Estudos de Interações Acompanhante-Cochaperone usando ensaio homogêneo baseado em contas

Resumo

Este protocolo apresenta uma técnica para sondar interações proteína-proteína usando contas doadoras ligadas à glutationa com co-acompanhantes e contas aceitadoras de TPR fundidas gst-fused e contas aceitadoras juntamente com um peptídeo derivado de Hsp90. Usamos essa técnica para rastrear pequenas moléculas para interromper as interações de interação Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 e identificamos inibidores potentes e seletivos de interação Hsp90-FKBP51.

Resumo

O direcionamento da proteína de choque térmico 90 (Hsp90)-cochaperona interações fornece a possibilidade de regular especificamente os processos intracelulares dependentes de Hsp90. O pentapeptídeo meevd conservado no C-terminus de Hsp90 é responsável pela interação com o motivo de repetição de tetratricopeptida (TPR) de co-acompanhantes. FK506-binding protein (FKBP) 51 e FKBP52 são dois co-acompanhantes similares TPR-motivo envolvidos em doenças dependentes de hormônios esteroides com diferentes funções. Portanto, identificar moléculas especificamente bloqueando interações entre Hsp90 e FKBP51 ou FKBP52 fornece um potencial terapêutico promissor para várias doenças humanas. Aqui, descrevemos o protocolo para um ensaio homogêneo de proximidade luminescente amplificado para sondar interações entre Hsp90 e seus co-acompanhantes parceiros FKBP51 e FKBP52. Primeiro, purificamos as proteínas contendo motivos TPR FKBP51 e FKBP52 na forma de glutationa S-transferase (GST) marcada. Usando as contas doadoras ligadas à glutationa com proteínas TPR-motivos fundidas gst e as contas aceitadoras juntamente com um peptídeo terminal de 10-mer C de Hsp90, sondamos interações proteína-proteína em um ambiente homogêneo. Usamos este ensaio para testar pequenas moléculas para interromper as interações de interação Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 e identificamos inibidores potentes e seletivos de interação Hsp90-FKBP51.

Introdução

Acompanhantes moleculares contribuem para a homeostase proteica, incluindo dobramento de proteínas, transporte e degradação. Eles regulam diversos processos celulares e estão ligados a inúmeras doenças como câncer e doenças neurodegenerativas¹. A proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é uma das acompanhantes mais importantes cuja função depende de alterações conformais impulsionadas pela hidrólise ATP e vinculantes com proteínas do cliente mediadas por seus acompanhantes². Apesar de um potencial óbvio do Hsp90 como alvo terapêutico, o ajuste fino de sua função representa um grande desafio. Existem vários inibidores de Hsp90 voltados para a região de ligação ATP n-terminal, que foram avaliados em ensaios clínicos, mas nenhum deles foi aprovado para comercialização³. Devido à falta de um bolso de ligação de ligantes bem definido^4,visando a região do terminal C de Hsp90 teve sucesso limitado⁴. Recentemente, a interrupção das interações de Hsp90-cochaperona por pequenas moléculas tem sido investigada como uma estratégia alternativa⁵. Direcionar as interações de cochaperona Hsp90 não provocaria resposta geral ao estresse celular e proporcionaria a possibilidade de regular especificamente vários processos intracelulares. O pentapeptida meevd conservado no C-terminus de Hsp90 é responsável pela interação com o motivo de repetição de tetratricopeptida (TPR) dos co-acompanhantes⁶. Das 736 proteínas contendo motivos TPR anotadas no banco de dados de proteínas humanas, ~20 proteínas diferentes interagem com o Hsp90 através deste peptídeo⁷. Moléculas competindo por ligação de peptídeos MEEVD interromperiam as interações entre Hsp90 e co-acompanhantes contendo um domínio TPR. O local de ligação de peptídeos tem estrutura terciária semelhante, mas a homologia geral entre diferentes domínios de motivos TPR é relativamente baixa⁷, proporcionando uma oportunidade de identificar moléculas especificamente capazes de bloquear interações entre Hsp90 e co-acompanhantes particulares do TPR-motivo. Entre esses co-acompanhantes de TPR-motivo, fk506-binding protein (FKBP) 51 e FKBP52 são reguladores de sinalização do receptor hormonal esteroide (SHR) e envolvidos em várias doenças dependentes de hormônios esteroides, incluindo câncer, doenças relacionadas ao estresse, doenças metabólicas e doença de Alzheimer⁸. Embora as ações FKBP51 e FKBP52 > similaridade de sequência de 80%, suas funções diferem: FKBP52 é um regulador positivo da atividade SHR, enquanto FKBP51 é um regulador negativo na maioria dos casos⁸. Portanto, identificar moléculas, bloqueando especificamente as interações entre Hsp90 e FKBP51 ou FKBP52, fornece um potencial terapêutico promissor para doenças relacionadas.

