מחקרים של אינטראקציות מלווה-Cochaperone באמצעות אסאי הומוגני מבוסס חרוזים

Summary

פרוטוקול זה מציג טכניקה לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות חרוזי תורם הקשורים גלוטתיון עם מלווים שותפים TPR-מוטיב מותך GST וחרוזים מקובלים יחד עם פפטיד שמקורו Hsp90. השתמשנו בטכניקה זו כדי לסנן מולקולות קטנות כדי לשבש Hsp90-FKBP51 או Hsp90-FKBP52 אינטראקציות וזיהינו מעכבי אינטראקציה Hsp90-FKBP51 חזקים וסלקטיביים.

Abstract

מיקוד חלבון הלם חום 90 (Hsp90)-cochaperone אינטראקציות מספק את האפשרות לווסת באופן ספציפי תהליכים תאיים תלוי Hsp90. המחומש המשומר MEEVD בטרמינל C של Hsp90 אחראי לאינטראקציה עם מוטיב חוזר טטרטריקופטיד (TPR) של מלווים משותפים. FK506-מחייב חלבון (FKBP) 51 ו FKBP52 הם שני מלווים שותפים TPR-מוטיב דומה המעורבים במחלות תלויות הורמונים סטרואידים עם פונקציות שונות. לכן, זיהוי מולקולות במיוחד חסימת אינטראקציות בין Hsp90 ו FKBP51 או FKBP52 מספק פוטנציאל טיפולי מבטיח עבור מספר מחלות אנושיות. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור קרבה זוהרת מוגברת כדי לחקור אינטראקציות בין Hsp90 ושותפו מלווים FKBP51 ו- FKBP52. ראשית, טיהרנו את החלבונים המכילים מוטיב TPR FKBP51 ו- FKBP52 בצורת גלוטתיון S-transferase (GST). באמצעות חרוזי התורם הקשורים לגלוטתיון עם חלבוני TPR-מוטיב מותכים GST וחרוזים מקבלים יחד עם פפטיד מסוף C 10-mer של Hsp90, חקרנו אינטראקציות חלבון חלבון בסביבה הומוגנית. השתמשנו בבדיקה זו כדי לסנן מולקולות קטנות כדי לשבש את האינטראקציות Hsp90-FKBP51 או Hsp90-FKBP52 וזיהינו מעכבי אינטראקציה חזקים וסלקטיביים Hsp90-FKBP51.

Introduction

מלווים מולקולריים תורמים להומאוסטזיס של חלבונים, כולל קיפול חלבונים, הובלה והשפלה. הם מווסתים מספר תהליכים תאיים ומקושרים למחלות רבות כגון סרטן ומחלות ניווניות¹. חלבון הלם חום 90 (Hsp90) הוא אחד המלווים החשובים ביותר שתפקידם תלוי בשינויים קונפורמיטיביים המונעים על ידי הידרוליזה ATP וקשירה עם חלבוני לקוח בתיווך המלווים השותפים שלה². למרות הפוטנציאל הברור של Hsp90 כיעד הטיפולי, כוונון עדין של תפקידו מהווה אתגר גדול. ישנם מספר מעכבי Hsp90 המתמקדים באזור איגוד ה- ATP של N-terminal, אשר הוערכו בניסויים קליניים, אך אף אחד מהם לא אושר לשיווק³. בשל היעדר כיס^{4, המתמקד}באזור ה-C-terminal של Hsp90, זכה להצלחה מוגבלת⁴. לאחרונה, הפרעה של אינטראקציות Hsp90-cochaperone על ידי מולקולות קטנות נחקרה כאסטרטגיה^{חלופית 5}. מיקוד אינטראקציות Hsp90-cochaperone לא לעורר תגובת מתח תא כללי ומספק את האפשרות לווסת באופן ספציפי תהליכים תאיים שונים. המחומש המשומר MEEVD בטרמינל C של Hsp90 אחראי לאינטראקציה עם מוטיב חוזר טטראטריאופפטייד (TPR) של מלווים משותפים⁶. מתוך 736 חלבונים המכילים מוטיב TPR המובאים במאגר החלבון האנושי, ~ 20 חלבונים שונים אינטראקציה עם Hsp90 באמצעות פפטיד^{זה 7}. מולקולות המתחרות על כריכת הפפטיד של MEEVD ישבשו את האינטראקציות בין Hsp90 למלווים שותפים המכילים תחום TPR. אתר כריכת הפפטידים בעל מבנה שלישוני דומה, אך ההומולוגיה הכוללת בין תחומי מוטיב TPR שונים נמוכה יחסית⁷, ומספקת הזדמנות לזהות מולקולות המסוגלות במיוחד לחסום אינטראקציות בין Hsp90 לבין מלווים משותפים מסוימים של TPR-מוטיב. בין אלה TPR-מוטיב מלווים משותפים, FK506 מחייב חלבון (FKBP) 51 ו FKBP52 הם רגולטורים של קולטן הורמון סטרואידים (SHR) איתות מעורב במספר מחלות תלויות הורמונים סטרואידים כולל סרטן, מחלות הקשורות ללחץ, מחלות מטבוליות, ומחלת^{אלצהיימר 8}. למרות FKBP51 ו- FKBP52 מניות > דמיון רצף 80%, הפונקציות שלהם שונים: FKBP52 הוא רגולטור חיובי של פעילות SHR, בעוד FKBP51 הוא רגולטור שלילי ברוב המקרים⁸. לכן, זיהוי מולקולות, במיוחד חסימת אינטראקציות בין Hsp90 ו- FKBP51 או FKBP52, מספק פוטנציאל טיפולי מבטיח למחלות קשורות.

