دراسات التفاعلات Chaperone-Cochaperone باستخدام المتجانسة حبة القائم على المقايسة

Summary

يقدم هذا البروتوكول تقنية للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والبروتين باستخدام حبات المانحين المرتبطة بالجلوتاثيون مع مرافقين مشاركين من TPR-motif من GST وخرزات مقبولة إلى جانب ببتيد مشتق من Hsp90. لقد استخدمنا هذه التقنية لفحص الجزيئات الصغيرة لتعطيل تفاعلات Hsp90-FKBP51 أو Hsp90-FKBP52 وحددنا مثبطات تفاعل Hsp90-FKBP51 القوية والانتقائية.

Abstract

استهداف بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) - التفاعلات cochaperone يوفر إمكانية لتنظيم العمليات على وجه التحديد Hsp90 تعتمد داخل الخلايا. وPENtapeptide MEEVD المحفوظة في C-terminus من Hsp90 هو المسؤول عن التفاعل مع تكرار رباعية التريتريكبتيد (TPR) عزر المرافقين المشاركين. بروتين FK506 ملزمة (FKBP) 51 و FKBP52 هما مماثلة TPR عزر المرافقين المشاركين المشاركين في الأمراض التي تعتمد على هرمون الستيرويد مع وظائف مختلفة. لذلك ، فإن تحديد الجزيئات التي تمنع التفاعلات بين Hsp90 و FKBP51 أو FKBP52 يوفر إمكانات علاجية واعدة للعديد من الأمراض البشرية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتضخيم القرب الإنارة المقايسة متجانسة للتحقيق التفاعلات بين Hsp90 وشريكها المرافقين FKBP51 و FKBP52. أولا، قمنا بتنقية البروتينات المحتوية على TPR FKBP51 و FKBP52 في شكل الجلوتاثيون S-transferase (GST) الموسومة. باستخدام حبات المانحين المرتبطة الجلوتاثيون مع البروتينات TPR-عزر GST تنصهر والخرز مقبول إلى جانب 10 مير C-محطة الببتيد من Hsp90, لقد بحثت التفاعلات البروتين البروتين في بيئة متجانسة. لقد استخدمنا هذا المقايسة لفحص الجزيئات الصغيرة لتعطيل تفاعلات Hsp90-FKBP51 أو Hsp90-FKBP52 وحددنا مثبطات تفاعل Hsp90-FKBP51 القوية والانتقائية.

Introduction

المرافقين الجزيئية تسهم في التوازن البروتين، بما في ذلك طي البروتين، والنقل، والتدهور. وهي تنظم العديد من العمليات الخلوية وترتبط بالعديد من الأمراض مثل السرطان والأمراض العصبية^1. بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) هي واحدة من أهم المرافقين الذين تعتمد وظيفتهم على التغيرات تشكيلية مدفوعة تحليل هيدروليسيس ATP وملزمة مع البروتينات العميل بوساطة المرافقين المشاركين². على الرغم من الإمكانات الواضحة ل Hsp90 كهدف علاجي ، فإن ضبط وظيفته يمثل تحديا كبيرا. هناك العديد من مثبطات Hsp90 التي تستهدف منطقة ربط ATP N-terminal ، والتي تم تقييمها في التجارب السريرية ، ولكن لم تتم الموافقة على أي منها للتسويق³. نظرا لعدم وجود جيب ملزم ليغاند محددة جيدا⁴، واستهداف منطقة C-محطة Hsp90 كان نجاحا محدودا⁴. في الآونة الأخيرة ، تم التحقيق في تعطيل تفاعلات Hsp90-cochaperone بواسطة جزيئات صغيرة كاستراتيجية بديلة⁵. استهداف التفاعلات Hsp90-cochaperone لن تثير استجابة الإجهاد الخلية العامة ويوفر إمكانية لتنظيم العمليات داخل الخلايا على وجه التحديد. وPENtapeptide MEEVD المحفوظة في C-terminus من Hsp90 هو المسؤول عن التفاعل مع تكرار رباعية الترغيببتيد (TPR) عزر المرافقين المشاركين⁶. من 736 TPR البروتينات التي تحتوي على عزر المشروح في قاعدة بيانات البروتين البشري، ~ 20 البروتينات المختلفة تتفاعل مع Hsp90 عبر هذا الببتيد⁷. الجزيئات المتنافسة على MEEVD الببتيد ملزمة من شأنه أن يعطل التفاعلات بين Hsp90 والمرافقين المشاركين التي تحتوي على مجال TPR. يحتوي موقع ربط الببتيد على بنية ثالثة مماثلة ولكن التماثل العام بين نطاقات عزر TPR المختلفة منخفض نسبيا⁷، مما يوفر فرصة لتحديد الجزيئات القادرة على منع التفاعلات بين Hsp90 والمرافقين المشاركين في TPR-motif. من بين هذه TPR عزر المرافقين المشاركين, FK506 ملزمة البروتين (FKBP) 51 و FKBP52 هي المنظمين لمستقبلات هرمون الستيرويد (SHR) الإشارات والمشاركة في العديد من الأمراض التي تعتمد على هرمون الستيرويد بما في ذلك السرطان, الأمراض المرتبطة بالإجهاد, أمراض التمثيل الغذائي, ومرض الزهايمر⁸. على الرغم من أن FKBP51 و FKBP52 يشتركان > تشابه تسلسلي بنسبة 80٪، إلا أن وظائفهما تختلف: FKBP52 هو منظم إيجابي لنشاط SHR، في حين أن FKBP51 هو منظم سلبي في معظم الحالات⁸. لذلك ، فإن تحديد الجزيئات ، على وجه التحديد منع التفاعلات بين Hsp90 و FKBP51 أو FKBP52 ، يوفر إمكانات علاجية واعدة للأمراض ذات الصلة.