Ummplified Luminescent Proximity Homogenous Assay (AlphaScreen) foi desenvolvido pela primeira vez em 1994 por Ullman EF et al.⁹. Agora é amplamente utilizado para detectar diferentes tipos de interações biológicas, como peptídeo¹⁰, proteína^11,DNA¹², RNA¹³e açúcar¹⁴. Nesta técnica, existem dois tipos de contas (diâmetro 200 nm), uma é a conta doadora e a outra é a conta aceitadora. As biomoléculas são imobilizadas sobre essas contas; suas interações biológicas trazem contas doadoras e aceitadoras para a proximidade. A 680 nm, um fotoensibilizador na conta doadora ilumina e converte oxigênio em oxigênio único. Como o oxigênio único tem uma vida curta, ele só pode difundir até 200 nm. Se o cordão aceitor estiver próximo, seu derivado de tiaxieno reage com o oxigênio único gerando quemiluminescência a 370 nm. Esta energia ativa ainda mais fluoroforos no mesmo projeto de conta aceitador para emitir luz em 520-620 nm¹⁵. Se as interações biológicas forem interrompidas, a conta aceitadora e o doador não podem chegar à proximidade, resultando na decadência de oxigênio única e no sinal de baixa produção.

Aqui descrevemos um protocolo usando esta técnica para triagem de pequenas moléculas inibindo interações entre co-acompanhantes de Hsp90 e TPR, especialmente FKBP51 e FKBP52. Os 10 peptídeos longos de aminoácidos correspondentes ao Hsp90 extremo C-terminus estão ligados a contas aceitadoras. Co-acompanhantes de TPR com marca GST purificados interagem com contas doadoras ligadas à glutona. Quando a interação entre peptídeos derivados de Hsp90 e co-acompanhantes de TPR-motivos reúne as contas, um sinal amplificado é produzido(Figura 1A). Se as pequenas moléculas rastreadas puderem inibir as interações entre os co-acompanhantes de Hsp90 e TPR-motivo, esse sinal amplificado será diminuído(Figura 1B). Seu IC₅₀ pode ser calculado por medição quantitativa. Este protocolo pode ser estendido a qualquer acompanhante - TPR-motivo co-acompanhante interações de interesse e é de grande importância no desenvolvimento de novas moléculas, bloqueando especificamente a interação entre Hsp90 e FKBP51 ou FKBP52.

Figura 1: O princípio básico deste ensaio. (A) GST-FKBP51 purificado interage com contas doadoras ligadas à glutationa. Os 10 peptídeos longos de aminoácidos correspondentes ao extremo C-terminus de Hsp90 estão ligados a contas aceitadoras. A interação entre peptídeos derivados de Hsp90 e domínio TPR do FKBP51 aproxima o doador e o acceptor beads. A 680 nm, um fotoensibilizador na conta doadora ilumina e converte oxigênio em oxigênio único. A derivada de tiaxieno no projeto de garantia reage com o oxigênio singlet e gera chemiluminescence a 370 nm. Esta energia ativa ainda mais fluoroforos no mesmo projeto de conta aceitador para emitir luz a 520-620 nm. (B) Quando pequenas moléculas inibem as interações entre Hsp90 e FKBP51, o doador e as contas aceitadoras não podem alcançar a proximidade. Em seguida, o oxigênio singlet com decaimentos de curta duração, e nenhum sinal detectável é produzido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

NOTA: Uma visão geral deste protocolo é mostrada na Figura 2.

