Études des interactions chaperonne-cochapéroé à l’aide d’un essai homogène à base de billes

Résumé

Ce protocole présente une technique pour sonder les interactions protéine-protéine à l’aide de perles de donneur liées au glutathion avec des co-chaperons à motif TPR fusionnés GST et des perles accepteurs couplées à un peptide dérivé de Hsp90. Nous avons utilisé cette technique pour dépister de petites molécules afin de perturber les interactions Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 et identifié des inhibiteurs puissants et sélectifs de l’interaction Hsp90-FKBP51.

Résumé

Le ciblage des interactions protéine de choc thermique 90 (Hsp90)-cochaperone offre la possibilité de réguler spécifiquement les processus intracellulaires dépendants de Hsp90. Le pentapeptide MEEVD conservé à la terminaison C de Hsp90 est responsable de l’interaction avec le motif de répétition tétratricopeptide (TPR) des co-chaperons. FK506-binding protein (FKBP) 51 et FKBP52 sont deux co-chaperons similaires à motif TPR impliqués dans des maladies hormono-dépendantes stéroïdiennes avec des fonctions différentes. Par conséquent, l’identification de molécules bloquant spécifiquement les interactions entre Hsp90 et FKBP51 ou FKBP52 offre un potentiel thérapeutique prometteur pour plusieurs maladies humaines. Nous décrivons ici le protocole d’un test homogène de proximité luminescente amplifié pour sonder les interactions entre Hsp90 et ses co-chaperons partenaires FKBP51 et FKBP52. Tout d’abord, nous avons purifié les protéines FKBP51 et FKBP52 contenant des motifs TPR sous forme marquée glutathion S-transférase (GST). En utilisant les perles de donneur liées au glutathion avec des protéines À motif TPR fusionnées à la TPS et les perles accepteurs couplées à un peptide C-terminal 10-mer de Hsp90, nous avons sondé les interactions protéine-protéine dans un environnement homogène. Nous avons utilisé ce test pour dépister de petites molécules afin de perturber les interactions Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 et identifié des inhibiteurs puissants et sélectifs de l’interaction Hsp90-FKBP51.

Introduction

Les chaperons moléculaires contribuent à l’homéostasie des protéines, y compris le repliement, le transport et la dégradation des protéines. Ils régulent plusieurs processus cellulaires et sont liés à de nombreuses maladies telles que le cancer et les maladies neurodégénératives¹. La protéine de choc thermique 90 (Hsp90) est l’un des chaperons les plus importants dont la fonction dépend des changements conformationnels entraînés par l’hydrolyse de l’ATP et la liaison avec les protéines clientes médiées par ses co-chaperons^2. Malgré un potentiel évident de Hsp90 en tant que cible thérapeutique, affiner sa fonction représente un grand défi. Il existe plusieurs inhibiteurs de Hsp90 ciblant la région de liaison de l’ATP N-terminal, qui ont été évalués dans des essais cliniques, mais aucun d’entre eux n’a été approuvé pour la^{commercialisation 3}. En raison de l’absence d’une poche de liaison au ligand⁴bien définie, le ciblage de la région C-terminale de Hsp90 a eu un succès limité⁴. Récemment, la perturbation des interactions Hsp90-cochaperone par de petites molécules a été étudiée comme stratégie alternative^5. Le ciblage des interactions Hsp90-cochaperone ne provoquerait pas de réponse générale au stress cellulaire et offre la possibilité de réguler spécifiquement divers processus intracellulaires. Le pentapeptide MEEVD conservé à la terminaison C de Hsp90 est responsable de l’interaction avec le motif de répétition tétratricopeptide (TPR) des co-chaperons⁶. Sur les 736 protéines contenant des motifs TPR annotées dans la base de données des protéines humaines, environ 20 protéines différentes interagissent avec Hsp90 via ce peptide^7. Les molécules en concurrence pour la liaison peptidique MEEVD perturberaient les interactions entre Hsp90 et les co-chaperons contenant un domaine TPR. Le site de liaison peptidique a une structure tertiaire similaire, mais l’homologie globale entre les différents domaines du motif TPR est relativement faible^7,ce qui offre la possibilité d’identifier des molécules spécifiquement capables de bloquer les interactions entre Hsp90 et des co-chaperons particuliers à motif TPR. Parmi ces co-chaperons à motif TPR, la protéine de liaison FK506 (FKBP) 51 et FKBP52 sont des régulateurs de la signalisation des récepteurs hormonaux stéroïdiens (SHR) et impliqués dans plusieurs maladies hormono-dépendantes des stéroïdes, y compris le cancer, les maladies liées au stress, les maladies métaboliques et la maladie d’Alzheimer⁸. Bien que FKBP51 et FKBP52 partagent > similitude de séquence de 80%, leurs fonctions diffèrent: FKBP52 est un régulateur positif de l’activité SHR, tandis que FKBP51 est un régulateur négatif dans la plupart des cas⁸. Par conséquent, l’identification de molécules, bloquant spécifiquement les interactions entre Hsp90 et FKBP51 ou FKBP52, offre un potentiel thérapeutique prometteur pour les maladies connexes.