تمتطوير Luminescent Proximity Homogenous A ssay(AlphaScreen) لأول مرة في عام 1994 من قبل أولمان EF وآخرون. الآن يتم استخدامه على نطاق واسع للكشف عن أنواع مختلفة من التفاعلات البيولوجية، مثل الببتيد^10،البروتين^11،الحمض النووي^12،RNA^13،والسكر¹⁴. في هذه التقنية، هناك نوعان من الخرز (قطرها 200 نانومتر)، واحد هو حبة المانحة والآخر هو حبة المقبول. يتم شل الجزيئات الحيوية على هذه الخرز؛ تفاعلاتها البيولوجية تجلب الخرز المانحة والمقبل في القرب. في 680 نانومتر، ينير حساس للضوء في حبة المتبرع ويحول الأكسجين إلى أكسجين مفرد. لأن الأكسجين المفرد له عمر قصير ، فإنه يمكن أن ينتشر فقط حتى 200 نانومتر. إذا كان حبة المقبول على مقربة، مشتق ثيوكسيني يتفاعل مع الأكسجين المفرد توليد chemiluminescence في 370 نانومتر. هذه الطاقة ينشط كذلك الفلوروفوريس في حبة المقبول نفسه لتنبعث منها ضوء في 520-620 نانومتر¹⁵. إذا تعطلت التفاعلات البيولوجية ، لا يمكن أن تصل حبة المقبول وخرزة المتبرع إلى القرب ، مما يؤدي إلى تسوس الأكسجين المفرد والإشارة المنخفضة المنتجة.

هنا نحن نصف بروتوكول باستخدام هذه التقنية لفحص جزيئات صغيرة تمنع التفاعلات بين Hsp90 و TPR المرافقين المشاركين، وخاصة FKBP51 و FKBP52. يتم إرفاق الببتيدات 10 الأحماض الأمينية طويلة المقابلة لHsp90 المدقع C-terminus إلى حبات acceptor. يتفاعل المرافقون المشاركون في TPR الموسومون ب GST المنقى مع حبات المتبرعين المرتبطة بالجلوتاثيون. عندما التفاعل بين الببتيدات Hsp90 المشتقة وتي بي آر عزر المرافقين المشارك يجمع الخرز معا، يتم إنتاج إشارة مكبرة(الشكل 1A). إذا كانت الجزيئات الصغيرة التي تم فحصها يمكن أن تمنع التفاعلات بين Hsp90 و TPR-motif المرافقين المشاركين، سيتم تقليل هذه الإشارة مكبرة(الشكل 1B). ويمكن حساب IC₅₀ من خلال القياس الكمي. يمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول ليشمل أي مرافق - تفاعلات مرافق مشارك في TPR-motif ذات أهمية كبيرة في تطوير جزيئات جديدة ، مما يمنع على وجه التحديد التفاعل بين Hsp90 و FKBP51 أو FKBP52.

