Estudios de interacciones chaperona-cochaperona utilizando un ensayo homogéneo basado en cuentas

Resumen

Este protocolo presenta una técnica para sondear las interacciones proteína-proteína utilizando perlas de donantes ligadas al glutatión con co-chaperonas con motivos TPR fusionadas con GST y perlas aceptoras junto con un péptido derivado de Hsp90. Hemos utilizado esta técnica para detectar moléculas pequeñas para interrumpir las interacciones Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificado inhibidores potentes y selectivos de la interacción Hsp90-FKBP51.

Resumen

Dirigirse a las interacciones proteína de choque térmico 90 (Hsp90)-cochaperona proporciona la posibilidad de regular específicamente los procesos intracelulares dependientes de Hsp90. El pentapéptido MEEVD conservado en el extremo C de Hsp90 es responsable de la interacción con el motivo de repetición tetratricopéptido (TPR) de las co-chaperonas. La proteína de unión a FK506 (FKBP) 51 y FKBP52 son dos co-chaperonas similares con motivos de TPR involucradas en enfermedades dependientes de hormonas esteroides con diferentes funciones. Por lo tanto, la identificación de moléculas que bloquean específicamente las interacciones entre Hsp90 y FKBP51 o FKBP52 proporciona un potencial terapéutico prometedor para varias enfermedades humanas. Aquí, describimos el protocolo para un ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificada para sondear las interacciones entre Hsp90 y sus co-chaperonas asociadas FKBP51 y FKBP52. En primer lugar, hemos purificado las proteínas FKBP51 y FKBP52 que contienen motivos TPR en forma marcada con glutatión S-transferasa (GST). Utilizando las perlas de donantes ligadas al glutatión con proteínas con motivo tPR fusionadas con GST y las perlas aceptoras junto con un péptido C-terminal de 10 mer de Hsp90, hemos sondeado las interacciones proteína-proteína en un entorno homogéneo. Hemos utilizado este ensayo para detectar moléculas pequeñas para interrumpir las interacciones Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificado inhibidores potentes y selectivos de la interacción Hsp90-FKBP51.

Introducción

Las chaperonas moleculares contribuyen a la homeostasis de las proteínas, incluido el plegamiento, el transporte y la degradación de las proteínas. Regulan varios procesos celulares y están vinculados a numerosas enfermedades como el cáncer y las enfermedades neurodegenerativas¹. La proteína de choque térmico 90 (Hsp90) es una de las chaperonas más importantes cuya función depende de cambios conformacionales impulsados por la hidrólisis de ATP y la unión con proteínas cliente mediadas por sus co-chaperonas². A pesar de un potencial obvio de Hsp90 como objetivo terapéutico, ajustar su función representa un gran desafío. Hay varios inhibidores de Hsp90 dirigidos a la región de unión a ATP N-terminal, que han sido evaluados en ensayos clínicos, pero ninguno de ellos ha sido aprobado para su comercialización³. Debido a la falta de un bolsillo de unión al ligando bien definido^4,apuntar a la región C-terminal de Hsp90 ha tenido un éxito limitado⁴. Recientemente, la interrupción de las interacciones Hsp90-cochaperona por moléculas pequeñas se ha investigado como una estrategia alternativa⁵. Apuntar a las interacciones Hsp90-cochaperona no provocaría una respuesta general al estrés celular y brinda la posibilidad de regular específicamente varios procesos intracelulares. El pentapéptido MEEVD conservado en el extremo C de Hsp90 es responsable de la interacción con el motivo de repetición tetratricopéptido (TPR) de las co-chaperonas⁶. De las 736 proteínas que contienen motivos TPR anotadas en la base de datos de proteínas humanas, ~ 20 proteínas diferentes interactúan con Hsp90 a través de este péptido⁷. Las moléculas que compiten por la unión al péptido MEEVD interrumpirían las interacciones entre Hsp90 y las co-chaperonas que contienen un dominio TPR. El sitio de unión al péptido tiene una estructura terciaria similar, pero la homología general entre los diferentes dominios de motivos TPR es relativamente baja^7,lo que brinda la oportunidad de identificar moléculas específicamente capaces de bloquear las interacciones entre Hsp90 y las co-chaperonas particulares con motivos TPR. Entre estas co-chaperonas con motivos TPR, la proteína de unión a FK506 (FKBP) 51 y FKBP52 son reguladores de la señalización del receptor de hormona esteroide (SHR) e involucradas en varias enfermedades dependientes de hormonas esteroides, incluyendo cáncer, enfermedades relacionadas con el estrés, enfermedades metabólicas y enfermedad de Alzheimer⁸. Aunque FKBP51 y FKBP52 comparten > similitud de secuencia del 80%, sus funciones difieren: FKBP52 es un regulador positivo de la actividad de SHR, mientras que FKBP51 es un regulador negativo en la mayoría de los casos⁸. Por lo tanto, la identificación de moléculas, bloqueando específicamente las interacciones entre Hsp90 y FKBP51 o FKBP52, proporciona un potencial terapéutico prometedor para enfermedades relacionadas.