Unessai amplifié Luminescent Proximity Homogenous A(AlphaScreen) a été développé pour la première fois en 1994 par Ullman EF et al.^9. Maintenant, il est largement utilisé pour détecter différents types d’interactions biologiques, telles que le^{peptide 10,}la protéine^11,l’ADN^12,l’ARN¹³et le sucre^14. Dans cette technique, il existe deux types de perles (diamètre 200 nm), l’une est la perle donneuse et l’autre est la perle accepteuse. Les biomolécules sont immobilisées sur ces perles; leurs interactions biologiques rapprochent les perles donneuses et accepteuses. À 680 nm, un photosensibilisateur dans la perle du donneur éclaire et convertit l’oxygène en oxygène syté. Parce que l’oxygène syt a une courte durée de vie, il ne peut diffuser que jusqu’à 200 nm. Si la bille accepteur est à proximité, son dérivé de thioxène réagit avec l’oxygène singulet générant une chimiluminescence à 370 nm. Cette énergie active en outre les fluorophores dans la même bille accepteur pour émettre de la lumière à 520-620 nm¹⁵. Si les interactions biologiques sont perturbées, la perle accepteur et la perle donneuse ne peuvent pas atteindre la proximité, ce qui entraîne la désintégration de l’oxygène syulet et un faible signal produit.

Nous décrivons ici un protocole utilisant cette technique pour le criblage de petites molécules inhibant les interactions entre Hsp90 et les co-chaperons TPR, en particulier FKBP51 et FKBP52. Les 10 peptides longs d’acides aminés correspondant à Hsp90 extrême C-terminus sont attachés à des billes acceptrices. Les co-chaperons TPR purifiés marqués de la TPS interagissent avec les perles de donneurs liées au glutathion. Lorsque l’interaction entre les peptides dérivés de Hsp90 et les co-chaperons à motif TPR rassemble les billes, un signal amplifié est produit(Figure 1A). Si les petites molécules criblées peuvent inhiber les interactions entre Hsp90 et les co-chaperons à motif TPR, ce signal amplifié sera diminué(Figure 1B). Leur IC₅₀ peut être calculé par mesure quantitative. Ce protocole peut être étendu à toutes les interactions chaperon -TPR-motif co-chaperon d’intérêt et est d’une grande importance dans le développement de nouvelles molécules, bloquant spécifiquement l’interaction entre Hsp90 et FKBP51 ou FKBP52.

Figure 1: Principe de base de ce test. (A) La GST-FKBP51 purifiée interagit avec les billes de donneur liées au glutathion. Les 10 peptides longs d’acides aminés correspondant à l’extrême C-terminus de Hsp90 sont attachés à des billes acceptrices. L’interaction entre les peptides dérivés de Hsp90 et le domaine TPR de FKBP51 rapproche les perles donneuses et acceptrices. À 680 nm, un photosensibilisateur dans la perle du donneur éclaire et convertit l’oxygène en oxygène syté. Le dérivé de thioxène sur la bille accepteur réagit avec l’oxygène syt et génère une chimiluminescence à 370 nm. Cette énergie active en outre les fluorophores dans la même bille accepteur pour émettre de la lumière à 520-620 nm. (B) Lorsque de petites molécules inhibent les interactions entre Hsp90 et FKBP51, les perles donneuses et acceptatrices ne peuvent pas atteindre la proximité. Ensuite, l’oxygène syt avec une courte durée de vie se désintègre et aucun signal détectable n’est produit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

Remarque : Une vue d’ensemble de ce protocole est illustrée à la figure 2.