الشكل 1:المبدأ الأساسي لهذا المقايسة. (أ) تنقية GST-FKBP51 يتفاعل مع حبات المانحين المرتبطة الجلوتاثيون. يتم إرفاق الببتيدات 10 الأحماض الأمينية طويلة المقابلة لC-terminus المتطرفة من Hsp90 إلى حبات acceptor. التفاعل بين الببتيدات المشتقة من Hsp90 ومجال TPR من FKBP51 يجعل المتبرع والخرز المقبول في القرب. في 680 نانومتر، ينير حساس للضوء في حبة المتبرع ويحول الأكسجين إلى أكسجين مفرد. مشتق الثيوكسيني على حبة المقبول يتفاعل مع الأكسجين المفرد ويولد chemiluminescence في 370 نانومتر. هذه الطاقة ينشط كذلك الفلوروفوريس في حبة المقبول نفسه لتنبعث منها الضوء في 520-620 نانومتر. (ب)عندما تمنع الجزيئات الصغيرة التفاعلات بين Hsp90 و FKBP51 ، لا يمكن للخرز المانح والمقبل الوصول إلى القرب. ثم الأكسجين المفرد مع تسوس العمر القصير ، ولا يتم إنتاج إشارة يمكن اكتشافها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

ملاحظة: يتم عرض نظرة عامة حول هذا البروتوكول في الشكل 2.

1. التعبير وتنقية GST-FKBP51 وGST-FKBP52 (الشكل 2A)

1. البلازميدات
   ملاحظة: الحصول على استنساخ cDNA لFKBP51 الإنسان (معرف استنساخ: 5723416) وFKBP52 الإنسان (استنساخ معرف: 7474554) من اتحاد IMAGE.
   1. تضخيم الحمض النووي FKBP51 الإنسان من قبل PCR مع التمهيديات (إلى الأمام؛ 5'GGATCCATGACTACTGAGGT-3'، عكس؛ 5'-CTCGAGCTATGCCTCTCTCTCCAC-3') التي تحتوي على بامهي وXhoI يتدلى واستنساخ في ناقلات pGEX6-1 في مواقع تقييد BamHI / XhoI.
   2. تضخيم الحمض النووي FKBP52 الإنسان من قبل PCR مع التمهيديات (إلى الأمام؛ 5'-GAATTCATGAGCCGAGAGGG-3'، عكس؛ 5'CTCGAGCTATGCCTCTCTCCAC-3') التي تحتوي على EcoRI وXhoI يتدلى واستنساخ في ناقلات pGEX6-2 في مواقع تقييد EcoRI / XhoI.
      ملاحظة: إعداد رد فعل PCR وتظهر الشروط في الجدول 1 والجدول 2.
   3. تحقق من التسلسل المدرج وتحويل البلازميدات إلى الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا وفقا لبروتوكول التصنيع.
2. التعبير عن البروتين وتنقية
   1. إضافة 25 غرام من مرق لوريا (LB) قاعدة في 1 لتر من الماء المقطر لجعل الحل LB. الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد التبريد، أضف 50 ميكروغرام/مل أمبيسلين.
   2. خذ مستعمرة من البكتيريا التي تعبر عن GST-FKBP51 أو GST-FKBP52 واخلطها مع 500 ميكرولتر من محلول LB في أنبوب 1.5 مل. دوار.
   3. إضافة خليط من "1.2.2" إلى 1 لتر من حل LB في قارورة Erlenmeyer مغطاة رقائق الألومنيوم. احتضان قارورة Erlenmeyer في شاكر بين عشية وضحاها في 37 °C.
   4. حث تعبير البروتين بإضافة 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) إلى قارورة إرلينماير ومواصلة الحضانة لمدة 2 ساعة أخرى.
   5. للحصول على الكريات الخلية، والطرد المركزي في 5000 × ز لمدة 15 دقيقة. أزل الناتنات الفائق.
      ملاحظة: يمكن تخزين الكريات الخلية في -20 درجة مئوية.
   6. Resuspend الكريات الخلية في 40 مل من برنامج تلفزيوني و sonicate 3 × 20 ق على الجليد. إضافة 1 mM PMSF, 1 mM EDTA, و كوكتيل مثبطات بروتيز (1 قرص) لمنع انحلال البروتين.
   7. الطرد المركزي تعليق لمدة 30 دقيقة 50،000 × ز لإزالة حطام الخلية وتطبيق supernatant على 5 مل GST فخ العمود.
   8. بعد غسل العمود مع 30 مل برنامج تلفزيوني، elute GST-FKBP51 وGST-FKBP52 مع 5 مل من الجلوتاثيون 10 mM في برنامج تلفزيوني.
   9. تركيز البروتينات على وحدة الطرد المركزي 15 مل 10.000 MWCO. لإزالة الجلوتاثيون الحر، يمر المركزات من خلال عمود PD-10 متساوية مع برنامج تلفزيوني 0.5x والتركيز مرة أخرى على جهاز الطرد المركزي مرشح.
   10. جمع الكسور المحتوية على البروتين. تحقق من البروتينات في SDS-PAGE وضبط تركيزات البروتين إلى 1 ملغم / مل.
       ملاحظة: العائد البروتين النموذجي هو 2-5 ملغم / لتر الثقافة. يمكن تخزين البروتين عند -20 درجة مئوية.