Luminescent Proximity Hאומוגנוס Assay (אלפא מסך) פותח לראשונה בשנת 1994 על ידי אולמן EF ואח^'9. עכשיו הוא נמצא בשימוש נרחב כדי לזהות סוגים שונים של אינטראקציות ביולוגיות, כגון פפטיד¹⁰, חלבון¹¹, DNA^12,RNA¹³, וסוכר¹⁴. בטכניקה זו, ישנם שני סוגים של חרוזים (קוטר 200 ננומטר), אחד הוא חרוז התורם והשני הוא חרוז הקבלה. הביומולקולים משותקים על החרוזים האלה; האינטראקציות הביולוגיות שלהם מביאות את החרוזים התורמים והמקבלים לקרבה. ב 680 ננומטר, רגישות בצלם בחרוז התורם מאירה וממירה חמצן לחמצן יחיד. מכיוון שלחמצן הסינגל יש חיים קצרים, הוא יכול לפזר רק עד 200 ננומטר. אם חרוז הקבלה נמצא בסמיכות, נגזרת תיוקסן שלה מגיבה עם חמצן יחיד יצירת chemiluminescence ב 370 ננומטר. אנרגיה זו מפעילה עוד יותר פלואורופור באותו חרוז מקבל לפלוט אור ב 520-620 ננומטר¹⁵. אם האינטראקציות הביולוגיות משובשות, החרוז המקבל וחרוז התורם אינם יכולים להגיע לקרבה, וכתוצאה מכך דעיכה בחמצן יחיד ואות המיוצר נמוך.

כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות טכניקה זו להקרנת מולקולות קטנות המעכבות אינטראקציות בין Hsp90 ל- TPR מלווים משותפים, במיוחד FKBP51 ו- FKBP52. 10 פפטידים ארוכים של חומצות אמינו המתאימים ל- Hsp90 C-terminus קיצוני מחוברים לחרוזים מקובלים. מלווים שותפים TPR מתויגים GST אינטראקציה עם חרוזי תורם הקשורים גלוטתיון. כאשר האינטראקציה בין פפטידים שמקורם ב-Hsp90 לבין מלווים שותפים של TPR-מוטיב מאחדת את החרוזים, נוצר אות מוגבר(איור 1A). אם המולקולות הקטנות המוקרנות יכולות לעכב את האינטראקציות בין Hsp90 ל-TPR-מוטיב שותפים, האות המוגבר הזה יקטן (איור 1B). ניתן לחשב את IC₅₀ שלהם לפי מדידה כמותית. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב לכל מלווה - אינטראקציות שיתוף המלווה TPR-מוטיב של עניין והוא בעל חשיבות רבה בפיתוח של מולקולות חדשניות, במיוחד חסימת האינטראקציה בין Hsp90 ו- FKBP51 או FKBP52.

