使用同质珠为基础的检测的查佩龙-科查佩龙相互作用研究

摘要

该协议提出了一种利用谷胱甘肽相关的供体珠与 GST 融合的 TPR-motif 共同伴奏和接受珠以及 Hsp90 衍生肽来探索蛋白质- 蛋白质相互作用的技术。我们使用此技术筛选小分子，以破坏 Hsp90-FKBP51 或 Hsp90-FKBP52 相互作用，并识别出有效和选择性的 Hsp90-FKBP51 相互作用抑制剂。

摘要

针对热休克蛋白 90 （Hsp90） - 可可酮相互作用提供了专门调节 Hsp90 依赖细胞内过程的可能性。Hsp90 C 终点站保存的 MEEVD 五肽负责与共护的四肽重复 （TPR） 主题的相互作用。FK506 结合蛋白 （FKBP） 51 和 FKBP52 是两个类似的 TPR 主题共同伴奏涉及类固醇激素依赖性疾病具有不同的功能.因此，识别专门阻断Hsp90和FKBP51或FKBP52之间相互作用的分子为几种人类疾病提供了有希望的治疗潜力。在这里，我们描述了放大发光接近同质测定程序，以调查Hsp90与其合作伙伴FKBP51和FKBP52之间的相互作用。首先，我们以谷胱甘肽S转移酶（GST）标记形式纯化了含TPR图案的蛋白质FKBP51和FKBP52。利用与谷胱甘肽相关的供体珠与 GST 融合的 TPR-motif 蛋白和接受珠，以及 Hsp90 的 10 mer C 终端肽，我们探索了同质环境中的蛋白质-蛋白质相互作用。我们利用此检测屏蔽小分子，以破坏 Hsp90-FKBP51 或 Hsp90-FKBP52 相互作用，并识别出有效和选择性的 Hsp90-FKBP51 相互作用抑制剂。

引言

分子伴奏有助于蛋白质平衡，包括蛋白质折叠、运输和降解。它们调节几个细胞过程，与许多疾病有关，如癌症和神经退行性疾病^1。热休克蛋白90（Hsp90）是最重要的伴奏之一，其功能取决于ATP水解驱动的构象变化，并与由其共同伴奏²调解的客户蛋白结合。尽管Hsp90作为治疗靶点的潜力显而易见，但微调其功能是一个很大的挑战。有几个Hsp90抑制剂针对N终端ATP结合区，已在临床试验中评估，但没有一个已被批准营销^3。由于缺乏一个明确的配体绑定口袋^4，针对Hsp90的C终端区域已经取得了有限的成功^4。最近，小分子对Hsp90-cochaperone相互作用的破坏被作为替代策略⁵进行了研究。以Hsp90-cochaperone相互作用为目标不会引起一般细胞应激反应，并有可能具体调节各种细胞内过程。Hsp90 C 终点站保存的 MEEVD 五肽负责与共伴⁶的四肽重复 （TPR） 主题的相互作用。在人类蛋白质数据库中注释的736种TPR主题含图案的蛋白质中，有20种不同的蛋白质通过这种肽⁷与Hsp90相互作用。分子争夺MEEVD肽结合会破坏Hsp90和含有TPR域的共同伴奏之间的相互作用。肽结合场具有类似的第三级结构，但不同TPR主题域之间的整体同源性^{相对较低，提供了}一个机会来识别分子，特别是能够阻止Hsp90和特定TPR-主题共同伴奏之间的相互作用。在这些TPR-motif共同伴奏中，FK506结合蛋白（FKBP）51和FKBP52是类固醇激素受体（SHR）信号的调节器，并涉及多种类固醇激素依赖性疾病，包括癌症、压力相关疾病、代谢疾病和阿尔茨海默氏症^8。虽然FKBP51和FKBP52的份额>80%的序列相似性，但它们的功能不同:FKBP52是SHR活动的正调节器，而FKBP51在大多数情况下是负监管机构^。因此，识别分子，特别是阻断Hsp90和FKBP51或FKBP52之间的相互作用，为相关疾病提供了有希望的治疗潜力。

1994年，乌尔曼EF等人首次研制出一种Mpl化L微生P生源性Asay（阿尔法屏幕^）。现在，它被广泛用于检测不同类型的生物相互作用，如肽^10，蛋白质11，DNA12，RNA13和糖^14。在这项技术中，有两种珠子（直径200纳米），一种是捐赠珠，另一种是接受珠。生物分子固定在这些珠子上;他们的生物相互作用使捐赠者和接受者珠子接近。在680纳米处，捐赠珠中的光敏剂照亮并转换氧气为单氧。由于单氧寿命短，只能扩散至200纳米。如果接受珠在附近，其硫氧生成物与在370纳米下产生化疗的单氧发生反应。这种能量进一步激活荧光灯在同一接受珠发出光在520-620纳米^15。如果生物相互作用中断，接受珠和供体珠无法接近，导致单氧衰变和低生成信号。