1. Expression et purification de la TPS-FKBP51 et de la TPS-FKBP52 (Figure 2A)

1. Plasmides
   REMARQUE: Obtenez des clones d’ADNc pour FKBP51 humain (id de clone: 5723416) et pour FKBP52 humain (ID de clone: 7474554) auprès du consortium IMAGE.
   1. Amplifier l’ADN FKBP51 humain par PCR avec des amorces (en avant; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', inverse; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTCTCCAC-3') contenant des surplombs BamHI et XhoI et cloner en vecteur pGEX6-1 sur les sites de restriction BamHI / XhoI.
   2. Amplifier l’ADN FKBP52 humain par PCR avec des amorces (en avant; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', inverse; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTCTCCAC-3') contenant des surplombs EcoRI et XhoI et cloner en vecteur pGEX6-2 sur les sites de restriction EcoRI / XhoI.
      REMARQUE: La configuration et les conditions de la réaction par PCR sont indiquées dans les tableaux 1 et 2.
   3. Vérifier la séquence insérée et transformer les plasmides en E. coli chimiquement compétent selon le protocole de fabrication.
2. Expression et purification des protéines
   1. Ajouter 25 g de bouillon Luria (LB) dans 1 L d’eau distillée pour faire la solution LB. Autoclavez-le à 121 °C pendant 15 min. Après refroidissement, ajouter 50 μg/mL d’ampicilline.
   2. Prendre une colonie de bactéries exprimant GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 et mélanger avec 500 μL de solution LB dans un tube de 1,5 mL. Tourbillon.
   3. Ajouter le mélange de « 1.2.2 » dans 1 L de solution LB dans la fiole Erlenmeyer recouverte d’une feuille d’aluminium. Incuber la fiole d’Erlenmeyer dans le shaker pendant la nuit à 37 °C.
   4. Induire l’expression des protéines en ajoutant 1 mM d’isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) à la fiole d’Erlenmeyer et poursuivre l’incubation pendant encore 2 h.
   5. Pour obtenir des pastilles de cellule, centrifuger à 5 000 x g pendant 15 min. Retirez le surnageant.
      REMARQUE: Les granulés de cellule peuvent être stockés à -20 ° C.
   6. Resuspendez les pastilles cellulaires dans 40 mL de PBS et soniquez 3 x 20 s sur de la glace. Ajouter 1 mM pmSF, 1 mM EDTA et un cocktail d’inhibiteurs de protéase (1 comprimé) pour prévenir la protéolyse.
   7. Centrifuger la suspension pendant 30 min 50 000 x g pour éliminer les débris cellulaires et appliquer le surnageant sur une colonne de piège GST de 5 mL.
   8. Après avoir lavé la colonne avec 30 mL de PBS, éluez GST-FKBP51 et GST-FKBP52 avec 5 mL de glutathion de 10 mM dans du PBS.
   9. Protéines concentrées sur une unité de centrifugation de 15 mL 10.000 MWCO. Pour éliminer le glutathion libre, passez les concentrés à travers la colonne PD-10 équilibrés avec 0,5x PBS et concentrez-vous à nouveau sur le dispositif de centrifugeuse filtrante.
   10. Recueillir les fractions contenant des protéines. Vérifiez les protéines dans SDS-PAGE et ajustez les concentrations de protéines à 1 mg/mL.
       REMARQUE: Le rendement en protéines typique est de 2-5 mg / L de culture. La protéine peut être stockée à -20 °C.

2. Couplage du peptide C-terminal Hsp90 aux billes acceptrices (Figure 2B)

1. Préparation peptidique Hsp90
   1. Synthétiser dixacides aminés peptide NH 2-EDASRMEEVD-COOH correspondant aux acides aminés 714-724 de l’isoforme bêta Hsp90 humaine (UniProt ID: P08238) par un service de synthèse peptidique.
   2. Diluer le peptide Hsp90 dans le PBS à une concentration de 1 mg/mL.
2. Préparation des perles d’accepteur
   1. Diluer les billes d’accepteur non conjuguées dans du PBS à une concentration de 1 mg/mL et transférer dans un tube de 1,5 mL.
   2. Effectuer le lavage par centrifugation à 16 000 x g pendant 15 min. Retirez soigneusement le surnageant.
3. Conjugaison
   1. Définissez le rapport entre les perles et le peptide sur 10:1. Dans le tube de 1,5 mL contenant 1 mg de pastille de bille accepteur (préparé comme décrit ci-dessus), ajouter 1 mL de PBS (pH 7,4), 0,1 mg de peptide dilué, 1,25 μL de Tween-20, 10 μL d’une solution de cyanoborohydrure de sodium (NaBH₃CN) de 400 mM dans l’eau.
      ATTENTION : NaBH3CN est toxique; utilisez une hotte et des gants. La solution de NaBH₃CN doit être fraîchement préparée.
   2. Incuber pendant 24 h à 37 °C avec agitation bout à bout (10-20 tr/min) sur un agitateur rotatif.
4. Trempe par réaction et lavage des billes
   1. Ajouter 20 μL de solution de Tris-HCl (pH 8,0) de 1 M à la réaction pour bloquer les sites qui n’ont pas réagi. Incuber pendant 1 h à 37 °C.
   2. Centrifuger à 16 000 x g (ou vitesse maximale) pendant 15 min à 4 °C. Retirer le surnageant et resussuspener la pastille de bille dans 1 mL de solution de Tris-HCl (100 mM, pH 8,0).
   3. Répétez l’étape de lavage trois fois.
   4. Après la dernière centrifugation, remise en service des billes à 1 mg/mL dans un tampon de stockage (1 mL de 0,5 × PBS avec 0,01 % d’azide de sodium comme agent de conservation). Conserver la solution de billes accepteurs conjuguées à 4 °C à l’abri de la lumière.
      ATTENTION: L’azide de sodium est toxique; utilisez une hotte et des gants.