איור 1: העיקרון הבסיסי של ההסתה הזו. (A)GST-FKBP51 מטוהר מקיים אינטראקציה עם חרוזי תורמים הקשורים לגלוטתיון. 10 פפטידים ארוכים של חומצת אמינו המתאימים לטרמינל C הקיצוני של Hsp90 מחוברים לחרוזים מקובלים. האינטראקציה בין פפטידים שמקורם ב- Hsp90 לבין תחום TPR של FKBP51 מביאה את החרוזים התורמים והמקבלים לקרבה. ב 680 ננומטר, רגישות בצלם בחרוז התורם מאירה וממירה חמצן לחמצן יחיד. נגזרת תיוקסן על חרוז הקבלה מגיבה עם חמצן יחיד ומייצר chemiluminescence ב 370 ננומטר. אנרגיה זו מפעילה עוד יותר פלואורופור באותו חרוז קבלה לפלוט אור ב 520-620 ננומטר. (B)כאשר מולקולות קטנות מעכבות את האינטראקציות בין Hsp90 ל- FKBP51, החרוזים התורמים והמקבלים אינם יכולים להגיע לקרבה. ואז החמצן היחיד עם ריקבון תוחלת חיים קצרה, ולא מיוצר אות לגילוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

הערה: מבט כולל על פרוטוקול זה מוצג באיור 2.

1. ביטוי וטיהור של GST-FKBP51 ו- GST-FKBP52 (איור 2A)

1. פלסמידים
   הערה: להשיג שיבוטים cDNA עבור FKBP51 אנושי (מזהה שיבוט: 5723416) עבור FKBP52 אנושי (מזהה שיבוט: 7474554) מקונסורציום IMAGE.
   1. להגביר את ה- DNA FKBP51 האנושי על ידי PCR עם פריימרים (קדימה; 5'GGATCCATGAACTACTACTGATGAAGGT-3', הפוך; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTCTCCAC-3') המכילים אוברהי באמי ו- XhoI ושיבוט לווקטור pGEX6-1 באתרי ההגבלה של באמהי / XhoI.
   2. להגביר את ה- DNA האנושי FKBP52 על ידי PCR עם פריימרים (קדימה; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', הפוך; 5'-CTCGAGCTATATGCTTCTCTCTCCAC-3') המכיל אוקרי ו XhoI overhangs ושיבוט לתוך וקטור pGEX6-2 באתרי הגבלה EcoRI / XhoI.
      הערה: הגדרת תגובת PCR והתנאים מוצגים בטבלה 1 ובטבלה 2.
   3. לאמת את הרצף שהוכנס ולהפוך את plasmids לתוך E. coli מוסמך כימית על פי פרוטוקול הייצור.
2. ביטוי וטיהור חלבונים
   1. הוסיפו 25 גרם לבסיס מרק לוריא (LB) ב-1 ליטר מים מזוקקים כדי להפוך את פתרון ה-LB. תבודד אותו אוטומטית ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר הקירור, מוסיפים אמפיצ'ילין של 50 מיקרוגרם/מ"ל.
   2. קח מושבה של חיידקים המבטאות GST-FKBP51 או GST-FKBP52 ולערבב עם 500 μL של פתרון LB בצינור 1.5 מ"ל. מערבולת.
   3. מוסיפים את התערובת של "1.2.2" לתוך 1 L של פתרון LB בבקבוק Erlenmeyer מכוסה רדיד אלומיניום. לדגור על בקבוקון ארלנמייר בשייקר לילה ב 37 °C (50 °F).
   4. לגרום ביטוי חלבון על ידי הוספת 1 mM איזופרופיל-β-D-thiogalactoside (IPTG) לבקבוק ארלנמאייר ולהמשיך את הדגירה במשך 2 שעות נוספות.
   5. כדי לקבל כדורי תא, צנטריפוגה ב 5,000 x g במשך 15 דקות. הסר את סופר-טבעי.
      הערה: כדורי התא ניתן לאחסן ב -20 °C (70 °F).
   6. resuspend כדורי התא ב 40 מ"ל של PBS ו sonicate 3 x 20 s על קרח. יש להוסיף 1 מ"מ PMSF, 1 mM EDTA וקוקטייל מעכב פרוטאז (טבליה אחת) כדי למנוע פרוטאוליזיס.
   7. צנטריפוגה ההשעיה במשך 30 דקות 50,000 x g כדי להסיר פסולת תא ולהחיל את supernatant על 5 מ"ל GST מלכודת לעמודה.
   8. לאחר שטיפת העמוד עם 30 מ"ל PBS, יש לברוח GST-FKBP51 ו- GST-FKBP52 עם 5 מ"ל של גלוטתיון 10 מ"מ ב- PBS.
   9. מרכז חלבונים ביחידת צנטריפוגה של 15 מ"ל 10,000 MWCO. כדי להסיר גלוטתיון בחינם, מעבירים תרכיזים דרך עמודת PD-10 משוויבים עם PBS 0.5x ושוב מתרכזים בהתקן הצנטריפוגה של המסנן.
   10. לאסוף שברים המכילים חלבון. אמת את החלבונים ב-SDS-PAGE והתאם את ריכוזי החלבון ל-1 מ"ג/מ"ל.
       הערה: תפוקת חלבון טיפוסית היא 2-5 מ"ג / L תרבית. ניתן לאחסן את החלבון ב-20 מעלות צלזיוס.