2. اقتران Hsp90 C-محطة الببتيد إلى حبات المقبول (الشكل 2B)

1. Hsp90 إعداد الببتيد
   1. توليف عشرة حمض أميني الببتيد NH₂-EDASRMEEVD-COOH المقابلة للأحماض الأمينية 714-724 من الإنسان Hsp90 بيتا isoform (UniProt معرف: P08238) من قبل خدمة توليف الببتيد.
   2. تمييع الببتيد Hsp90 في برنامج تلفزيوني إلى 1 ملغ / مل التركيز.
2. إعداد حبات المقبول
   1. تمييع حبات المقبول غير المترافقة في PBS إلى تركيز 1 ملغم / مل ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل.
   2. قم بإجراء الغسيل عن طريق الطرد المركزي على 16,000 × ز لمدة 15 دقيقة. إزالة بعناية فائقة.
3. الاقتران
   1. تعيين النسبة بين الخرز والببتيد كما 10:1. في أنبوب 1.5 مل يحتوي على 1 ملغ من بيليه حبة المقبول (أعدت على النحو المبين أعلاه)، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4)، 0.1 ملغ من الببتيد المخفف، 1.25 ميكرولتر من توين-20، 10 ميكرولتر من محلول 400 مللي متر من الصوديوم سيانوبوروهيدريد (NaBH₃CN) في الماء.
      تنبيه: NaBH3CN سامة. استخدام غطاء الدخان والقفازات. وينبغي إعداد NaBH₃CN الحل حديثا.
   2. احتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية مع نهاية الإفراط في نهاية التحريض (10-20 دورة في الدقيقة) على شاكر دوارة.
4. رد فعل إخماد وغسل الخرز
   1. إضافة 20 ميكرولتر من محلول 1 M Tris-HCl (pH 8.0) إلى رد الفعل لمنع المواقع غير المتفاعلة. حضانة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
   2. جهاز طرد مركزي بسرعة 16,000 × غرام (أو السرعة القصوى) لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه حبة في 1 مل من الحل تريس-HCl (100 mM, pH 8.0).
   3. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات.
   4. بعد الطرد المركزي الأخير، إعادة إنفاق الخرز في 1 ملغم/ مل في المخزن المؤقت (1 مل من 0.5 × برنامج تلفزيوني مع 0.01٪ من أزيد الصوديوم كمادة حافظة). تخزين حل حبة المقبول المترافق في ضوء 4 درجة مئوية محمية.
      تنبيه: أزيد الصوديوم سام. استخدام غطاء الدخان والقفازات.

