Homojen Boncuk Bazlı Test Kullanılarak Chaperone-Cochaperone Etkileşimleri Çalışmaları

Özet

Bu protokol, GST ile kaynaşmış TPR motifli yardımcı refakatçiler ve Hsp90 türevli peptit ile birleştirilmiş alıcı boncuklar ile glutatyon bağlantılı donör boncuklar kullanarak protein-protein etkileşimlerini yoklama tekniği sunar. Bu tekniği, Hsp90-FKBP51 veya Hsp90-FKBP52 etkileşimlerini bozmak için küçük molekülleri taramak için kullandık ve güçlü ve seçici Hsp90-FKBP51 etkileşim inhibitörlerini belirledik.

Özet

Isı şok proteini 90 (Hsp90)-cochaperone etkileşimlerinin hedeflenerek Hsp90'a bağımlı hücre içi süreçleri özel olarak düzenleme imkanı sağlar. Hsp90'ın C-terminusundaki korunmuş MEEVD pentapeptid, eş refakatçilerin tetratrikopeptid tekrarı (TPR) motifi ile etkileşimden sorumludur. FK506 bağlayıcı protein (FKBP) 51 ve FKBP52, farklı işlevlere sahip steroid hormona bağımlı hastalıklarda yer alan iki benzer TPR motifli yardımcı refakatçidir. Bu nedenle, özellikle Hsp90 ve FKBP51 veya FKBP52 arasındaki etkileşimleri engelleyen moleküllerin tanımlanması, birkaç insan hastalığı için umut verici bir terapötik potansiyel sağlar. Burada, Hsp90 ve ortağı ortak refakatçiler FKBP51 ve FKBP52 arasındaki etkileşimleri araştırmak için güçlendirilmiş bir lüminesans yakınlık homojen test protokolünü açıklıyoruz. İlk olarak, TPR motif içeren proteinler FKBP51 ve FKBP52'yi glutatyon S-transferaz (GST) etiketli formda saflaştırdık. GST ile kaynaşmış TPR motifli proteinler ile glutatyon bağlantılı donör boncukları ve Hsp90'ın 10 mer C-terminal peptidi ile birleştirilmiş alıcı boncukları kullanarak, homojen bir ortamda protein-protein etkileşimlerini araştırdık. Bu testi, Hsp90-FKBP51 veya Hsp90-FKBP52 etkileşimlerini bozmak için küçük molekülleri taramak için kullandık ve güçlü ve seçici Hsp90-FKBP51 etkileşim inhibitörlerini belirledik.

Giriş

Moleküler refakatçiler protein katlanması, taşınması ve bozulması da dahil olmak üzere protein homeostazlarına katkıda bulunur. Birkaç hücresel süreci düzenlerler ve kanser ve nörodejeneratif hastalıklar gibi çok sayıda hastalıkla bağlantılıdırlar¹. Isı şoku proteini 90 (Hsp90), işlevi ATP hidrolizi tarafından yönlendirilen konformasyonel değişikliklere ve yardımcı refakatçilerinin aracılık ettiği müşteri proteinleri ile bağlanmasına bağlı olan en önemli refakatçilerden biridir². Hsp90'ın terapötik hedef olarak bariz bir potansiyeline rağmen, işlevinin ince ayarını büyük bir zorluk temsil eder. Klinik çalışmalarda değerlendirilen N-terminal ATP bağlama bölgesini hedefleyen birkaç Hsp90 inhibitörü vardır, ancak hiçbiri pazarlama için onaylanmamıştır³. İyi tanımlanmış bir ligand bağlayıcı cep olmaması nedeniyle⁴, Hsp90'ın C terminali bölgesini hedeflemek sınırlı başarıya sahipti⁴. Son zamanlarda, Hsp90-cochaperone etkileşimlerinin küçük moleküller tarafından bozulması alternatif bir strateji olarak araştırılmıştır⁵. Hsp90-cochaperone etkileşimlerinin hedeflmesi genel hücre stres tepkisi oluşturmaz ve çeşitli hücre içi süreçleri özel olarak düzenleme olanağı sağlar. Hsp90'ın C-terminus'ında korunan MEEVD pentapeptid, eş refakatçilerin tetratrikopeptid tekrarı (TPR) motifi⁶ile etkileşimden sorumludur. İnsan protein veritabanında açıklamalı 736 TPR motif içeren proteinden~ 20 farklı protein bu peptit aracılığıyla Hsp90 ile etkileşime girer⁷. MEEVD peptit bağlama için yarışan moleküller, Hsp90 ve TPR alanı içeren yardımcı refakatçiler arasındaki etkileşimleri bozayar. Peptit bağlama bölgesi benzer üçüncül yapıya sahiptir, ancak farklı TPR motif alanları arasındaki genel homoloji nispeten düşüktür⁷Özellikle Hsp90 ve belirli TPR motifli yardımcı refakatçiler arasındaki etkileşimleri engelleyebilen molekülleri tanımlamak için bir fırsat sağlar. Bu TPR motifli yardımcı refakatçiler arasında, FK506 bağlayıcı protein (FKBP) 51 ve FKBP52 steroid hormon reseptör (SHR) sinyal düzenleyicileri ve kanser, strese bağlı hastalıklar, metabolik hastalıklar ve Alzheimer hastalığı dahil olmak üzere çeşitli steroid hormon bağımlı hastalıklara dahil⁸vardır. FKBP51 ve FKBP52% 80 sıra benzerliğini > paylaşsa da, işlevleri farklıdır: FKBP52 SHR aktivitesinin pozitif bir düzenleyicisidir, FKBP51 ise çoğu durumda negatif bir düzenleyicidir⁸. Bu nedenle, moleküllerin tanımlanması, özellikle Hsp90 ve FKBP51 veya FKBP52 arasındaki etkileşimleri bloke etmek, ilgili hastalıklar için umut verici bir terapötik potansiyel sağlar.

