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要約

最近の研究では、高等度の小児神経膠腫(pHGG)細胞とそれらの相互相互作用に対する神経細胞の影響を明らかにする。本研究は、イン ビトロ モデルの共培養pHGG細胞とグルタミン酸ニューロンの開発を示し、それらの相互作用を模倣するためにそれらの電気生理学的相互作用を記録した。

要約

小児の高等神経膠腫(pHGG)は、急速な陰気予後を運ぶ小児および思春期の脳癌を表す。現在の治療法に対する耐性を克服し、新しい治療法を見つける必要があるため、新薬や治療手順をテストするための インビトロ の設定でできるだけ近い病気をモデル化することは非常に厳しいです。グルタミン酸神経過興奮性を含む基本的な病態生物学的プロセスを研究することは、環境脳とpHGG細胞の相互作用を理解する上で本当の進歩となるだろう。したがって、ニューロン/pHGG細胞相互作用を再現するために、この研究は、ヒト誘発多能性幹細胞(hiPS)由来の細胞質性大細胞性大細胞を区分された微小流体デバイスに共培養する機能 インビトロ モデルの開発と、その電気生理学的修飾を記録するプロセスを示す。最初のステップは、ヒトグルタミン酸細胞を区別し、特徴付けでした。第二に、細胞をpHGG由来細胞株を有するマイクロ流体デバイスで培養した。次に、脳微小環境と神経活動をこのモデルに含め、pHGG細胞がこれらの微小環境ニューロンに及ぼす電気的影響を分析した。電気生理学的記録は、多電極アレイ(MEA)を用いてこれらの微小流体デバイスに結合して、生理学的状態を模倣し、ニューラルネットワーク全体の電気的活動を記録する。神経興奮性の有意な増加は、腫瘍細胞の存在下で下線を引いた。

概要

小児の高等質神経膠腫(pHGG)は、患者の年齢、腫瘍解剖学的位置および拡張、および分子ドライバに応じて、拡張されたジェノティピックおよび現象の多様性を示す1。彼らは、現在利用可能な治療オプションで制御が不十分であり、小児および青年の脳癌に関連する主要な死因である積極的な脳腫瘍である2。したがって、患者の80%以上が診断後2年以内に再発しており、その中央値の生存率は脳の位置とドライバーの突然変異に応じて9〜15ヶ月である。治癒治療の欠如は、実験室での研究のための主要な衝動であり、新しい革新的な治療アプローチの即時の必要性を強調しています。この目的のために、患者由来細胞株(PDCL)は、2次元(2D)線および/または3次元(3D)神経球でpHGG多様性3 を提供することを期待して開発された。それにもかかわらず、これらの患者由来 のインビトロ 細胞培養は、すべての脳可変状況を模倣するわけではない。これらのモデルは、pHGGに典型的に記載されている巨視的および微視的な神経解剖学的環境を考慮していない。

通常、若い小児のpHGGは主にポンチンおよび視床領域で発達しているのに対し、思春期および若年成人のHGGは皮質領域、特に前頭側頭葉1に集中する。小児期におけるこれらの位置特異性は、神経膠腫形成につながる異なる環境と、腫瘍細胞と特異的神経活動との間の複雑なネットワークを伴うようである4,5,6。メカニズムはまだ特定されていないが、pHGGは主にアストログリアおよびオリゴデンドログリア系統の分化軌道に沿って神経前駆細胞から発達する。これらのグリア系統の役割は、ニューロンの単純な構造的サポートに長い間制限されてきたが、神経回路に完全に統合し、脳の構造領域を再編成し、神経回路を改造することができる複雑な双方向グリア神経相互作用を示すことが明らかに確立された4,7,8.さらに、証拠の断片の増加は、中枢神経系(CNS)が脳癌の開始および進行において重要な役割を果たしていることを示している。最近の研究は、分泌された成長因子と直接電気化学的シナプス通信を通じてグリア悪性腫瘍の成長と有糸分裂を促進すると思われる神経活動に焦点を当てた6,9。相互に、高等度の神経膠腫細胞は、増加するグルタミン酸作動性神経活動と神経機能に影響を与え、それらが構造的および電気的に統合された回路の動作を調節する9。そこで、神経細胞の作用を制御する患者由来モデルと新しい神経科学ツールを用いた研究は、神経膠腫の位置、成長、および進行に対する神経活動の回路特異的効果を示した。これらの神経細胞の突起の大部分は、神経膠腫に関与し、グルタミン酸分泌物を介して通信します。.mGluR2またはvGlut1/2などの特異的グルタミン酸バイオマーカーは、一般的に説明される6。