1. Expressão e purificação de GST-FKBP51 e GST-FKBP52 (Figura 2A)

1. Plasmídeo
   NOTA: Obtenha clones cDNA para FKBP51 humano (clonagem: 5723416) e para FKBP52 humano (clonagem: 7474554) do consórcio IMAGE.
   1. Amplie o DNA humano FKBP51 por PCR com primers (para a frente; 5'GGATCCATGACTGATGAAGG-3', reverso; 5'-CTCGAGCTATCTCTCTCTCCAC-3') contendo saliências bamhi e xhoi e clone em vetores pGEX6-1 nos locais de restrição BamHI / XhoI.
   2. Amplie o DNA FKBP52 humano por PCR com primers (para a frente; 5'-GAATTCATGACAGGAGGAGATG-3', reverso; 5'-CTCGAGCTATATTTCTCTCCAC-3') contendo saliências EcoRI e XhoI e clone em locais de restrição de locômica pGEX6-2 na EcoRI / XhoI.
      NOTA: Configuração da reação do PCR e condições são mostradas na Tabela 1 e Tabela 2.
   3. Verifique a sequência inserida e transforme os plasmídeos no E. coli quimicamente competente de acordo com o protocolo de fabricação.
2. Expressão e purificação de proteínas
   1. Adicione 25 g de base de caldo de Luria (LB) em 1 L de água destilada para fazer a solução LB. Autoclave-o a 121 °C por 15 min. Após o resfriamento, adicione 50 μg/mL ampicillin.
   2. Pegue uma colônia de bactérias expressando GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 e misture com 500 μL de solução LB em um tubo de 1,5 mL. Vórtice.
   3. Adicione a mistura de "1.2.2" em 1 L de solução LB no frasco erlenmeyer coberto com uma folha de alumínio. Incubar o frasco de Erlenmeyer no shaker durante a noite a 37 °C.
   4. Induzir a expressão proteica adicionando 1 mM isopropílico-β-D-thiogalactoside (IPTG) ao frasco de Erlenmeyer e continuar a incubação por mais 2 h.
   5. Para obter pelotas de célula, centrífuga a 5.000 x g por 15 min. Remova o supernatante.
      NOTA: As pelotas celulares podem ser armazenadas a -20 °C.
   6. Resuspend as pelotas de célula em 40 mL de PBS e sonicate 3 x 20 s no gelo. Adicione 1 mM PMSF, 1 mM EDTA e coquetel inibidor de protease (1 comprimido) para prevenir a proteólise.
   7. Centrifugar a suspensão por 30 min 50.000 x g para remover detritos celulares e aplicar o supernatante na coluna GST-trap de 5 mL.
   8. Depois de lavar a coluna com 30 mL PBS, elute GST-FKBP51 e GST-FKBP52 com 5 mL de glutathione de 10 mM em PBS.
   9. Concentre as proteínas na unidade de centrifugação de 15 mL 10.000 MWCO. Para remover glutationa livre, passe concentrados através da coluna PD-10 equilibrada com PBS de 0,5x e concentre-se novamente no dispositivo de centrífuga do filtro.
   10. Coletar frações que contenham proteínas. Verifique as proteínas em SDS-PAGE e ajuste as concentrações proteicas para 1 mg/mL.
       NOTA: O rendimento típico da proteína é de 2-5 mg/L cultura. A proteína pode ser armazenada a -20 °C.

2. Acoplamento do peptídeo terminal Hsp90 C às contas aceitadoras(Figura 2B)

1. Preparação de peptídeos Hsp90
   1. Sintetizar dez peptídeos de aminoácido NH₂-EDASRMEEVD-COOH correspondentes aos aminoácidos 714-724 de isoforma beta Hsp90 humano (UniProt ID: P08238) por um serviço de síntese de peptídeos.
   2. Diluir o peptídeo Hsp90 na concentração de PBS para 1 mg/mL.
2. Preparação de contas aceitadoras
   1. Diluir as contas aceitadoras não conjugadas na concentração pbs para 1 mg/mL e transferir para um tubo de 1,5 mL.
   2. Realize a lavagem por centrifugação a 16.000 x g por 15 min. Remova cuidadosamente o supernatante.
3. Conjugação
   1. Defina a razão entre contas e peptídeos como 10:1. No tubo de 1,5 mL contendo 1 mg de pelota de contas aceitadora (preparada como descrito acima), adicione 1 mL de PBS (pH 7.4), 0,1 mg de peptídeo diluído, 1,25 μL de Tween-20, 10 μL de uma solução de 400 mM de cianoboroidride de sódio (NaBH₃CN) na água.
      ATENÇÃO: NaBH3CN é tóxico; use um capuz de fumaça e luvas. A solução NaBH₃CN deve ser preparada recentemente.
   2. Incubar por 24 h a 37 °C com agitação final (10-20 rpm) em um agitador rotativo.
4. Saciamento de reação e lavagem de contas
   1. Adicione 20 μL de 1 M Tris-HCl (pH 8.0) à reação para bloquear sites não redigidos. Incubar por 1h a 37 °C.
   2. Centrifugar a 16.000 x g (ou velocidade máxima) por 15 min a 4 °C. Remova o supernatante e resuspenda a pelota de contas em 1 mL de solução Tris-HCl (100 mM, pH 8.0).
   3. Repita o passo de lavagem três vezes.
   4. Após a última centrifugação, resuspense as contas a 1 mg/mL em tampão de armazenamento (1 mL de 0,5 × PBS com azida de sódio de 0,01% como conservante). Armazene a solução de contas de aceitação conjugada à luz de 4 °C protegida.
      ATENÇÃO: O azida de sódio é tóxico; use um capuz de fumaça e luvas.