3. Le test sondant l’interaction entre GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 et le peptide C-terminal Hsp90, et l’inhibition avec des composés de petite masse moléculaire (Figure 2C)

1. Protéines marquées GST interagissant avec des billes de donneurs de glutathion
   1. Mettez en place les réactions dans des plaques de 384 puits.
   2. Préparer la solution contenant 10 μg/mL de billes donneuses de glutathion dans 0,5x PBS, pH 7,4.
      REMARQUE: Après un stockage prolongé, les perles se déposent et doivent être tourbillondées.
   3. Ajouter GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 à une concentration finale de 10 μg/mL.
   4. Incuber dans l’obscurité à 25 °C pendant 10 min.
      REMARQUE: À cette étape, les protéines marquées GST interagiront avec le glutathion attaché aux perles. Pour chaque puits, 22,5 μL de ce mélange seront utilisés. La concentration des partenaires contraignants doit être déterminée empiriquement. Titrez GST-FKBP51 et GST-FKBP52 et choisissez la concentration qui donne le meilleur signal.
2. Ajout de composé
   1. Effectuer des dilutions en série de composés d’essai dans le DMSO.
      REMARQUE: Les concentrations utilisées sont généralement de 10, 30, 100, 300, 1 000 et 3 000 μM.
   2. Ajouter 0,25 μL de DMSO (contrôle négatif) ou de peptide C-terminal Hsp90 (contrôle positif, 30 μM) ou de composés dans le DMSO au coin de chaque puits de la plaque. Utilisez des triples pour chaque concentration de composé.
   3. Ajouter 22,5 μL de la solution contenant des perles de donneur de glutathion avec des protéines marquées GST à chaque puits.
   4. Serrez l’assiette doucement avec la main mais à fond. Incuber dans l’obscurité à 25 °C pendant 15 min.
      REMARQUE: Pendant ce temps, les composés interagiront avec le domaine TPR au site de liaison peptidique Hsp90 C-terminal.
3. Ajout de perles d’accepteur
   1. Diluer les billes acceptatrices avec le peptide C-terminal Hsp90 attaché à 100 μg/mL dans 0,5x PBS.
   2. Ajouter 2,25 μL de billes d’accepteur diluées à chaque puits.
   3. Mélanger doucement mais bien. Incuber dans l’obscurité à 25 °C pendant 15 min.
      REMARQUE: À cette étape, les billes du donneur et de l’accepteur sont rapprochées par les interactions protéine-peptide. Le volume final du mélange réactionnel est de 25 μL. Par conséquent, les concentrations finales de composés varient de 0,1 à 30 μM.
4. Lecture de plaques
   REMARQUE: Lisez la plaque à l’aide d’un lecteur de plaque réglé dans le mode approprié.
   1. Allumez l’instrument et ouvrez le logiciel
   2. Choisissez le protocole approprié.
   3. Cliquez sur Modifier la carte de la plaque et sélectionnez le puits utilisé dans la plaque pour la mesure.
   4. Cliquez sur Suivant pour continuer et exécuter le protocole sélectionné.
   5. Après la mesure, cliquez sur Afficher les résultats pour afficher les résultats.
   6. Exportez les données.