2. צימוד של Hsp90 C-terminal פפטיד לחרוזים המקובלים (איור 2B)

1. הכנת פפטיד Hsp90
   1. לסנתז עשר חומצות אמינו פפטיד NH₂-EDASRMEEVD-COOH המתאים לחומצות אמינו 714-724 של איזופורם בטא Hsp90 אנושי (מזהה UniProt: P08238) על ידי שירות סינתזת פפטיד.
   2. לדלל את הפפטיד Hsp90 ב- PBS לריכוז של 1 מ"ג/מ"ל.
2. הכנת חרוזי קבלה
   1. לדלל את חרוזי הקבלה ללא מנוול PBS לריכוז 1 מ"ג / מ"ל ולהעביר לצינור 1.5 מ"ל.
   2. בצע את הכביסה על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 15 דקות. הסר בזהירות את סופר-טבעי.
3. הטיות
   1. הגדר את היחס בין חרוזים ופפטיד כ- 10:1. בצינור 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ג של כדור חרוזים מקובל (מוכן כפי שתואר לעיל), להוסיף 1 מ"ל של PBS (pH 7.4), 0.1 מ"ג של פפטיד מדולל, 1.25 μL של Tween-20, 10 μL של פתרון 400 mM של נתרן cyanoborohydride (NaBH₃CN) במים.
      זהירות: NaBH3CN רעיל; השתמש ברדס אדים וכפפות. פתרון NaBH₃CN צריך להיות מוכן טרי.
   2. דגירה במשך 24 שעות ב 37 °C (37 °F) עם תסיסה סוף סוף (10-20 סל"ד) על שייקר סיבובי.
4. מרווה תגובה ושטיפת חרוזים
   1. הוסף 20 μL של פתרון 1 M Tris-HCl (pH 8.0) לתגובה לחסימת אתרים שלא הוחזרו. דגירה במשך 1 שעות ב 37 °C (50 °F).
   2. צנטריפוגה ב 16,000 x g (או מהירות מקסימלית) במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F). הסר את supernatant ו resuspend את גלולה חרוזים 1 מ"ל של פתרון Tris-HCl (100 mM, pH 8.0).
   3. חזור על שלב הכביסה שלוש פעמים.
   4. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, resuspend החרוזים ב 1 מ"ג / מ"ל במאגר אחסון (1 מ"ל של 0.5 × PBS עם 0.01% נתרן אזיד כחומר משמר). יש לאחסן את פתרון חרוז הקבלה המצומד ב-4 °C (4 °F) מוגן.
      זהירות: נתרן אזיד רעיל; השתמש ברדס אדים וכפפות.