興味深いことに、その分子異質性にもかかわらず、小児および成人の高等級神経膠腫は、グルタミン酸神経活性および神経リジン-3またはBDNF(脳由来神経栄養因子)などの他の分泌因子に対する典型的な増殖反応を示す4,6,6,10,11,12,13.皮質領域では、小児および成人HGGは、グルタミン酸分泌の増加を介して神経過励起を誘発し、てんかんネットワーク活動に関連する神経膠腫につながるGABAインターニューロンを阻害する14,15。その上、神経回路は、例えば、言語などの特定の神経学的タスクを押す神経膠腫によって改造することができ、追加の組織化された神経活動を要求することができます9。

この根拠に基づいて、神経膠腫細胞とニューロン間の双方向通信の理解を進め、インビトロpHGGアプローチの初期段階で完全に解明し、統合されなければならない。このような革新的なモデリングは、薬物検査中の神経細胞の電気活動への影響を理解し測定し、脳回路へのpHGG応答を予測する上で極めて重要です。マイクロ流体デバイスやpHGG研究などの神経科学ツールの最近の発展は、新しいモデリングアプローチを開発し、インビトロpHGGモデル3、16、17、18、19に脳微小環境を統合することができるベッドです。多電極アレイ(MEA)を用いた電気生理学的記録と組み合わせることで、マイクロ流体デバイス20,21,22は、ニューラルネットワーク全体の電気的活動を記録しながら生理的条件を模倣し、いくつかの条件下でネットワーク接続パラメータを抽出する可能性を提供します。この装置23,24は最初にMEAの直接の部屋の細胞の精密な沈着を可能にする。この技術により、MEA上の細胞播種密度と均質性の制御と、ヒト神経前駆物質のデバイスへの直接分化にとって重要なステップであるメディア交換の細かい制御が可能になります。また、この堆積チャンバは、異なる時点で複数の細胞で播種することができる。

そこで本研究は、ヒト多能性幹細胞(hiPS)由来の多能性幹細胞(hiPS)由来の皮質グルタマ作動性ニューロンおよびpHGG由来細胞をマイクロ流体デバイスに共培養する機能インビトロモデルを開発し、それらの電気的活性を記録して、両細胞集団間の電気的相互作用を評価することを目的とした。まず、hiPS由来の皮質グルタミン酸ニューロンを得て、培養の異なる段階でマイクロ流体デバイスで特徴付け[4日目(D4)、hiPS細胞として、および23日目(D23)、グルタマチル化成熟ニューロンとして。共培養の第2段階では、2つのpHGGモデルが使用された:市販された小児UW479ラインおよびpHGG細胞は患者腫瘍から開始された(BT35)3、H3.3 K27Mドライバー突然変異を有する。最後に、同じマイクロ流体装置への共培養の48時間後にpHGG細胞播種とD23の前にD21でグルタミン酸細胞の電気生理学的記録を行った。グルタミン酸ニューロンとpHGG細胞との相互作用は、記録された電気生理学的活性の有意な増加によって特徴付けられていた。