4. Analyse des données

1. Facteur Z' et rapport signal/arrière-plan (S/B)
   1. Calculez le facteur Z' et le rapport S/B pour le dosage à l’aide de l’équation suivante :
      Z'=1-(3σpos+3σneg)/│μpos-μneg│¹⁶
      S/B=μneg/μpos
      où, σ et μ représentent les écarts-types et les moyennes des témoins positifs (Hsp90 C-terminal peptide, 30 μM) et négatifs (DMSO), respectivement. Un facteur Z' > 0,5 garantira que le test est suffisamment robuste pour le dépistage. Pour surveiller la sensibilité du test, le rapport S / B a également été calculé.
2. Courbe dose-réponse et CI ₅₀
   REMARQUE: Utilisez une analyse de régression non linéaire pour ajuster les données des inhibiteurs de l’IPP Hsp90-cochaperones par logiciel.
   1. Créez une table de données XY dans la boîte de dialogue Bienvenue et sélectionnez X Numbers, et Y Enter 3 (si triplé) réplique les valeurs dans des colonnes côte à côte.
   2. Normaliser les données de signal des échantillons au groupe témoin négatif. Importez les valeurs de concentration dans la colonne X et les valeurs de signal dans la colonne Y.
   3. Cliquez sur Analyser et choisissez Transformer la concentration (X) sous Transformer | Normaliser. Choisissez Transformer en logarithmes.
      REMARQUE: Cela transformera la concentration en une échelle logarithmique. Si votre concentration de départ est nulle, réglez-la sur un très petit nombre qui est effectivement nul (par exemple, 0,1 nM) pour ne pas perdre ces valeurs puisque le logarithme de zéro n’est pas défini.
   4. Cliquez sur Analyser et choisissez Régression non linéaire (ajustement de courbe) sous Analyses XY, ouvrez l’inhibition dose-réponse et choisissez Log(inhibiteur) vs réponse -- Pente variable.
   5. Cliquez sur OK pour afficher les résultats (contenant la valeur IC₅₀₎ et les graphiques.

Figure 2: Schéma de ce protocole. (A) Expression et purification de la TPS-FKBP51 et de la TPS-FKBP52. (B) Couplage du peptide C-terminal Hsp90 aux billes acceptrices. (C) Le test sondant l’interaction entre GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 et Hsp90 C-terminal peptide. Inhibition avec des composés de petite masse moléculaire. Créé avec BioRender.com Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Résultats

Dans notre essai, le facteur Z' et le rapport S/B sont respectivement de 0,82 et 13,35(figure 3A),ce qui démontre que notre essai est robuste et fiable pour le criblage à haut débit. Nous l’avons ensuite utilisé pour filtrer de petits composés de masse moléculaire. La figure 3B présente l’inhibition dose-dépendante des interactions chaperon-cochaperone avec une petite molécule sélectionnée (D10). Les courbes dose-réponse pour D10 sont générées...

Discussion

Nous décrivons ici un protocole utilisant le test pour le criblage de petites molécules inhibant les interactions entre Hsp90 et les co-chaperons à motif TPR, en particulier FKBP51 et FKBP52. Son score Z' élevé (>0,8) démontre la robustesse et la fiabilité d’un format à haut débit. Les résultats peuvent être obtenus en une heure et de petites quantités de perles, de protéines et de composés sont nécessaires. De plus, ce protocole pourrait facilement être étendu à toutes les interactions de co-chaperon...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well plates	Perkin Elmer	6008350	Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit	Millipore	UFC901008	Concentrate protein
Ampicillin	Sigma	A0166	Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010	Heidolph		Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51	Source BioScience	clone id: 5723416	pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52	Source BioScience	clone id: 7474554	pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software	GraphPad Prism	9.0.0	Analysis data and make figures
Data analysis software	Excel		Analysis data
DMSO	Supelco	1.02952.1000	Dilute compounds
DPBS	Gibco	14190-144	Prepare solution
EDTA	Calbiochem	344504	Prevent proteolysis during sonication
Glutathione	Sigma	G-4251	Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads	Perkin Elmer	6765300	Donor bead
GST-trap column	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Thermo Fisher Scientific	R0392	Induce protein expression
LB Broth (Miller)	Sigma	L3522	Microbial growth medium
PCR instrument	BIO-RAD	S1000 Thermal Cycler	Amplification/PCR
PD-10 column	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Solution exchange
pGEX-6P-1 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Plasmid
pGEX-6P-2 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	Plasmid
Plate reader	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Multilabel Reader	Read alpha plate
Plate reader software	Perkin Elmer	EnSpire Manager	Plate reader software
Plate reader software protocol	Perkin Elmer	Alpha 384-well Low volume	Use this protocol to read plate
PMSF	Sigma	P7626	Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail	Sigma	S8830	Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide	Sigma	S2002	As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma	156159	Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform	Peptide 2.0 inc		Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator	LABINCO		Make end-over-end agitation
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20	Sigma	P1379	Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor	Microson		Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads	Perkin Elmer	6762003	Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module	Invitrogen	EI0002	SDS-PAGE