3. ההבחנה בוחנת את האינטראקציה בין GST-FKBP51 או GST-FKBP52 ו- Hsp90 C-terminal פפטיד, ועיכוב עם תרכובות מסה מולקולרית קטנות(איור 2C)

1. חלבונים מתויגים GST אינטראקציה עם חרוזי תורם גלוטתיון
   1. הגדר את התגובות בצלחות 384-well.
   2. הכן את הפתרון המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל של חרוזי תורם גלוטתיון ב 0.5x PBS, pH 7.4.
      הערה: לאחר אחסון ממושך, החרוזים מתיישבים וצריכים להיות מערבולת.
   3. הוסף GST-FKBP51 או GST-FKBP52 לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם /מ"ל.
   4. דגירה בחושך ב 25 °C (5 °F) במשך 10 דקות.
      הערה: בשלב זה, חלבונים מתויגים GST אינטראקציה עם גלוטתיון מחובר חרוזים. עבור כל באר, 22.5 μL של תערובת זו ישמש. ריכוז השותפים הכרוכות חייב להיקבע אמפירית. Titrate GST-FKBP51 ו- GST-FKBP52 ולבחור את הריכוז שנותן את האות הטוב ביותר.
2. תוספת מורכבת
   1. הפוך דילול טורי של תרכובות בדיקה ב- DMSO.
      הערה: הריכוזים המשמשים הם בדרך כלל 10, 30, 100, 300, 1,000 ו- 3,000 מיקרומטר.
   2. הוסף 0.25 μL של DMSO (שליטה שלילית) או Hsp90 C-מסוף פפטיד (שליטה חיובית, 30 מיקרומטר) או תרכובות ב- DMSO לפינה של כל באר של הצלחת. יש להשתמש בטריפליקאטים לכל ריכוז מורכב.
   3. הוסיפו 22.5 μL של הפתרון המכיל חרוזי תורם גלוטתיון עם חלבונים מתויגים GST לכל באר.
   4. לנער את הצלחת בעדינות עם היד אבל ביסודיות. דגירה בחושך ב 25 °C (5 °F) במשך 15 דקות.
      הערה: במהלך תקופה זו, תרכובות יקיימו אינטראקציה עם תחום TPR באתר איגוד הפפטיד Hsp90 C-terminal.
3. תוספת חרוזי קבלה
   1. לדלל את החרוזים הקבלים עם פפטיד Hsp90 C-מסוף מצורף ל 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 0.5x PBS.
   2. הוסף 2.25 μL של חרוזי קבלה מדוללים לכל באר.
   3. מערבבים בעדינות אך ביסודיות. דגירה בחושך ב 25 °C (5 °F) במשך 15 דקות.
      הערה: בשלב זה, חרוזים תורמים ומקבלים מובאים לקרבה על ידי אינטראקציות חלבון-פפטיד. הנפח הסופי של תערובת התגובה הוא 25 μL. לכן, הריכוזים הסופיים של תרכובות נע בין 0.1 ל 30 מיקרומטר.
4. קריאת לוחיות רישוי
   הערה: קרא את הצלחת באמצעות קורא לוחות שהוגדר במצב הרלוונטי.
   1. הפעל את המכשיר ופתח את התוכנה
   2. בחר את הפרוטוקול הרלוונטי.
   3. לחץ על ערוך מפת לוח ובחר את הרווחה המשמשת בלוח לצורך מדידה.
   4. לחץ על הבא כדי להמשיך ולהפעיל את הפרוטוקול הנבחר.
   5. לאחר המדידה, לחץ על הצג תוצאות כדי להציג תוצאות.
   6. יצא את הנתונים.

4. ניתוח נתונים

1. יחס גורם Z ויחס אות לרקע (S/B)
   1. חשב את יחס ה- Z של גורם ו- S/B עבור ה- assay באמצעות המשוואה הבאה:
      Z'=1-(3σpos+3σשלילי)/│μpos-μשלילי│¹⁶
      S/B=μשלילי/קופת μ
      כאשר, σ ו- μ מייצגים את סטיות התקן והאמצעים של הפקדים החיוביים (Hsp90 C-terminal, 30 מיקרומטר) ושלילי (DMSO), בהתאמה. גורם Z > 0.5 יבטיח כי בדיקת ה- Assay חזקה מספיק להקרנה. כדי לעקוב אחר רגישות ה- Assay, גם יחס ה- S/B חושב.
2. עקומת תגובת מינון ו-IC ₅₀
   הערה: השתמש בניתוח רגרסיה לא ליניארית כדי להתאים לנתונים של מעכבי PPI Hsp90-cochaperones על ידי תוכנה.
   1. צרו טבלת נתונים XY בתיבת הדו-שיח 'ברוכים הבאים' ובחרו 'מספריX' ו- Y Enter 3 (אם טריפליקאטים) משכפלים ערכים בעמודות זו לצד זו.
   2. נרמל את נתוני האות של דגימות לקבוצת הביקורת השלילית. יבא ערכי ריכוז לעמודת X וערכי האות לעמודה Y.
   3. לחץ על נתח ובחר ריכוז שינוי צורה (X) תחת שינוי צורה | לנרמל. בחר המר ללוגריתמים.
      הערה: פעולה זו תהפוך את הריכוז לקנה מידה של יומן רישום. אם ריכוז ההתחלה שלך הוא אפס, הגדר אותו למספר קטן מאוד שהוא למעשה אפס (למשל, 0.1 nM) כדי לא לאבד ערכים אלה מכיוון שהלוגריתם של אפס אינו מוגדר.
   4. לחץ על נתח ובחר רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה) תחת ניתוחי XY, פתח את המינון-תגובה-עיכוב ובחר Log(מעכב) לעומת תגובה - שיפוע משתנה.
   5. לחץ על אישור כדי להציג את התוצאות (המכילות _{ערך IC 50)} וגרפים.