Mplified Luminescent Proximity Homogenous Assay (AlphaScreen) ilk olarak 1994 yılında Ullman EF ve ark.⁹tarafından geliştirilmiştir. Şimdi peptit 10 , protein¹¹, DNA 12 , RNA¹³ve şeker¹⁴gibi farklı biyolojik etkileşim türlerini tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu teknikte iki çeşit boncuk (çap 200 nm), biri donör boncuk, diğeri kabul eden boncuk vardır. Biyomoleküller bu boncukların üzerine hareketsiz hale getirilir; biyolojik etkileşimleri donör ve alıcı boncukları yakınlığa getirir. 680 nm'de, donör boncuktaki bir ışığa duyarlılıklayıcı oksijeni aydınlatır ve tek oksijene dönüştürür. Tek oksijenin ömrü kısa olduğu için sadece 200 nm'ye kadar yayılabilir. Kabul eden boncuk yakınsa, tiyoksen türevi 370 nm'de tek oksijen üreten chemiluminescence ile reaksiyona gelir. Bu enerji, 520-620 nm^15'teışık yaymak için aynı kabul edici boncuktaki floroforları daha da aktive eder. Biyolojik etkileşimler bozulursa, alıcı boncuk ve donör boncuk yakınlığa ulaşamaz, bu da tek oksijen çürümesine ve düşük üretilen sinyale neden olur.

Burada, başta FKBP51 ve FKBP52 olmak üzere Hsp90 ve TPR yardımcı refakatçileri arasındaki etkileşimleri engelleyen küçük molekülleri taramak için bu tekniği kullanan bir protokol açıklıyoruz. Hsp90 aşırı C-terminusuna karşılık gelen 10 amino asit uzunluğunda peptit, kabul eden boncuklara bağlanır. Saflaştırılmış GST etiketli TPR yardımcı refakatçileri glutatyon bağlantılı donör boncuklarla etkileşime girer. Hsp90 türevi peptitler ve TPR motifli yardımcı refakatçiler arasındaki etkileşim boncukları bir araya getirdiğinde, güçlendirilmiş bir sinyal üretilir (Şekil 1A). Taranmış küçük moleküller Hsp90 ve TPR motifli yardımcı refakatçiler arasındaki etkileşimleri engelleyebilirse, bu güçlendirilmiş sinyal azaltılacaktır (Şekil 1B). IC_50'leri nicel ölçümle hesaplanabilir. Bu protokol herhangi bir refakatçiye genişletilebilir - TPR motifli ortak refakatçi etkileşimleri ilgi çekicidir ve özellikle Hsp90 ve FKBP51 veya FKBP52 arasındaki etkileşimi engelleyen yeni moleküllerin geliştirilmesinde büyük önem taşır.