プロトコル

このプロトコルでは、人間の材料の使用に関連する認定番号はDC-2020-4203です。

1. マイクロ流体装置の製造、準備および処理

  1. 従来のフォトリソグラフィ技術を用いてSU-8金型を製造する18。
    注:この目的のために、2つのフォトリソグラフィマスクは、シリコンウエハー基板上にフォトレジスト構造の2つの層を構築するように設計されており、薄いSU-8 2005フォトレジスト層(高さ3.2 μm、幅6±1μm)を、SU-8 2100(高さ200μm)で作られたメインチャンネルのパターン化の下で非対称マイクログルーヴを定義します。 および 13 mm の長さ)( 補足図 S1 を参照)。
  2. プラズマクリーナー(5.00e-1トル、高周波(RF)レベル)を1分間使用してウェハを作動させ、アルミニウムフォルダ内の1mL(トリクロロ(1H,1H,2H、2H-パーフルオロオクチル)シランを30分間デシケーターにしてシルナイズします。
  3. ポリジメチルシロキサン(PDMS)の10:1比を調製し、プレポリマーと触媒を混合し、真空デシケーターに入れて閉じ込められた気泡を取り除き、80°Cのオーブンで40分間硬化する前にゆっくりと金型に投射します。
  4. その後、カビを剥がす前に、目的のサイズでカミソリを使用して切ります。入口と出口ゾーンをパンチアウトして3mm幅の穴を開け、PDMSを清掃し、粘着テープを使用して保護します。
    メモ:最終的なPDMSデバイスの厚さは約5mmです。
  5. プラズマクリーナー(5.00e-1トル、1分間の高いRFレベル)を使用してデバイスを扱い、ポリスチレンペトリ皿で組み立て、30分間UV光の下で真空を露出させます。
  6. 70%エタノールで使用する前にマイクロ流体装置の入口をピペットで充填し、吸引をピペットして空にします。
  7. Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)を入口貯留剤を添加してマイクロ流体装置を洗浄し、吸引を3回連続してピペッティングして空にします。
  8. 0.05 mg/mL ポリD-リジンを使用してデバイスをコーティングし、インキュベーター(37°C、5%CO2)に入れてください。24時間後、入口貯留層に神経基底培地を加えて装置をすすいで、吸引を3回連続してピペットで空にする。
  9. マイクロ流体チップを細胞培養培地で満たし、最大2時間使用するまで室温のままにしておきます。

2. マイクロ流体装置における細胞調製および播種

  1. ヒトhiPS由来皮質グルタミン酸ニューロンの培養、播種、免疫蛍光特性
    注:製品化hiPS由来皮質グルタミン酸ニューロン()図1A).人間由来の資料を保存し、承認を得て、法律のガイドラインの下でそれらを処理します。
    1. マイクロ流体デバイスの入口と出口の貯留層を、播種前にピペット吸引で空にし、デバイスのチャネルのみを培地で満たします。
    2. 6.5 x 106のhiPS細胞/mL懸濁液(例えば、900セル/mm2濃度)の10μLを表1に示した培地で10μL(例えば900セル/mm2濃度)に入れて0日目(D0)にhiPS細胞をシードし、細胞が付着できるように15分間(室温で)ボンネットの下に置きます。
    3. 15分後、全組成を 表1に示した50μLのD4培養培地で入口および出口の両方のリザーバを充填し、装置をインキュベーター(37°C、5%CO2)に移します。
    4. グルタミン酸作動性ニューロン分化を23日間維持し(図1A(1)、顕微鏡検査)制御された環境下(37°C、5%CO2)、特定の細胞培養培地を用いて、その組成を 表1に記載する。次の手順5で説明されているように、メディアを定期的に交換してください。下の図 1B の手順を次に 示します。
    5. 表1の構成に続く3~4日ごとに培地を交換してください。培地はD4、D4培地はD7まで、D7培地はD11まで、D11培地は培養残存時間に使用する。
    6. 標準的な位相コントラスト顕微鏡を使用してD4、D21、D23で顕微鏡写真を撮り、細胞の生存率を評価し、細胞数を計ることを可能にします。
    7. 特性評価のために、分化したグルタミン酸細胞を、中型吸引後の室温で30分間、4%パラホルムアルデヒド(PFA)に固定し、免疫蛍光染色のプロトコルに従ってください。
    8. リン酸緩衝生理食塩血(PBS)で細胞を3回洗浄し、0.1%トリトンXで10分間透過し、30分に30分、牛血清アルブミン(BSA)を使用します。一次抗体を添加し、4°Cで一晩デバイスをインキュベートします。
    9. 細胞をPBSで3回リンスし、室温で2時間対応する二次抗体でさらにインキュベートする。
      注: 研究で使用した免疫蛍光抗体を 表2に示します。
    10. PBSで細胞を3回リンスし、DAPI(4',6-diamino-2-フェニリンドール)を室温で10分間カウンターステインします。
    11. CMOS(相補金属-酸化半導体)カメラを装着した反転蛍光顕微鏡で画像を取得し、適切な画像解析ソフトウェアを使用して解析します。
    12. DAPI染色された画像を開き、ソフトウェアのしきい値ルーチンで二項化します。これを行うには、[ イメージ>>のしきい値を調整]をクリックし、適切なパラメータを設定して、核と背景を区別します。次に、[ >プロセス>流域を適用 ]をクリックして、集約核を分割します。
    13. その後、 粒子を解析 するソフトウェアの機能を使用してバイナリイメージを解釈します。これを行うには、 分析 をクリックし、 粒子を分析 し、その後に適切なパラメータを設定します: サイズ と 円形フィルタ (7 μm未満、20 μmより大きい、または0.1 μm未満の円形度を持つ解析対象から除外)。
    14. DAPI分析から得られた輪郭画像を対応する免疫蛍光画像にマージして、正しい染色を検証します。
    15. 最後に、異なるバイオマーカーに関連するデータ(オブジェクト数、平均面積、カバレッジの割合など)を保存し、適切な定量ソフトウェアを使用してD4および/またはD21で式を定量化します。
  2. 市販のpHGGライン、UW479、および患者由来細胞株の細胞培養、BT353
    1. DMEM/F-12グルタマックスの両方の細胞株を、細胞培養フラスコで10%ウシ胎児血清(FBS)を補充した。 図1Cに示すように、各細胞株の80%の合流を待ちます。
    2. これらのpHGG細胞は、実験を通してノルモキシ条件で37°Cで制御された環境下で維持します。