3. O ensaio que sonda a interação entre GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 e Hsp90 C-terminal peptídeo, e inibição com pequenos compostos de massa molecular(Figura 2C)

1. Proteínas com marca GST interagindo com contas doadoras de glutationa
   1. Configure as reações em placas de 384 poços.
   2. Prepare a solução contendo 10 μg/mL das contas doadoras de glutationa em 0,5x PBS, pH 7.4.
      NOTA: Após o armazenamento prolongado, as contas se acalmam e precisam ser vórtices.
   3. Adicione GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 a uma concentração final de 10 μg/mL.
   4. Incubar no escuro a 25 °C por 10 min.
      NOTA: Nesta etapa, as proteínas marcadas pelo GST interagirão com glutationa anexada às contas. Para cada poço, serão utilizados 22,5 μL desta mistura. A concentração dos parceiros vinculantes deve ser determinada empiricamente. Titule GST-FKBP51 e GST-FKBP52 e escolha a concentração que dá o melhor sinal.
2. Adição composta
   1. Faça diluições seriais de compostos de teste no DMSO.
      NOTA: As concentrações utilizadas são tipicamente de 10, 30, 100, 300, 1.000 e 3.000 μM.
   2. Adicione 0,25 μL de DMSO (controle negativo) ou peptídeo de terminal C Hsp90 (controle positivo, 30 μM) ou compostos em DMSO até o canto de cada poço da placa. Use triplicados para cada concentração composta.
   3. Adicione 22,5 μL da solução contendo contas doadoras de glutationa com proteínas marcadas pelo GST em cada poço.
   4. Agite a placa suavemente com a mão, mas completamente. Incubar no escuro a 25 °C por 15 min.
      NOTA: Durante este tempo, os compostos interagirão com o domínio TPR no local de ligação de peptídeos do terminal Hsp90.
3. Adição de contas aceitadoras
   1. Diluir as contas aceitadoras com peptídeo de terminal Hsp90 C anexado a 100 μg/mL em PBS de 0,5x.
   2. Adicione 2,25 μL de contas aceitadoras diluídas a cada poço.
   3. Misture suavemente, mas bem. Incubar no escuro a 25 °C por 15 min.
      NOTA: Nesta etapa, as contas doador e aceitadora são trazidas para a proximidade pelas interações proteína-peptídeo. O volume final da mistura de reação é de 25 μL. Portanto, as concentrações finais dos compostos variam de 0,1 a 30 μM.
4. Leitura de placas
   NOTA: Leia a placa usando um conjunto de leitor de placas no modo relevante.
   1. Ligue o instrumento e abra o software
   2. Escolha o protocolo relevante.
   3. Clique em Editar mapa da placa e selecione o bem que está sendo usado na placa para medição.
   4. Clique em Seguir para continuar e Execute o protocolo selecionado.
   5. Após a medição, clique em Mostrar resultados para ver os resultados.
   6. Exportar os dados.