Şekil 1: Bu tahlilin temel prensibi. (A) Saflaştırılmış GST-FKBP51 glutatyon bağlantılı donör boncuklarla etkileşime girer. Hsp90'ın aşırı C-terminusuna karşılık gelen 10 amino asit uzunluğundaki peptitler kabul eden boncuklara bağlanır. Hsp90 türevi peptitler ile FKBP51'in TPR etki alanı arasındaki etkileşim, donör ve alıcı boncukları yakınlığa getirir. 680 nm'de, donör boncuktaki bir ışığa duyarlılıklayıcı oksijeni aydınlatır ve tek oksijene dönüştürür. Kabul eden boncuk üzerindeki tiyoksin türevi singlet oksijen ile reaksiyona sokur ve 370 nm'de chemiluminescence üretir. Bu enerji, 520-620 nm'de ışık yaymak için aynı kabul edici boncuktaki floroforları daha da aktive eder. (B) Küçük moleküller Hsp90 ve FKBP51 arasındaki etkileşimleri engellediğinde, donör ve alıcı boncuklar yakınlığa ulaşamaz. Daha sonra kısa ömürlü tek oksijen bozunur ve tespit edilebilir bir sinyal üretilmez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

NOT: Bu protokole genel bir bakış Şekil 2'de gösterilmiştir.

1. GST-FKBP51 ve GST-FKBP52'nin ekspresyy edilmesi ve saflaştırılması (Şekil 2A)

1. Plazmid
   NOT: IMAGE konsorsiyumundan insan FKBP51 (klonlama kimliği: 5723416) ve insan FKBP52 (klon kimliği: 7474554) için cDNA klonları edinin.
   1. BamHI ve XhoI çıkıntılarını içeren pcr ile pcr tarafından insan FKBP51 DNA'sını güçlendirin (ileri; 5'GGATCCATACTACTGATGAAGGT-3', ters; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') BamHI ve XhoI çıkıntılarını içerir ve BamHI / XhoI kısıtlama bölgelerinde pGEX6-1 vektörüne klonlar.
   2. EcoRI ve XhoI çıkıntılarını içeren pcr ile pcr tarafından insan FKBP52 DNA'sını güçlendirin (ileri; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', ters; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') EcoRI ve XhoI çıkıntılarını içerir ve EcoRI / XhoI kısıtlama sahalarında pGEX6-2 vektörüne klonlayın.
      NOT: PCR reaksiyon kurulumu ve koşulları Tablo 1 ve Tablo 2'degösterilmiştir.
   3. Eklenen sırayı doğrulayın ve plazmidleri üretim protokolüne göre kimyasal olarak yetkin E. coli'ye dönüştürün.
2. Protein ekspresyyürü ve saflaştırma
   1. LB çözeltisini yapmak için 1 L damıtılmış suya 25 g Luria suyu (LB) tabanı ekleyin. 15 dakika boyunca 121 °C'de otoklavlav. Soğudktan sonra 50 μg/mL ampisilin ekleyin.
   2. GST-FKBP51 veya GST-FKBP52'yi ifade eden bir bakteri kolonisi alın ve 1,5 mL'lik bir tüpte 500 μL LB çözeltisi ile karıştırın. Girdap.
   3. Alüminyum folyo ile kaplanmış Erlenmeyer şişesinde 1 L LB çözeltisine "1.2.2" karışımını ekleyin. Erlenmeyer şişesini 37 °C'de bir gecede çalkalayıcıya inküb kuluçkaya yatırın.
   4. Erlenmeyer şişesine 1 mM izopropil-β-D-tiyogalactoside (IPTG) ekleyerek protein ekspresyonunu teşvik edin ve kuluçkaya 2 saat daha devam edin.
   5. Hücre peletleri almak için, 15 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüj. Üsttekini çıkarın.
      NOT: Hücre peletleri -20 °C'de saklanabilir.
   6. Hücre peletlerini 40 mL PBS'de yeniden dirildi ve buz üzerinde 3 x 20 sn sonicate. Proteolizi önlemek için 1 mM PMSF, 1 mM EDTA ve proteaz inhibitörü kokteyli (1 tablet) ekleyin.
   7. Hücre kalıntılarını gidermek ve süpernatantı 5 mL GST tuzak sütununa uygulamak için süspansiyonu 30 dk 50.000 x g santrifüj edin.
   8. Sütunu 30 mL PBS ile yıkadıktan sonra, PBS'de 5 mL 10 mM glutatyon ile GST-FKBP51 ve GST-FKBP52'yi elüte edin.
   9. Proteinleri 15 mL 10.000 MWCO santrifüj ünitesine yoğunlaştır. Serbest glutatyonu çıkarmak için, konsantreleri 0,5x PBS ile dengelenmiş PD-10 kolonlarından geçirin ve tekrar filtre santrifüj cihazına konsantre olun.
   10. Protein içeren fraksiyonları toplayın. SDS-PAGE'deki proteinleri doğrulayın ve protein konsantrasyonlarını 1 mg/mL'ye ayarlayın.
       NOT: Tipik protein verimi 2-5 mg/L kültürüdür. Protein -20 °C'de saklanabilir.