在这里，我们描述了使用这种技术筛选小分子，抑制Hsp90和TPR共同伴奏之间的相互作用的协议，特别是FKBP51和FKBP52。与Hsp90极端C终点站对应的10种氨基酸长肽附着在接受珠上。纯化 Gst 标记的 Tpr 共同伴奏与谷胱甘肽相关的捐赠珠子相互作用。当Hsp90衍生肽和TPR-motif共同伴奏器之间的相互作用将珠子聚集在一起时，就会产生放大信号（图1A）。如果筛选的小分子可以抑制Hsp90和TPR-主题共同伴奏之间的相互作用，这个放大的信号将减少（图1B）。他们的IC₅₀ 可以通过定量测量来计算。此协议可以扩展到任何伴奏 - TPR-motif 共同伴奏相互作用的兴趣，并在新分子的发展中非常重要，特别是阻止Hsp90和FKBP51或FKBP52之间的相互作用。

图1:本检测的基本原则。（A） 纯化GST-FKBP51与谷胱甘肽相关的捐赠珠子相互作用。与Hsp90极端C终点相对应的10种氨基酸长肽附着在接受珠上。Hsp90 衍生肽和 FKBP51 的 TPR 域之间的相互作用使捐赠者和接受者珠子接近。在680纳米处，捐赠珠中的光敏剂照亮并转换氧气为单氧。接受珠上的硫化物衍生物与单氧发生反应，在 370 nm 处产生化疗。这种能量进一步激活同一接收珠中的荧光，以 520-620 nm 发射光。（B） 当小分子抑制Hsp90和FKBP51之间的相互作用时，供体和接受珠无法接近。然后，寿命短的单氧衰变，并且不产生可检测的信号。请单击此处查看此图的较大版本。

研究方案

注:此协议概述显示在 图 2中。

1. GST-FKBP51 和 GST-FKBP52 的表达和净化 （图 2A）

1. 质 粒
   注:从图像联盟获取用于人类FKBP51（克隆 ID:5723416）和用于人类 FKBP52（克隆 ID:7474554）的 cDNA 克隆。
   1. 用引物放大人类 Fkbp51 Dna （前进; 5 'Ggatccatactactgaggt - 3'， 反向; 5 '- CTCGCTCTCTCCAC - 3'）， 包含巴姆希和 Xhoi 悬垂， 克隆成 pgex6 - 1 载体在巴姆希 / Xhoi 限制站点。
   2. 用引物（前方;5'-加特卡特加特-3'，反向;5'-CTCGGCTCTCTCCAC-3'）放大人类FKBP52 DNA，其中含有EconRI和XhoI悬垂，克隆成pGEX6-2载体在EcoRI/XhoI限制站点。
      注:PCR 反应设置和条件显示在 表 1 和 表 2中。
   3. 根据制造协议验证插入的序列，将质粒转化为化学上称职的大肠杆菌。
2. 蛋白质表达和纯化
   1. 在 1 升蒸馏水中加入 25 克 Luria 肉汤 （LB） 基座，以制作 LB 溶液。在 121 °C 下自动将其高压 15 分钟。冷却后，加入50微克/mL安培素。
   2. 以表达 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52 的细菌群为例，在 1.5 mL 管中与 500 μL 的 LB 溶液混合。旋涡。
   3. 在覆盖着铝箔的 Erlenmeyer 烧瓶中加入 1 L 的 LB 溶液中的"1.2.2"混合物。在 37 °C 的摇床中将埃伦迈尔烧瓶孵化过夜。
   4. 通过在埃伦迈尔烧瓶中加入1m异丙基-β-D硫化物（IPTG）来诱导蛋白质表达，并继续孵育2小时。
   5. 要获得细胞颗粒，离心机在 5，000 x g 为 15 分钟。取出超高超。
      注:细胞颗粒可存储在 -20 °C 下。
   6. 将细胞颗粒重新悬念在 PBS 的 40 mL 中，并在冰上声波 3 x 20 s。加入 1 mM PMSF、1 m EDTA 和蛋白酶抑制剂鸡尾酒 （1 片）， 以防止蛋白溶解。
   7. 将悬架离心 30 分钟 50，000 x g 以去除细胞碎片，并将超高纳特应用到 5 mL GST 陷阱柱上。
   8. 用 30 mL PBS 清洗柱子后，在 PBS 中用 5 mL 的 10 mM 谷胱甘肽清洗 GST-FKBP51 和 GST-FKBP52。
   9. 将蛋白质浓缩到 15 mL 10.000 MWCO 离心装置上。要去除免费谷胱甘肽，请通过 PD-10 列将浓缩物与 0.5 倍 PBS 平衡，并再次集中到滤芯离心机设备上。
   10. 收集含蛋白质的分数。验证 SDS-PAGE 中的蛋白质，并将蛋白质浓度调整为 1 毫克/毫升。
       注:典型蛋白质产量为2-5毫克/升培养。蛋白质可以储存在-20°C。