3. الفحص التحقيق في التفاعل بين GST-FKBP51 أو GST-FKBP52 وHsp90 C-محطة الببتيد، وتثبيط مع المركبات الصغيرة الكتلة الجزيئية (الشكل 2C)

1. البروتينات الموسومة ب GST التي تتفاعل مع حبات المتبرعين بالجلوتاثيون
   1. إعداد ردود الفعل في لوحات 384 بئر.
   2. إعداد الحل الذي يحتوي على 10 ميكروغرام / مل من حبات المانحة الجلوتاثيون في برنامج تلفزيوني 0.5x، درجة الحموضة 7.4.
      ملاحظة: بعد التخزين لفترات طويلة، والخرز يستقر وتحتاج إلى دوامة.
   3. إضافة GST-FKBP51 أو GST-FKBP52 إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام/مل.
   4. احتضان في الظلام في 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، سوف تتفاعل البروتينات الموسومة ب GST مع الجلوتاثيون المرفق بالخرز. لكل بئر، سيتم استخدام 22.5 ميكرولتر من هذا الخليط. ويجب تحديد تركيز الشركاء الملزمين تجريبيا. Titrate GST-FKBP51 و GST-FKBP52 واختيار التركيز الذي يعطي أفضل إشارة.
2. إضافة مركبة
   1. جعل التخفيفات التسلسلية من مركبات الاختبار في DMSO.
      ملاحظة: عادة ما تكون التركيزات المستخدمة 10 و30 و100 و300 و1000 و3000 ميكرومتر.
   2. إضافة 0.25 ميكرولتر من DMSO (التحكم السلبي) أو Hsp90 C-محطة الببتيد (التحكم الإيجابي، 30 ميكرومتر) أو مركبات في DMSO إلى زاوية كل بئر من لوحة. استخدام ثلاثية لكل تركيز مركب.
   3. إضافة 22.5 ميكرولتر من الحل الذي يحتوي على حبات المانحة الجلوتاثيون مع البروتينات GST الموسومة إلى كل بئر.
   4. يهز لوحة بلطف مع اليد ولكن بدقة. احتضان في الظلام في 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: خلال هذا الوقت، سوف تتفاعل المركبات مع مجال TPR في موقع ربط الببتيد C-terminal Hsp90.
3. إضافة حبات مقبولة
   1. تمييع الخرز المقبول مع الببتيد Hsp90 C-terminal المرفقة إلى 100 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني 0.5x.
   2. إضافة 2.25 ميكرولتر من حبات المقبول المخفف إلى كل بئر.
   3. تخلط بلطف ولكن بدقة. احتضان في الظلام في 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم إحضارها من قبل المانحين والخرز المقبول في القرب من التفاعلات البروتين الببتيد. الحجم النهائي لخليط التفاعل هو 25 ميكرولتر. لذلك، تتراوح التركيزات النهائية للمركبات من 0.1 إلى 30 ميكرومتر.
4. قراءة اللوحة
   ملاحظة: قراءة لوحة باستخدام قارئ لوحة تعيين في الوضع ذي الصلة.
   1. تشغيل الأداة وفتح البرنامج
   2. اختر البروتوكول ذي الصلة.
   3. انقر فوق تحرير خريطة اللوحة وحدد البئر المستخدم في اللوحة للقياس.
   4. انقر فوق التالي للمتابعة وتشغيل البروتوكول المحدد.
   5. بعد القياس، انقر فوق إظهار النتائج لعرض النتائج.
   6. تصدير البيانات.

