مقايسات الكيمياء المناعية للخلايا الحية 3D للورم الدبقي في خط الوسط المنتشر لدى الأطفال

Summary

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا للكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد المطبقة على خط خلايا الورم الدبقي المنتشر في خط الوسط للأطفال ، وهو مفيد لدراسة التعبير عن البروتينات على غشاء البلازما في الوقت الفعلي أثناء العمليات الديناميكية مثل غزو الخلايا ثلاثية الأبعاد والهجرة.

Abstract

تعد هجرة الخلايا وغزوها من السمات المميزة للأورام الطافرة للورم الدبقي المنتشر في خط الوسط (DMG) H3K27M. لقد قمنا بالفعل بنمذجة هذه الميزات باستخدام فحوصات الغزو والهجرة ثلاثية الأبعاد (3D). في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين هذه المقايسات 3D للكيمياء المناعية للخلايا الحية. تم استخدام كاشف وضع العلامات على الأجسام المضادة للكشف في الوقت الفعلي عن تعبير جزيء الالتصاق CD44 ، على غشاء البلازما للخلايا المهاجرة والغازية لخط الخلايا الأساسي المشتق من المريض DMG H3K27M. يرتبط CD44 بالنمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية وهجرة الخلايا السرطانية وغزوها ويشارك في التفاعلات المباشرة مع مصفوفة الجهاز العصبي المركزي (CNS) خارج الخلية. تم تضمين المجالات العصبية (NS) من خط خلية DMG H3K27M في مصفوفة الغشاء القاعدي (BMM) أو وضعها على طبقة طلاء رقيقة من BMM ، في وجود جسم مضاد ل CD44 بالتزامن مع كاشف وسم الأجسام المضادة (ALR). تم إجراء تحليل صورة الكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد على أداة تحليل الخلايا الحية لقياس تعبير CD44 الكلي كميا ، وتحديدا على الخلايا المهاجرة والغازية. تسمح الطريقة أيضا بتصور التعبير المتقطع ل CD44 في الوقت الفعلي على غشاء البلازما للخلايا المهاجرة والغازية. علاوة على ذلك ، قدم الفحص أيضا رؤى جديدة حول الدور المحتمل ل CD44 في انتقال اللحمة المتوسطة إلى الأميبات في خلايا DMG H3K27M.

Introduction

تعد قدرة الخلايا السرطانية على التهرب والانتشار عبر الأنسجة المحيطة سمة مميزة للسرطان¹. على وجه الخصوص ، تعد حركة الخلايا السرطانية سمة مميزة للأورام الخبيثة ، سواء كانت نوعا من الورم النقيلي مثل الثدي² أو سرطان القولون والمستقيم³ أو نوعا غازيا محليا مثل الورم الدبقي^{المنتشر 4,5}.

التصوير له دور مركزي في التحقيق في العديد من جوانب الأنماط الظاهرية للخلايا السرطانية. ومع ذلك ، يفضل بالتأكيد تصوير الخلايا الحية عند دراسة العمليات الخلوية الديناميكية مثل الهجرة والغزو ، عندما تحدث تغييرات في التشكل والتفاعل بين الخلية^{والخلية 6,7} ويمكن فحصها بسهولة أكبر بمرور الوقت. بالنسبة لتصوير الخلايا الحية ، يمكن استخدام أنظمة مجهرية ضوئية مختلفة ، من تباين الطور إلى المجاهر الفلورية متحدة البؤر ، والحصول على الصور على مدى فترة زمنية قصيرة أو طويلة على مجهر مقلوب مجهز بغرفة للتحكم في درجة الحرارة و CO₂ ، أو في أنظمة تحليل الصور عالية المحتوى التي تحتوي على غرف مدمجة ، أو بدلا من ذلك في أنظمة الصور التي يمكن أن تجلس في الحاضنة دون الحاجة إلى إزعاج الخلايا طوال المدة من التجربة. غالبا ما يتم تحديد اختيار النظام المستخدم من خلال عدد من العوامل مثل الدقة المطلوبة ، وطول وقت الاستحواذ الإجمالي والفترات الزمنية ، ونوع الوعاء المستخدم وإنتاجية الفحص (غرفة واحدة أو لوحة متعددة الآبار) ، وحساسية الخلايا المستخدمة (الخلايا الثمينة و / أو النادرة) والسمية الضوئية للخلايا في حالة وجود الفلوروفورات.

فيما يتعلق بالتصوير الفلوري في الوضع المباشر ، يمكن تحقيق ذلك عن طريق تحويل الخلايا للتعبير عن البروتينات الفلورية إما للتعبير المستقر أو كنظام محفز⁸ ، عن طريق نقل الخلايا العابرة ، أو باستخدام أصباغ الخلايا المتاحة الآن لوضع العلامات على الخلايا^{الحية 7} ، لتتبع الخلايا الحية وكذلك لوضع العلامات على العضيات تحت الخلوية⁹.

تم تطوير نهج مفيد مؤخرا للكيمياء المناعية للخلايا الحية ، حيث يمكن ربط الجسم المضاد الذي يتعرف على علامة السطح المفضلة بكاشف وضع العلامات ، وعند إضافة وسائط الثقافة ، يمكن تصوير الخلايا التي تعبر عن العلامة المحددة بسهولة في الوقت الفعلي عن طريق تصوير الخلايا الحية. يمكن تحقيق التصور والقياس الكمي لتعبير العلامة باستخدام مثل هذا النظام بسهولة عندما تنمو الخلايا في ظروف ثقافة ثنائية الأبعاد (2D)¹⁰.