Unensayo amplificado Luminescent Proximity Homogenous A(AlphaScreen) fue desarrollado por primera vez en 1994 por Ullman EF et al.⁹. Ahora es ampliamente utilizado para detectar diferentes tipos de interacciones biológicas, como el péptido^10,la proteína^11,el ADN^12,el ARN¹³y el azúcar^14. En esta técnica, hay dos tipos de cuentas (diámetro 200 nm), una es la cuenta donante y la otra es la cuenta aceptora. Las biomoléculas se inmovilizan sobre estas cuentas; sus interacciones biológicas ponen en proximidad a las cuentas donantes y aceptoras. A 680 nm, un fotosensibilizador en la cuenta del donante ilumina y convierte el oxígeno en oxígeno singlete. Debido a que el oxígeno singlete tiene una vida útil corta, solo puede difundirse hasta 200 nm. Si la perla aceptora está en proximidad, su derivado tioxeno reacciona con el oxígeno singlete generando quimioluminascencia a 370 nm. Esta energía activa aún más los fluoróforos en la misma cuenta aceptora para emitir luz a 520-620 nm¹⁵. Si las interacciones biológicas se interrumpen, la cuenta aceptora y la cuenta donante no pueden alcanzar la proximidad, lo que resulta en la descomposición del oxígeno singlete y la baja señal producida.

Aquí describimos un protocolo que utiliza esta técnica para el cribado de moléculas pequeñas que inhiben las interacciones entre Hsp90 y las co-chaperonas TPR, especialmente FKBP51 y FKBP52. Los péptidos largos de 10 aminoácidos correspondientes al extremo C extremo Hsp90 están unidos a las perlas aceptoras. Las co-chaperonas TPR purificadas marcadas con GST interactúan con las perlas de donantes ligadas al glutatión. Cuando la interacción entre los péptidos derivados de Hsp90 y las co-chaperonas con motivos TPR une las perlas, se produce una señal amplificada(Figura 1A). Si las moléculas pequeñas examinadas pueden inhibir las interacciones entre Hsp90 y las co-chaperonas con motivo tPR, esta señal amplificada disminuirá (Figura 1B). Su IC₅₀ se puede calcular mediante medición cuantitativa. Este protocolo se puede extender a cualquier interacción chaperona - TPR-motivo co-chaperona de interés y es de gran importancia en el desarrollo de nuevas moléculas, bloqueando específicamente la interacción entre Hsp90 y FKBP51 o FKBP52.

Figura 1: El principio básico de este ensayo. (A) GST-FKBP51 purificado interactúa con cuentas de donantes ligadas al glutatión. Los péptidos largos de 10 aminoácidos correspondientes al extremo C-terminal de Hsp90 se unen a las perlas aceptoras. La interacción entre los péptidos derivados de Hsp90 y el dominio TPR de FKBP51 acerca las perlas del donante y del aceptor. A 680 nm, un fotosensibilizador en la cuenta del donante ilumina y convierte el oxígeno en oxígeno singlete. El derivado tioxeno en la perla aceptora reacciona con el oxígeno singlete y genera quimioluminescencia a 370 nm. Esta energía activa aún más los fluoróforos en la misma cuenta aceptora para emitir luz a 520-620 nm. (B) Cuando las moléculas pequeñas inhiben las interacciones entre Hsp90 y FKBP51, las perlas donante y aceptora no pueden alcanzar la proximidad. Luego, el oxígeno singlete con una vida útil corta se descompone y no se produce ninguna señal detectable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

NOTA: En la figura 2se muestra una descripción general de este protocolo.