איור 2: שרטוט של פרוטוקול זה. (A)ביטוי וטיהור של GST-FKBP51 ו- GST-FKBP52. (B)צימוד של פפטיד Hsp90 C-מסוף לחרוזים המקובלים. (C)ההסתה בוחנת את האינטראקציה בין GST-FKBP51 או GST-FKBP52 ו- Hsp90 C-terminal פפטיד. עיכוב עם תרכובות מסה מולקולרית קטנות. נוצר עם BioRender.com אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

בבדיקה שלנו, יחס ה-Z וה-S/B הם 0.82 ו-13.35, בהתאמה (איור 3A),מה שמוכיח שבדיקת ה-Assay שלנו חזקה ואמינה להקרנה בתפוקה גבוהה. לאחר מכן השתמשנו בו כדי לסנן תרכובות מסה מולקולרית קטנות. איור 3B מציג עיכוב תלוי מינון של אינטראקציות קואצ'אפרון מלווה עם מולקולה קטנה שנבחרה (D10). ?...

Discussion

כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות בדיקה לבדיקה עבור סינון מולקולות קטנות מעכב אינטראקציות בין Hsp90 ו TPR-מוטיב מלווים משותפים, במיוחד FKBP51 ו- FKBP52. ציון ה-Z הגבוה שלו (>0.8) מדגים את החוסן והאמינות לפורמט בעל תפוקה גבוהה. התוצאות ניתן להשיג בתוך שעה אחת, כמויות קטנות של חרוזים, חלבון ותרכובות נדרשים. ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well plates	Perkin Elmer	6008350	Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit	Millipore	UFC901008	Concentrate protein
Ampicillin	Sigma	A0166	Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010	Heidolph		Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51	Source BioScience	clone id: 5723416	pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52	Source BioScience	clone id: 7474554	pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software	GraphPad Prism	9.0.0	Analysis data and make figures
Data analysis software	Excel		Analysis data
DMSO	Supelco	1.02952.1000	Dilute compounds
DPBS	Gibco	14190-144	Prepare solution
EDTA	Calbiochem	344504	Prevent proteolysis during sonication
Glutathione	Sigma	G-4251	Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads	Perkin Elmer	6765300	Donor bead
GST-trap column	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Thermo Fisher Scientific	R0392	Induce protein expression
LB Broth (Miller)	Sigma	L3522	Microbial growth medium
PCR instrument	BIO-RAD	S1000 Thermal Cycler	Amplification/PCR
PD-10 column	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Solution exchange
pGEX-6P-1 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Plasmid
pGEX-6P-2 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	Plasmid
Plate reader	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Multilabel Reader	Read alpha plate
Plate reader software	Perkin Elmer	EnSpire Manager	Plate reader software
Plate reader software protocol	Perkin Elmer	Alpha 384-well Low volume	Use this protocol to read plate
PMSF	Sigma	P7626	Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail	Sigma	S8830	Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide	Sigma	S2002	As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma	156159	Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform	Peptide 2.0 inc		Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator	LABINCO		Make end-over-end agitation
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20	Sigma	P1379	Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor	Microson		Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads	Perkin Elmer	6762003	Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module	Invitrogen	EI0002	SDS-PAGE