3. コカルチャープロトコル

  1. UW479およびBT35細胞株の播種日と濃度を調整し、共培養が開始される必要がある場合にコンフルエント細胞の80%に達し、グルタミン酸ニューロンの培養21日間に対応する。
  2. UW479およびBT35細胞をトリプシン化し、成熟したグルタミン酸ニューロンを含むマイクロ流体デバイスにpHGG細胞を播種する前に、各専用のマイクロ流体デバイス(各細胞タイプに対して900細胞/mm2 の目標密度を有する)のグルタミン酸ニューロンの上に播種する。
  3. グルタミン酸ニューロンD11および上の培地を用いて制御された環境(37°C、5%CO2)下で2日間の共培養を 維持し、表1に詳述した培地を維持する。
  4. 画像解析ソフトウェアで分析された顕微鏡写真を使用してpHGG細胞をカウントし、生存率を評価します。セルの割合を計算します。
    注: 次の数式を使用してください: 100 - (D23 でのセルの数 / D21 のセル数) x 100。

4. 電気生理学的記録

  1. 市販のシステムおよび市販のソフトウェアで電気生理学的記録を行います。
    注:実験は、直径30μmの電極を100μmで構成するMEAを用いて行いました。
  2. pHGG細胞の播種前にD21でグルタミン酸細胞に対して最初の電気生理学的記録を行う。分化されたグルタミン酸ニューロンをコントロールとして使用し、共培養と並行してそれらを単独で培養する。次のステップ番号 3 で説明されているように、両方の条件に対して 2 回目の記録を行います。
  3. D23で第2の電気生理学的記録を行う(2日後の共培養)。

5. 電気生理学的データ処理

  1. 2次 バンドパスバターワースフィルタ(100 Hzと2500 Hzの通過帯域周波数)で生データをフィルタリングします。
  2. スパイク検出では、各電極の10分間の記録を通して信号の二乗平均平方根を計算し、このルート平均の平方値の8倍に相当する振幅閾値を設定します。
  3. 1 つのアクションの可能性について、最大 2 ミリ秒の期間を考慮して、PTSD (高精度タイミングスパイク検出25) アルゴリズムを適用します。
  4. 各電極は、少なくとも5スパイク/分を検出する活性電極として考えます。記録電極の少なくとも10%が活性である場合は、アッセイを続ける。
  5. 検出されたスパイクの数を記録の期間で割って、各活性電極の平均焼成速度を計算する。独立した実験ごとに平均平均発射速度を計算します。最終的には、条件(±SEM)で平均を計算し、記録の日に関数として表現します。
  6. 各アクティブ電極で検出されたイベントを時間の関数として表す各実験のラスタープロットを計算します。次に、全ての活性電極の時間配列全体の焼成速度(または瞬時焼成率)を計算し、ニューラルネットワーク活動のシンクロニシティを監視することを可能にする。
  7. 最後に、定量化ソフトウェアを使用して棒グラフを生成し、Kruskal Wallis検定を使用して比較を行います。