1. Expresión y purificación de GST-FKBP51 y GST-FKBP52 (Figura 2A)

1. Plasmidios
   NOTA: Obtenga clones de ADNc para FKBP51 humano (id de clon: 5723416) y para FKBP52 humano (id de clon: 7474554) del consorcio IMAGE.
   1. Amplificar el ADN FKBP51 humano mediante PCR con cebadores (hacia adelante; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', inverso; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') que contienen voladizos BamHI y XhoI y clonar en vector pGEX6-1 en los sitios de restricción BamHI / XhoI.
   2. Amplificar el ADN FKBP52 humano mediante PCR con cebadores (hacia adelante; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', reverso; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') que contienen voladizos EcoRI y XhoI y clonar en vector pGEX6-2 en sitios de restricción EcoRI / XhoI.
      NOTA: La configuración y las condiciones de la reacción de PCR se muestran en la Tabla 1 y la Tabla 2.
   3. Verifique la secuencia insertada y transforme los plásmidos en la E. coli químicamente competente de acuerdo con el protocolo de fabricación.
2. Expresión y purificación de proteínas
   1. Agregue 25 g de base de caldo de Luria (LB) en 1 L de agua destilada para hacer la solución de LB. Autoclave a 121 °C durante 15 min. Después del enfriamiento, agregue 50 μg / ml de ampicilina.
   2. Tome una colonia de bacterias que expresen GST-FKBP51 o GST-FKBP52 y mezcle con 500 μL de solución de LB en un tubo de 1,5 ml. Vórtice.
   3. Agregue la mezcla de "1.2.2" en 1 L de solución lb en el matraz Erlenmeyer cubierto con un papel de aluminio. Incubar el matraz Erlenmeyer en la coctelera durante la noche a 37 °C.
   4. Inducir la expresión de proteínas mediante la adición de 1 mM de isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) al matraz de Erlenmeyer y continuar la incubación durante otras 2 h.
   5. Para obtener pellets celulares, centrífuga a 5.000 x g durante 15 min. Retire el sobrenadante.
      NOTA: Los pellets celulares se pueden almacenar a -20 °C.
   6. Resuspend los gránulos celulares en 40 mL de PBS y sonicar 3 x 20 s sobre hielo. Agregue 1 mM PMSF, 1 mM EDTA y cóctel inhibidor de proteasa (1 tableta) para prevenir la proteólisis.
   7. Centrifugar la suspensión durante 30 min 50,000 x g para eliminar los restos celulares y aplicar el sobrenadante sobre la columna de trampa GST de 5 ml.
   8. Después de lavar la columna con 30 mL PBS, elute GST-FKBP51 y GST-FKBP52 con 5 mL de 10 mM de glutatión en PBS.
   9. Concentrar proteínas en 15 mL 10.000 MWCO unidad de centrifugación. Para eliminar el glutatión libre, pase los concentrados a través de la columna PD-10 equilibrada con 0.5x PBS y concéntrese nuevamente en el dispositivo de centrífuga de filtro.
   10. Recolectar fracciones que contengan proteínas. Verifique las proteínas en SDS-PAGE y ajuste las concentraciones de proteínas a 1 mg/ml.
       NOTA: El rendimiento típico de proteínas es de 2-5 mg / L de cultivo. La proteína se puede almacenar a -20 °C.

2. Acoplamiento del péptido C-terminal Hsp90 a las perlas aceptoras (Figura 2B)

1. Preparación de péptidos Hsp90
   1. Sintetizar diez aminoácidos péptidos NH₂-EDASRMEEVD-COOH correspondientes a aminoácidos 714-724 de la isoforma beta Hsp90 humana (UniProt ID: P08238) mediante un servicio de síntesis de péptidos.
   2. Diluya el péptido Hsp90 en PBS a una concentración de 1 mg/ml.
2. Preparación de cuentas de aceptor
   1. Diluya las perlas aceptoras no conjugadas en PBS a una concentración de 1 mg/ml y transfiéralas a un tubo de 1,5 ml.
   2. Realizar el lavado por centrifugación a 16.000 x g durante 15 min. Retire con cuidado el sobrenadante.
3. Conjugación
   1. Establezca la proporción entre cuentas y péptidos como 10: 1. En el tubo de 1,5 ml que contiene 1 mg de pellet de perla aceptora (preparado como se describió anteriormente), agregue 1 ml de PBS (pH 7.4), 0,1 mg de péptido diluido, 1,25 μL de Tween-20, 10 μL de una solución de 400 mM de cianoborohidruro de sodio (NaBH₃CN) en agua.
      PRECAUCIÓN: NaBH3CN es tóxico; use una campana extractora y guantes. La solución de NaBH₃CN debe estar recién preparada.
   2. Incubar durante 24 h a 37 °C con agitación de extremo a extremo (10-20 rpm) en un agitador rotativo.
4. Enfriamiento de reacción y lavado de cuentas
   1. Agregue 20 μL de solución de 1 M Tris-HCl (pH 8.0) a la reacción para bloquear sitios no reaccionados. Incubar durante 1 h a 37 °C.
   2. Centrifugadora a 16.000 x g (o velocidad máxima) durante 15 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y vuelva a colocar el pellet de perlas en 1 ml de solución de Tris-HCl (100 mM, pH 8.0).
   3. Repita el paso de lavado tres veces.
   4. Después de la última centrifugación, vuelva a colocar las perlas a 1 mg/ml en tampón de almacenamiento (1 ml de 0,5 × PBS con azida de sodio al 0,01% como conservante). Almacene la solución de perla aceptora conjugada a 4 °C protegida contra la luz.
      PRECAUCIÓN: La azida de sodio es tóxica; use una campana extractora y guantes.