2. Hsp90 C-terminal peptidinin kabul eden boncuklara bağlanması (Şekil 2B)

1. Hsp90 peptit hazırlama
   1. Bir peptit sentez servisi tarafından insanHsp90 beta izoformunun (UniProt ID: P08238) amino asitleri 714-724'e karşılık gelen on amino asit peptit NH 2 -EDASRMEEVD-COOH sentezleyin.
   2. Hsp90 peptidi PBS'de 1 mg/mL konsantrasyonda seyreltin.
2. Kabul eden boncuk hazırlama
   1. Yargısız kabul eden boncukları PBS'de 1 mg/mL konsantrasyona seyreltin ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
   2. Yıkamayı 15 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleme ile gerçekleştirin. Üst saltanayı dikkatlice çıkarın.
3. Konjugasyon
   1. Boncuk ve peptit arasındaki oranı 10:1 olarak ayarlayın. 1 mg kabul edici boncuk pelet içeren 1,5 mL tüpte (yukarıda açıklandığı gibi), 1 mL PBS (pH 7.4), 0.1 mg seyreltilmiş peptit ekleyin, 1.25 μL ara-20, 10 μL 400 mM sodyum sitanoborohidrit çözeltisi (NaBH₃CN) suda.
      DİkKAT: NaBH3CN toksiktir; duman kapüşonu ve eldiven kullanın. NaBH₃CN çözeltisi taze hazırlanmalıdır.
   2. Döner çalkalayıcı üzerinde uç-uç ajitasyon (10-20 rpm) ile 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yaslanın.
4. Reaksiyon söndürme ve boncuk yıkama
   1. Tepkisiz siteleri engellemek için reaksiyona 20 μL 1 M Tris-HCl (pH 8.0) çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.
   2. 4 °C'de 15 dakika boyunca 16.000 x g'da (veya maksimum hızda) santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve boncuk peletini 1 mL Tris-HCl çözeltisinde (100 mM, pH 8.0) yeniden kullanın.
   3. Yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
   4. Son santrifüjlemeden sonra, boncukları depolama tamponunda 1 mg/mL'de yeniden depolar (1 mL 0,5 × koruyucu olarak% 0,01 sodyum azit ile PBS). Konjuge kabul eden boncuk çözeltisini 4 °C ışık korumalı olarak saklayın.
      DİkKAT: Sodyum azit toksiktir; duman kapüşonu ve eldiven kullanın.

3. GST-FKBP51 veya GST-FKBP52 ve Hsp90 C-terminal peptit arasındaki etkileşimi ve küçük moleküler kütle bileşikleri ile inhibisyonu araştıran tahlil (Şekil 2C)