結果

グルタミン酸細胞とグリオーマ細胞の間の電気的相互作用を研究する前に、hiPS由来の皮質グルタミン酸ニューロンは、マイクロ流体デバイスでそれらを培養する可能性を検証することを特徴としていた(図1A)。これらの特性評価は、図1A(2-7)に示されるネスチン、Sox2、mGlurR2(代謝刺激性グルタミン酸受容体2)、およびvG...

ディスカッション

本研究は、ヒトhiPS由来の皮質グルタミン酸ニューロンと脳腫瘍細胞との間の微小流体デバイスにおける相互作用を評価するための正確な機能イン ビトロ モデルを説明する。本プロトコルの重要なステップの1つは、グルタマ作動性ニューロンにおけるhiPS分化であり、これはネスチンとSox2免疫蛍光染色の減少とmGluR2およびvGLUT1染色の同時出現によって確認された。それにもかかわらず?...

開示事項

AB、MG、JR、LM、ML、JV、DDはネットリに採用され、FLはネットリの最高技術責任者であり、THはNETRIの最高科学責任者です。他の著者は開示するものは何もない。

謝辞

この作品は、サット・コネクトゥス・プログラム、フォンダシオン・ド・ラ・ヴェルシオン・ド・ストラスブール、«J'ai demandé la lune»、«ウネ・ルーラードはチャーライン»、«ライフピンク»、«フランク、レーヨン・ド・ソレイユ»と«セムール・デ・エトワール»協会からの助成金によって支えられました。HGGの影響を受けた子どもたちやご家族の皆様のご支援に感謝申し上げます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
256MEA100/30iR-ITO-w/oMCS256MEA100/30iR-ITO-w/o
40 µm probe for Scepter counter Dutscher53750
60 µm probe for Scepter counter Dutscher51999
AccutaseSigmaA6964
Ala -Gln (GlutaMAX)SigmaG8541
Axel Observer 7 MicroscopeZeiss431007-9904-000
Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon®Dutscher353109
Class II Biological Safety CabinetThermo ScientificHERASafe type KS12
Colibri 7 LEDZeiss4230529710-000
Cortical Glutamatergic Neurons BrainXellBX-0300
DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAXGibco31331-028
DMEM/F12 MediumSigmaD8437
DPBS 1XDutscherL0615-500
EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3Nunc156499
Foetal Bovine Serum (FBS)Dutscher500105
GDNFPeprotech450-10
GeltrexLife TechnologiesA1413201
Human BDNFPeprotech450-02
IncubatorMemmertIC0150med
MCS InterFace BoarderMCS181205-MEA2100-11240
MEA2100MCS181205-MEA2100-11240
Micropipette P10SartoriusLH-729020
Micropipette P100SartoriusLH-729050
Micropipette P1000SartoriusLH-729070
Micropipette P200SartoriusLH-729060
Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-LockDutscher33290
MultiChannel ExperimenterMCS-
N2 Supplement-AStemCell7152
Neurobasal MediumLife Technologies21103049
Neurocult SM1 neuronal supplementStemCell5711
Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack Dutscher030570ACL
Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack Dutscher032260CL
Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rackDutscher134760CL
Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamineDutscherX0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP GravityDrummond4000202/4038202
Pipette for cell culture 10 mL Falcon® Dutscher357551
Pipette for cell culture 5 mL Falcon® Dutscher357543
Plaque chauffante (CultureTemp)Belart370151000
Poly-D-LysineSigmaP6407
Primovert microscopeZeiss415510-1100-000
Scepter (Handheld Automated Cell Counter)MilliporePHCC00000
TGF-β1Peprotech100-21C
Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® Dutscher352096
Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® Dutscher352070

参考文献

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