3. El ensayo que investiga la interacción entre GST-FKBP51 o GST-FKBP52 y el péptido C-terminal Hsp90, y la inhibición con pequeños compuestos de masa molecular (Figura 2C)

1. Proteínas marcadas con GST que interactúan con las perlas de donantes de glutatión
   1. Configure las reacciones en placas de 384 pozos.
   2. Preparar la solución que contiene 10 μg/ml de las perlas donantes de glutatión en 0,5x PBS, pH 7,4.
      NOTA: Después de un almacenamiento prolongado, las cuentas se asientan y necesitan ser vórtices.
   3. Añadir GST-FKBP51 o GST-FKBP52 a una concentración final de 10 μg/ml.
   4. Incubar en la oscuridad a 25 °C durante 10 min.
      NOTA: En este paso, las proteínas marcadas con GST interactuarán con el glutatión unido a las perlas. Para cada pozo, se utilizarán 22,5 μL de esta mezcla. La concentración de los socios vinculantes debe determinarse empíricamente. Titula GST-FKBP51 y GST-FKBP52 y elige la concentración que da la mejor señal.
2. Adición de compuestos
   1. Realizar diluciones seriadas de compuestos de prueba en DMSO.
      NOTA: Las concentraciones utilizadas son típicamente 10, 30, 100, 300, 1,000 y 3,000 μM.
   2. Añadir 0,25 μL de DMSO (control negativo) o péptido C-terminal Hsp90 (control positivo, 30 μM) o compuestos en DMSO a la esquina de cada pozo de la placa. Use triplicatos para cada concentración de compuestos.
   3. Agregue 22.5 μL de la solución que contiene perlas de donantes de glutatión con proteínas marcadas con GST a cada pozo.
   4. Agite el plato suavemente con la mano pero a fondo. Incubar en la oscuridad a 25 °C durante 15 min.
      NOTA: Durante este tiempo, los compuestos interactuarán con el dominio TPR en el sitio de unión al péptido Hsp90 C-terminal.
3. Adición de cuentas de aceptación
   1. Diluya las perlas aceptoras con el péptido C-terminal Hsp90 unido a 100 μg/mL en 0.5x PBS.
   2. Añadir 2,25 μL de perlas aceptoras diluidas a cada pozo.
   3. Mezclar suavemente pero a fondo. Incubar en la oscuridad a 25 °C durante 15 min.
      NOTA: En este paso, las perlas donante y aceptora se ponen en proximidad por las interacciones proteína-péptido. El volumen final de la mezcla de reacción es de 25 μL. Por lo tanto, las concentraciones finales de compuestos oscilan entre 0,1 y 30 μM.
4. Lectura de placas
   NOTA: Lea la placa utilizando un lector de placas configurado en el modo correspondiente.
   1. Encienda el instrumento y abra el software
   2. Elija el protocolo correspondiente.
   3. Haga clic en Editar mapa de placa y seleccione el pozo que se utiliza en la placa para la medición.
   4. Haga clic en Siguiente para continuar y Ejecutar el protocolo seleccionado.
   5. Después de la medición, haga clic en Mostrar resultados para ver los resultados.
   6. Exporte los datos.