1. Glutatyon donör boncuklarla etkileşime giren GST etiketli proteinler
   1. Reaksiyonları 384 kuyu plakasına kurun.
   2. Glutatyon donör boncuklarının 10 μg/mL'lik çözeltisini 0,5x PBS, pH 7,4'te hazırlayın.
      NOT: Uzun süreli depolamadan sonra boncuklar yerleşir ve girdaplı olması gerekir.
   3. 10 μg/mL'lik son konsantrasyona GST-FKBP51 veya GST-FKBP52 ekleyin.
   4. 10 dakika boyunca 25 °C'de karanlıkta kuluçkaya yaslanın.
      NOT: Bu adımda, GST etiketli proteinler boncuklara bağlı glutatyon ile etkileşime girecektir. Her kuyu için, bu karışımın 22,5 μL'si kullanılacaktır. Bağlayıcı ortakların konsantrasyonu ampirik olarak belirlenmelidir. Titrate GST-FKBP51 ve GST-FKBP52 ve en iyi sinyali veren konsantrasyonu seçin.
2. Bileşik ekleme
   1. DMSO'daki test bileşiklerinin seri seyreltmelerini yapın.
      NOT: Kullanılan konsantrasyonlar tipik olarak 10, 30, 100, 300, 1.000 ve 3.000 μM'dir.
   2. Plakanın her kuyusunun köşesine 0,25 μL DMSO (negatif kontrol) veya Hsp90 C-terminal peptit (pozitif kontrol, 30 μM) veya DMSO bileşikleri ekleyin. Her bileşik konsantrasyon için triplicates kullanın.
   3. Her kuyuya GST etiketli proteinli glutatyon donör boncukları içeren çözeltinin 22,5 μL'sini ekleyin.
   4. Tabağı elinizle hafifçe ama iyice sallayın. 15 dakika boyunca 25 °C'de karanlıkta kuluçkaya yaslanın.
      NOT: Bu süre zarfında bileşikler Hsp90 C-terminal peptit bağlama sitesindeki TPR etki alanıyla etkileşime girecektir.
3. Kabul eden boncuk ekleme
   1. Kabul eden boncukları ekli Hsp90 C-terminal peptit ile 0,5x PBS'de 100 μg/mL'ye seyreltin.
   2. Her kuyuya 2,25 μL seyreltilmiş kabul edici boncuk ekleyin.
   3. Hafifçe ama iyice karıştırın. 15 dakika boyunca 25 °C'de karanlıkta kuluçkaya yaslanın.
      NOT: Bu adımda, donör ve kabul eden boncuklar protein-peptit etkileşimleri ile yakınlığa getirilir. Reaksiyon karışımının son hacmi 25 μL'dir. Bu nedenle, bileşiklerin son konsantrasyonları 0,1 ila 30 μM arasında değişiyor.
4. Plaka okuma
   NOT: İlgili modda ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak plakayı okuyun.
   1. Cihazı açın ve yazılımı açın
   2. İlgili protokolü seçin.
   3. Plaka haritasını düzenle'yi tıklatın ve ölçüm için plakada kullanılan kuyuyu seçin.
   4. Devam etmek ve Seçili iletişim kuralını çalıştırmak için İleri'yi tıklatın.
   5. Ölçümden sonra sonuçları görüntülemek için Sonuçları Göster'i tıklatın.
   6. Verileri verin.

4. Veri analizi

1. Z' faktörü ve sinyal-arka plan (S/B) oranı
   1. Aşağıdaki denklemi kullanarak test için Z' faktörünü ve S/B oranını hesaplayın:
      Z'=1-(3φpos+3φneg)/│μpos-μneg│¹⁶
      S/B=μneg/μpos
      burada, σ ve μ sırasıyla pozitif (Hsp90 C-terminal peptit, 30 μM) ve negatif (DMSO) kontrollerinin standart sapmalarını ve araçlarını temsil eder. 0,5 > bir Z faktörü, testlerin tarama için yeterince sağlam olmasını sağlayacaktır. Test hassasiyetini izlemek için S/B oranı da hesaplanmıştır.
2. Doz yanıt eğrisi ve IC ₅₀
   NOT: Hsp90-cochaperones PPI inhibitörlerinin verilerine yazılım tarafından uyacak şekilde doğrusal olmayan regresyon analizi kullanın.
   1. Hoş Geldiniz iletişim kutusunda bir XY veri tablosu oluşturun ve X Numaraları'nı seçin ve Y Enter 3 (üç taraflıysa) yan yana sütunlardaki değerleri çoğaltın.
   2. Numunelerin sinyal verilerini negatif kontrol grubuna normalleştirin. Konsantrasyon değerlerini X sütununa ve sinyal değerlerini Y sütununa içe aktarın.
   3. Çözümle'yi tıklatın ve Dönüştür | altında Dönüştürme konsantrasyonu (X) öğesini seçin Normalleştirin. Logaritmaya Dönüştür 'üseçin.
      NOT: Bu, konsantrasyonu bir günlük ölçeğine dönüştürür. Başlangıç konsantrasyonunuz sıfırsa, sıfır logaritması tanımlanmadığından bu değerleri kaybetmemek için etkili bir şekilde sıfır (örneğin, 0,1 nM) olan çok küçük bir sayıya ayarlayın.
   4. Analiz Et'i tıklatın ve XY analizlerialtında Doğrusal olmayan regresyon (eğri sığdırma) seçeneğini belirleyin, Doz-Yanıt İnhibisyonunu açın ve Log(inhibitör) ile yanıt -- Değişken eğim 'iseçin.
   5. Sonuçları (IC₅₀ değerini içeren) ve Grafiklerigörüntülemek için Tamam 'ı tıklatın.

