscher	352070