4. Análisis de datos

1. Factor Z' y relación señal-fondo (S/B)
   1. Calcule el factor Z' y la relación S/B para el ensayo utilizando la siguiente ecuación:
      Z'=1-(3σpos+3σneg)/│μpos-μneg│¹⁶
      S/B=μneg/μpos
      donde, σ y μ representan las desviaciones estándar y las medias de los controles positivos (péptido C-terminal Hsp90, 30 μM) y negativos (DMSO), respectivamente. Un factor Z' > 0.5 asegurará que el ensayo sea lo suficientemente robusto para la detección. Para controlar la sensibilidad del ensayo, también se ha calculado la relación S/B.
2. Curva dosis-respuesta y CI ₅₀
   NOTA: Utilice el análisis de regresión no lineal para ajustar los datos de los inhibidores del IBP de Hsp90-cochaperonas por software.
   1. Cree una tabla de datos XY en el cuadro de diálogo de bienvenida y seleccione NúmerosX , e Y Escriba 3 (si triplica) replicar valores en columnas en paralelo.
   2. Normalizar los datos de señal de las muestras al grupo de control negativo. Importe los valores de concentración a la columna X y los valores de señal a la columna Y.
   3. Haga clic en Analizar y elija Concentración de transformación (X) en Transformar | Normalizar. Elija Transformar en logaritmos.
      NOTA: Esto transformará la concentración en una escala logarítrica. Si su concentración inicial es cero, configálelo en un número muy pequeño que sea efectivamente cero (por ejemplo, 0.1 nM) para no perder esos valores ya que el logaritmo de cero no está definido.
   4. Haga clic en Analizar y elija Regresión no lineal (ajuste de curva) en Análisis XY,abra la Inhibición de dosis-respuesta y elija Registro (inhibidor) vs. respuesta - Pendiente variable.
   5. Haga clic en Aceptar para ver los resultados (que contienen el valor IC₅₀₎ y los gráficos.

Figura 2: Esquema de este protocolo. (A) Expresión y purificación de GST-FKBP51 y GST-FKBP52. (B) Acoplamiento del péptido C-terminal Hsp90 a las perlas aceptoras. (C) El ensayo que investiga la interacción entre GST-FKBP51 o GST-FKBP52 y el péptido Hsp90 C-terminal. Inhibición con pequeños compuestos de masa molecular. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

En nuestro ensayo, el factor Z' y la relación S/B son 0.82 y 13.35, respectivamente(Figura 3A),lo que demuestra que nuestro ensayo es robusto y confiable para el cribado de alto rendimiento. Luego lo usamos para detectar pequeños compuestos de masa molecular. La Figura 3B presenta la inhibición dependiente de la dosis de las interacciones chaperona-cochaperona con una molécula pequeña seleccionada (D10). Las curvas dosis-respuesta para D10 se generan median...

Discusión

Aquí describimos un protocolo que utiliza el ensayo para el cribado de moléculas pequeñas que inhiben las interacciones entre Hsp90 y las co-chaperonas con motivos TPR, especialmente FKBP51 y FKBP52. Su alta puntuación Z' (>0,8) demuestra la robustez y fiabilidad de un formato de alto rendimiento. Los resultados se pueden obtener en una hora, y se requieren pequeñas cantidades de perlas, proteínas y compuestos. Además, este protocolo podría extenderse fácilmente a cualquier interacción Hsp90 /Hsp70 - TPR-motif ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well plates	Perkin Elmer	6008350	Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit	Millipore	UFC901008	Concentrate protein
Ampicillin	Sigma	A0166	Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010	Heidolph		Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51	Source BioScience	clone id: 5723416	pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52	Source BioScience	clone id: 7474554	pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software	GraphPad Prism	9.0.0	Analysis data and make figures
Data analysis software	Excel		Analysis data
DMSO	Supelco	1.02952.1000	Dilute compounds
DPBS	Gibco	14190-144	Prepare solution
EDTA	Calbiochem	344504	Prevent proteolysis during sonication
Glutathione	Sigma	G-4251	Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads	Perkin Elmer	6765300	Donor bead
GST-trap column	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Thermo Fisher Scientific	R0392	Induce protein expression
LB Broth (Miller)	Sigma	L3522	Microbial growth medium
PCR instrument	BIO-RAD	S1000 Thermal Cycler	Amplification/PCR
PD-10 column	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Solution exchange
pGEX-6P-1 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Plasmid
pGEX-6P-2 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	Plasmid
Plate reader	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Multilabel Reader	Read alpha plate
Plate reader software	Perkin Elmer	EnSpire Manager	Plate reader software
Plate reader software protocol	Perkin Elmer	Alpha 384-well Low volume	Use this protocol to read plate
PMSF	Sigma	P7626	Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail	Sigma	S8830	Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide	Sigma	S2002	As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma	156159	Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform	Peptide 2.0 inc		Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator	LABINCO		Make end-over-end agitation
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20	Sigma	P1379	Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor	Microson		Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads	Perkin Elmer	6762003	Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module	Invitrogen	EI0002	SDS-PAGE