4. تحليل البيانات

1. Z' عامل و إشارة إلى خلفية (S / B) نسبة
   1. حساب عامل Z ونسبة S/B للمقاايسة باستخدام المعادلة التالية:
      Z'=1-(3σpos+3σneg)/ستينيμpos-μ neg^ستيني عشر
      S/B=μneg/μpos
      حيث σ μ تمثل الانحرافات المعيارية والوسائل الإيجابية (Hsp90 C-محطة الببتيد، 30 ميكرومتر) والسلبية (DMSO) الضوابط، على التوالي. عامل Z > 0.5 سيضمن أن المقايسة قوية بما يكفي للفحص. لمراقبة حساسية المقايسة، تم حساب نسبة S/B أيضا.
2. منحنى الاستجابة الجرعة وIC ₅₀
   ملاحظة: استخدم تحليل الانحدار غير الخطي لاحتواء بيانات مثبطات مؤشر أسعار المنتجين Hsp90-cochaperones حسب البرامج.
   1. إنشاء جدول بيانات XY في الحوار الترحيب وحدد X أرقامو Y Enter 3 (إذا ثلاثية) نسخ القيم في أعمدة جنبا إلى جنب.
   2. تطبيع بيانات إشارة العينات إلى مجموعة التحكم السلبية. استيراد قيم التركيز إلى العمود X وقيم الإشارة إلى العمود ص.
   3. انقر على تحليل واختيار تحويل التركيز (X) ضمن تحويل | تطبيع. اختر تحويل إلى لوغاريتمات.
      ملاحظة: هذا سيتم تحويل التركيز إلى مقياس سجل. إذا كان تركيز البداية صفرا، قم بتعيينه إلى رقم صغير جدا يكون صفرا فعليا (على سبيل المثال، 0.1 nM) بحيث لا يفقد تلك القيم نظرا لعدم تعريف لوغارتم الصفر.
   4. انقر فوق تحليل واختيار الانحدار غير الخطي (منحنى تناسب) تحت التحليلات XY، افتح الجرعة - الاستجابة - تثبيط واختيار سجل (المانع) مقابل الاستجابة -- المنحدر المتغير.
   5. انقر فوق موافق لعرض النتائج (التي تحتوي على قيمة_{IC 50)} والرسوم البيانية.

الشكل 2: تخطيطي لهذا البروتوكول. (أ) التعبير وتنقية من GST-FKBP51 وGST-FKBP52. (ب) اقتران Hsp90 C-محطة الببتيد إلى الخرز مقبول. (ج)الفحص الذي يتحرى التفاعل بين GST-FKBP51 أو GST-FKBP52 وHsp90 C-terminal الببتيد. تثبيط مع مركبات الكتلة الجزيئية الصغيرة. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

في المقايسة لدينا، عامل Z ونسبة S/ B هي 0.82 و 13.35، على التوالي(الشكل 3A)،مما يدل على أن لدينا المقايسة قوية وموثوق بها لفحص عالية الإنتاجية. ثم استخدمناه لفحص المركبات الجزيئية الصغيرة. الشكل 3B يقدم تثبيط تعتمد على الجرعة من التفاعلات المرافقين-cochaperone مع جزيء صغ?...

Discussion

هنا نصف بروتوكول باستخدام المقايسة لفحص الجزيئات الصغيرة التي تمنع التفاعلات بين Hsp90 و TPR-motif المرافقين المشاركين ، وخاصة FKBP51 و FKBP52. درجة Z العالية (>0.8) توضح متانة وموثوقية تنسيق عالي الإنتاجية. يمكن الحصول على النتائج في غضون ساعة واحدة، وهناك حاجة إلى كميات صغيرة من الخرز والبروتين والمرك?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well plates	Perkin Elmer	6008350	Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit	Millipore	UFC901008	Concentrate protein
Ampicillin	Sigma	A0166	Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010	Heidolph		Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51	Source BioScience	clone id: 5723416	pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52	Source BioScience	clone id: 7474554	pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software	GraphPad Prism	9.0.0	Analysis data and make figures
Data analysis software	Excel		Analysis data
DMSO	Supelco	1.02952.1000	Dilute compounds
DPBS	Gibco	14190-144	Prepare solution
EDTA	Calbiochem	344504	Prevent proteolysis during sonication
Glutathione	Sigma	G-4251	Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads	Perkin Elmer	6765300	Donor bead
GST-trap column	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Thermo Fisher Scientific	R0392	Induce protein expression
LB Broth (Miller)	Sigma	L3522	Microbial growth medium
PCR instrument	BIO-RAD	S1000 Thermal Cycler	Amplification/PCR
PD-10 column	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Solution exchange
pGEX-6P-1 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Plasmid
pGEX-6P-2 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	Plasmid
Plate reader	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Multilabel Reader	Read alpha plate
Plate reader software	Perkin Elmer	EnSpire Manager	Plate reader software
Plate reader software protocol	Perkin Elmer	Alpha 384-well Low volume	Use this protocol to read plate
PMSF	Sigma	P7626	Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail	Sigma	S8830	Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide	Sigma	S2002	As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma	156159	Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform	Peptide 2.0 inc		Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator	LABINCO		Make end-over-end agitation
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20	Sigma	P1379	Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor	Microson		Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads	Perkin Elmer	6762003	Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module	Invitrogen	EI0002	SDS-PAGE