Şekil 2: Bu protokolün şeması. (A) GST-FKBP51 ve GST-FKBP52'nin ifade edilmesi ve saflaştırılması. (B) Hsp90 C-terminal peptidinin kabul eden boncuklara bağlanması. (C) GST-FKBP51 veya GST-FKBP52 ve Hsp90 C-terminal peptit arasındaki etkileşimi araştıran test. Küçük moleküler kütle bileşikleri ile inhibisyon. BioRender.com ile oluşturuldu Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Tahlillerimizde, Z faktörü ve S/B oranı sırasıyla 0,82 ve 13,35'tir (Şekil 3A), testimizin yüksek verimli tarama için sağlam ve güvenilir olduğunu gösterir. Daha sonra küçük moleküler kütle bileşiklerini taramak için kullandık. Şekil 3B, seçilen küçük bir molekülle (D10) refakatçi-cochaperone etkileşimlerinin doza bağlı inhibisyonunu sunar. D10 için doz yanıt eğrileri,_{IC 50} değerlerinin hesaplanmasına bağlı olarak ...

Tartışmalar

Burada, başta FKBP51 ve FKBP52 olmak üzere Hsp90 ve TPR motifli yardımcı refakatçiler arasındaki etkileşimleri engelleyen küçük molekülleri taramak için test kullanan bir protokol açıklıyoruz. Yüksek Z' puanı (>0,8), yüksek aktarım hızı formatının sağlamlığını ve güvenilirliğini gösterir. Sonuçlar bir saat içinde elde edilebilir ve az miktarda boncuk, protein ve bileşik gereklidir. Ayrıca, bu protokol herhangi bir Hsp90/Hsp70 - TPR motifli co-chaperone etkileşimlerine kolayca genişlet...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well plates	Perkin Elmer	6008350	Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit	Millipore	UFC901008	Concentrate protein
Ampicillin	Sigma	A0166	Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010	Heidolph		Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51	Source BioScience	clone id: 5723416	pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52	Source BioScience	clone id: 7474554	pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software	GraphPad Prism	9.0.0	Analysis data and make figures
Data analysis software	Excel		Analysis data
DMSO	Supelco	1.02952.1000	Dilute compounds
DPBS	Gibco	14190-144	Prepare solution
EDTA	Calbiochem	344504	Prevent proteolysis during sonication
Glutathione	Sigma	G-4251	Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads	Perkin Elmer	6765300	Donor bead
GST-trap column	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Thermo Fisher Scientific	R0392	Induce protein expression
LB Broth (Miller)	Sigma	L3522	Microbial growth medium
PCR instrument	BIO-RAD	S1000 Thermal Cycler	Amplification/PCR
PD-10 column	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Solution exchange
pGEX-6P-1 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Plasmid
pGEX-6P-2 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	Plasmid
Plate reader	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Multilabel Reader	Read alpha plate
Plate reader software	Perkin Elmer	EnSpire Manager	Plate reader software
Plate reader software protocol	Perkin Elmer	Alpha 384-well Low volume	Use this protocol to read plate
PMSF	Sigma	P7626	Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail	Sigma	S8830	Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide	Sigma	S2002	As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma	156159	Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform	Peptide 2.0 inc		Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator	LABINCO		Make end-over-end agitation
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20	Sigma	P1379	Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor	Microson		Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads	Perkin Elmer	6762003	Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module	Invitrogen	EI0002	SDS-PAGE