4. Análise de dados

1. Fator Z e relação sinal-fundo (S/B)
   1. Calcule o fator Z e a razão S/B para o ensaio usando a seguinte equação:
      Z'=1-(3σpos+3σneg)/│μpos-μneg│¹⁶
      S/B=μneg/μpos
      onde, σ e μ representam os desvios padrão e meios dos controles positivo (peptídeo terminal Hsp90 C, 30 μM) e negativo (DMSO), respectivamente. Um fator Z > 0,5 garantirá que o ensaio seja robusto o suficiente para a triagem. Para monitorar a sensibilidade do ensaio, a razão S/B também foi calculada.
2. Curva dose-resposta e IC ₅₀
   NOTA: Use a análise de regressão não linear para se adequar aos dados dos inibidores do PPI Hsp90-cochaperonas por software.
   1. Crie uma tabela de dados XY na caixa de diálogo Bem-vindo e selecione X Numberse Y Enter 3 (se triplicados) replica valores em colunas lado a lado.
   2. Normalize os dados de sinal das amostras para o grupo de controle negativo. Valores de concentração de importação para a coluna X e os valores do sinal para a coluna Y.
   3. Clique em Analisar e escolha Transformar concentração (X) em Transformar | Normalize. Escolha transformar em logaritmos.
      NOTA: Isso transformará a concentração em uma escala de registro. Se a sua concentração inicial for zero, defina-a para um número muito pequeno que é efetivamente zero (por exemplo, 0,1 nM) para não perder esses valores, uma vez que o logaritmo de zero não está definido.
   4. Clique em Analisar e escolha regressão não linear (ajuste de curva) em análises XY,abra a Inibição dose-resposta e escolha Log(inibidor) vs. resposta -- Inclinação variável.
   5. Clique em OK para ver os Resultados (contendo valor ic₅₀₎ e gráficos.

Figura 2: Esquema deste protocolo. (A) Expressão e purificação de GST-FKBP51 e GST-FKBP52. (B) Acoplamento do peptídeo terminal Hsp90 C para as contas aceitadoras. (C) O ensaio que sonda a interação entre GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 e Hsp90 C-terminal peptídeo. Inibição com pequenos compostos de massa molecular. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Em nosso ensaio, o fator Z e a razão S/B são 0,82 e 13,35, respectivamente(Figura 3A),demonstrando que nosso ensaio é robusto e confiável para triagem de alto rendimento. Então usamos para rastrear pequenos compostos moleculares de massa. A Figura 3B apresenta inibição dependente de dose de interações acompanhante-cochaperona com uma pequena molécula selecionada (D10). As curvas de dose-resposta para D10 são geradas pela análise de regressão não li...

Discussão

Aqui descrevemos um protocolo usando o ensaio para triagem de pequenas moléculas inibindo interações entre co-acompanhantes de Hsp90 e TPR-motivo, especialmente FKBP51 e FKBP52. Sua pontuação Z alta (>0,8) demonstra a robustez e confiabilidade para um formato de alto rendimento. Os resultados podem ser obtidos dentro de uma hora, e pequenas quantidades de contas, proteínas e compostos são necessárias. Além disso, este protocolo poderia facilmente ser estendido a qualquer interação de interesse de Hsp90/Hsp70 -...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well plates	Perkin Elmer	6008350	Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit	Millipore	UFC901008	Concentrate protein
Ampicillin	Sigma	A0166	Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010	Heidolph		Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51	Source BioScience	clone id: 5723416	pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52	Source BioScience	clone id: 7474554	pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software	GraphPad Prism	9.0.0	Analysis data and make figures
Data analysis software	Excel		Analysis data
DMSO	Supelco	1.02952.1000	Dilute compounds
DPBS	Gibco	14190-144	Prepare solution
EDTA	Calbiochem	344504	Prevent proteolysis during sonication
Glutathione	Sigma	G-4251	Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads	Perkin Elmer	6765300	Donor bead
GST-trap column	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Thermo Fisher Scientific	R0392	Induce protein expression
LB Broth (Miller)	Sigma	L3522	Microbial growth medium
PCR instrument	BIO-RAD	S1000 Thermal Cycler	Amplification/PCR
PD-10 column	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Solution exchange
pGEX-6P-1 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Plasmid
pGEX-6P-2 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	Plasmid
Plate reader	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Multilabel Reader	Read alpha plate
Plate reader software	Perkin Elmer	EnSpire Manager	Plate reader software
Plate reader software protocol	Perkin Elmer	Alpha 384-well Low volume	Use this protocol to read plate
PMSF	Sigma	P7626	Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail	Sigma	S8830	Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide	Sigma	S2002	As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma	156159	Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform	Peptide 2.0 inc		Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator	LABINCO		Make end-over-end agitation
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20	Sigma	P1379	Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor	Microson		Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads	Perkin Elmer	6762003	Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module	Invitrogen	EI0002	SDS-PAGE