2. 将Hsp90 C终端肽与接受珠耦合（图2B）

1. Hsp90 肽制剂
   1. 合成十种氨基酸肽NH₂-EDASRMEEVD-COOH对应于人类Hsp90β异形（UniProt ID:P08238）的氨基酸714-724，通过肽合成服务。
   2. 将 PBS 中的 Hsp90 肽稀释至 1 毫克/mL 浓度。
2. 接受者珠准备
   1. 将 PBS 中未合并的接受珠稀释至 1 毫克/mL 浓度，并转移到 1.5 mL 管中。
   2. 以离心机清洗 16，000 x g 进行 15 分钟。小心地取出超高等。
3. 共轭
   1. 将珠子和肽的比例设定为 10:1。在含有1毫克接受珠颗粒的1.5mL管中（如上所述），加入1 mL的PBS（pH 7.4），0.1毫克稀释肽， 1.25 μL 的 Tween-20， 10 μL 的 400 mM 溶液氰化钠 （NaBH₃CN） 在水中。
      警告:纳BH3CN有毒:使用烟罩和手套。纳布₃CN 解决方案应新鲜准备。
   2. 在 37 °C 下孵育 24 小时，在旋转摇床上进行端端搅拌（10-20 转/分）。
4. 反应淬火和珠子清洗
   1. 添加 20 μL 的 1 M Tris-HCl （pH 8.0） 解决方案，以阻止未受反应的站点。在 37 °C 下孵育 1 小时。
   2. 离心机在 16，000 x g （或最大速度） 15 分钟在 4 °C. 取出超高颗粒，在 1 mL 的 Tris-HCl 溶液（100 mM，pH 8.0）中重新使用珠粒。
   3. 重复洗涤步骤三次。
   4. 上次离心后，在存储缓冲器（1 mL 0.5 × PBS 中以 1 毫克/兆升的存储缓冲器重新使用珠子，其中 0.01% 为防腐剂）。将结合的接受者珠子溶液存储在受保护的 4 °C 光下。
      警告:钠酸钠有毒:使用烟罩和手套。

3. 检测GST-FKBP51或GST-FKBP52与Hsp90 C终端肽之间的相互作用，并抑制小分子质量化合物（图2C）

1. GST 标记的蛋白质与谷胱甘肽捐赠者珠子相互作用
   1. 在384井板块中设置反应。
   2. 准备包含 10 μg/mL 谷胱甘肽捐赠者珠的溶液，以 0.5 倍 PBS、pH 7.4 表示。
      注:经过长时间的储存，珠子会稳定下来，需要涡流。
   3. 将 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52 添加到 10 μg/mL 的最终浓度中。
   4. 在25°C的黑暗中孵育10分钟。
      注:在此步骤中，GST 标记的蛋白质将与附着在珠子上的谷胱甘肽相互作用。对于每口井，将使用 22.5 μL 的混合物。约束合作伙伴的集中度必须由经验确定。提提 GST-FKBP51 和 GST-FKBP52，并选择提供最佳信号的浓度。
2. 复合添加
   1. 对 DMSO 中的测试化合物进行串行稀释。
      注:使用的浓度通常为 10、30、100、300、1，000 和 3，000 μM。
   2. 在板的每个井的一角添加 0.25 μL 的 DMSO（负控制）或 Hsp90 C 终端肽（正控制，30 μM）或化合物。使用三重酸盐进行每种复合浓度。
   3. 在每口油井中加入22.5微升含有谷胱甘肽供体珠的溶液，并加入GST标记的蛋白质。
   4. 用手轻轻摇动盘子，但要彻底。在 25 °C 的黑暗中孵育 15 分钟。
      注:在此期间，化合物将在Hsp90 C终端肽结合站点与TPR域相互作用。
3. 接受者珠子添加
   1. 在 0.5x PBS 中将接收器珠与附加的 Hsp90 C 终端肽稀释至 100 μg/mL。
   2. 在每口井中加入 2.25 μL 稀释的接受珠。
   3. 轻轻但彻底地混合。在 25 °C 的黑暗中孵育 15 分钟。
      注:在此步骤中，供体和接受珠被蛋白质肽相互作用拉近。反应混合物的最终体积为 25 微升。因此，化合物的最终浓度从0.1到30μM不等。
4. 板读取
   注:使用相关模式设置的板读取器阅读板。
   1. 打开仪器并打开软件
   2. 选择相关协议。
   3. 单击 "编辑板图 "并选择板中使用的井进行测量。
   4. 单击 "下一步 "继续并 运行 所选协议。
   5. 测量后，单击 "显示结果 "查看结果。
   6. 导出数据。

4. 数据分析

1. Z 的因子和信号与背景 （S/B） 比率
   1. 使用以下方程计算测定中的 Z'因子和 S/B 比率:
      Z'1-（3+pos=3=neg）/=μμ-
      S/B=μ内格/μpos
      其中，σ和μ分别表示正 （Hsp90 C 端肽、30 μM） 和负 （DMSO） 控件的标准偏差和手段。Z'因子> 0.5 将确保检测足够坚固，可以进行筛查。为了监测检测灵敏度，还计算了S/B比率。
2. 剂量响应曲线和IC ₅₀
   注:使用非线性回归分析，通过软件来适应Hsp90-cochaperonesPPI抑制剂的数据。
   1. 在"欢迎对话"中创建 XY 数据表并选择 X数字，Y Enter 3（如果三重）在并排列中复制值。
   2. 将样品的信号数据正常化为负对照组。将浓度值导入 X 列，将信号值导入 Y 列。
   3. 单击 "分析 "并选择"转换|下的转换 浓度 （X）" 正常化。选择 转换到对数。
      注:这将将浓度转换为日志刻度。如果您的起始浓度为零，请将其设置为非常小的数字，该数字实际上是零（例如，0.1 nM），不会丢失这些值，因为没有定义零的对数。
   4. 单击分析并选择XY 分析下的非线性回归（曲线拟合），打开剂量响应抑制并选择日志（抑制剂）与响应 - 可变坡度。
   5. 单击 "确定" 查看 结果 （包含 IC₅₀ 值）和 图形。

图2:本协议的示意图。（A ） GST-FKBP51 和 GST-FKBP52 的表达和纯化。（B） 将 Hsp90 C 终端肽与接受珠耦合。（C） 调查 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52 和 Hsp90 C 终端肽之间的相互作用的检测。用小分子质量化合物抑制。使用 BioRender.com 创建请单击此处查看此图的较大版本。

结果

在我们的测定中，Z'因子和S/B比率分别为0.82和13.35（图3A），表明我们的测定对于高通量筛选是可靠可靠的。然后，我们用它来筛选小分子质量化合物。 图3B 对伴奏-协茶酮与选定小分子（D10）的相互作用呈现剂量依赖抑制。D10 的剂量响应曲线由非线性回归分析生成，根据该分析计算 IC₅₀ 值。D10 显示剂量依赖抑制在 Hsp90 - GST-FKBP51 和 Hsp90 - GST-FKB...

讨论

在这里，我们描述了一个协议，使用检测筛选小分子抑制Hsp90和TPR-motif共同伴奏之间的相互作用，特别是FKBP51和FKBP52。其高 Z 分数（>0.8）显示了高通量格式的坚固性和可靠性。结果可以在一小时内获得，需要少量的珠子、蛋白质和化合物。此外，此协议可以轻松扩展到任何 Hsp90/Hsp70 - TPR-主题共同伴奏感兴趣的相互作用。Hsp90 的几个 TPR-motif 共同伴奏与各种人类疾病有牵连，从阿尔茨海默氏症到自?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well plates	Perkin Elmer	6008350	Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit	Millipore	UFC901008	Concentrate protein
Ampicillin	Sigma	A0166	Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010	Heidolph		Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51	Source BioScience	clone id: 5723416	pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52	Source BioScience	clone id: 7474554	pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software	GraphPad Prism	9.0.0	Analysis data and make figures
Data analysis software	Excel		Analysis data
DMSO	Supelco	1.02952.1000	Dilute compounds
DPBS	Gibco	14190-144	Prepare solution
EDTA	Calbiochem	344504	Prevent proteolysis during sonication
Glutathione	Sigma	G-4251	Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads	Perkin Elmer	6765300	Donor bead
GST-trap column	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Thermo Fisher Scientific	R0392	Induce protein expression
LB Broth (Miller)	Sigma	L3522	Microbial growth medium
PCR instrument	BIO-RAD	S1000 Thermal Cycler	Amplification/PCR
PD-10 column	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Solution exchange
pGEX-6P-1 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Plasmid
pGEX-6P-2 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	Plasmid
Plate reader	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Multilabel Reader	Read alpha plate
Plate reader software	Perkin Elmer	EnSpire Manager	Plate reader software
Plate reader software protocol	Perkin Elmer	Alpha 384-well Low volume	Use this protocol to read plate
PMSF	Sigma	P7626	Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail	Sigma	S8830	Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide	Sigma	S2002	As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma	156159	Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform	Peptide 2.0 inc		Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator	LABINCO		Make end-over-end agitation
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20	Sigma	P1379	Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor	Microson		Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads	Perkin Elmer	6762003	Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module	Invitrogen	EI0002	SDS-PAGE