في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين بروتوكولات غزو الكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد وهجرة الخلايا المشتقة من المريض للورم الدبقي المنتشر في خط الوسط (DMG)^{لدى الأطفال 11,12}. DMG هي أورام دماغية شديدة العدوانية تؤثر على الأطفال ، بالنسبة للغالبية العظمى المرتبطة بطفرة المحرك K27M في متغيرات هيستون H3. تنشأ DMG في جذع الدماغ ومناطق خط الوسط في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتتميز بطبيعة تسلل للغاية. وقد ثبت أن هذه القدرة الغازية تتوسط جزئيا على الأقل عدم التجانس داخل الورم والسمات الشبيهة بجذع السرطان لخلايا DMG⁷.

لتوضيح مقايساتنا ، تم استخدام كاشف وضع العلامات على الأجسام المضادة (ALR) مع جسم مضاد ل CD44. CD44 هو بروتين سكري عبر الغشاء وجزيء الالتصاق يتم التعبير عنه على الخلايا الجذعية وأنواع الخلايا الأخرى ، المرتبطة بالنمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية وهجرة الخلايا السرطانية وغزوها¹³. تشمل البروتوكولات إعداد العينة ، والحصول على الصور في وضع برايت فيلد وفلورسنت ، والتحليل على أداة تحليل الخلايا الحية التي سمحت بالقياس الكمي في الوقت الفعلي للتعبير الكلي CD44 على غشاء خلية DMG أثناء الغزو والهجرة ثلاثية الأبعاد. سمحت المقايسات أيضا بإمكانية تصور إشارة الفلورسنت المتقطعة ل CD44 على الخلايا الفردية أثناء الهجرة والغزو. ومن المثير للاهتمام أنه لوحظ أيضا تأثير الجسم المضاد ل CD44 ، والذي يحتمل أن يكون بمثابة جسم مضاد مانع ، ويبدو أيضا أنه يقلل من هجرة الخلايا وغزوها بالإضافة إلى إحداث تحول في نمط الغزو من نمط ظاهري جماعي يشبه اللحمة المتوسطة إلى نمط ظاهري شبيه بالأميبويد أحادي الخلية.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجان أخلاقيات البحوث البشرية في المؤسسات.

ملاحظة: تم إجراء هذه الدراسة باستخدام أداة تحليل الخلايا الحية Incucyte S3 و / أو SX5 (المشار إليها كأداة تحليل الخلايا الحية).

1. توليد كرويات الورم ذات الحجم المستنسخ

ملاحظة: تم استخدام البروتوكول (القسم 1) الذي وصفه Vinci et al. 2015 ^7,12 ، كما هو مذكور أدناه ، مع بعض التعديلات:

1. اجمع الكرات العصبية الطافرة DMG H3K27M (NS) وأجهزة الطرد المركزي عند 170 × جم لمدة 10 دقائق (دقيقة) في درجة حرارة الغرفة (RT).
2. احتضان NS مع 500 ميكرولتر من محلول أكوتاز لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية لتفتيتها.
3. تحييد محلول accutase باستخدام وسيط الخلايا الجذعية السرطانية (TSM)⁷ والطرد المركزي تعليق الخلية عند 355 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
4. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط TSM ثم عد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا.
5. قم بتخفيف تعليق الخلية للحصول على 2.5-5 × 10³خلايا / مل والبذور 100 ميكرولتر / بئر في ألواح ذات قاع دائري منخفض للغاية (ULA) ذات 96 بئرا (انظر جدول المواد). استخدم كثافة خلية مناسبة للحصول على NS فردي بقطر ~ 300 ميكرومتر ، بعد 4 أيام من بذر الخلية (250-500 خلية / بئر لخلايا الورم الدبقي شديدة العدوانية).
6. تأكد بصريا من تكوين NS باستخدام مجهر مقلوب بعد 4 أيام من بذر الخلية.

2. إعداد مجمع ALR / الأجسام المضادة والإعداد لفحص الغزو

ملاحظة: بالنسبة لإجراء وضع العلامات على الأجسام المضادة ، يتم استخدام بروتوكول أصباغ وسم الأجسام^{المضادة 10} للكيمياء المناعية للخلايا الحية مع بعض التعديلات ، كما هو موضح أدناه. بالنسبة لفحص الغزو ، يتم اتباع البروتوكول الذي وصفه سابقا Vinci et al. 2015¹² .

1. ضع في اعتبارك عدد الآبار (على سبيل المثال ، 60 بئرا) لتحليل وحساب الحجم المطلوب لكل كاشف. قم أيضا بتضمين آبار التحكم السلبي (عينات مع ALR ولكن بدون أجسام مضادة).
2. أضف 100 ميكرولتر من الماء المعقم إلى ALR لإعادة ترطيب الكاشف (التركيز النهائي = 0.5 مجم / مل). ماصة لخلط الحل.
   ملاحظة: الكاشف حساس للضوء. لذلك ، ابق في الظلام. قم بقسمة الكاشف المتبقي وخزنه في درجة حرارة -80 درجة مئوية (تجنب التجميد والذوبان).
3. امزج الجسم المضاد مع ALR في وسط TSM (أو وسائط نمو الخلايا المناسبة لخط الخلية المفضل) في صفيحة مستديرة القاع متعددة الآبار أو في أنبوب كهرماني وحمايته من الضوء.
4. قم بإعداد كمية كافية من الوسط لتوزيع 25 ميكرولتر / بئر بتركيز 3x للفحص النهائي. احتضان في RT لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: يوصى باستخدام نسبة مولية 1: 3 من الجسم المضاد إلى ALR ، مع تركيز نهائي (1x) للجسم المضاد للاختبار <1.5 ميكروغرام / مل. بالنسبة للتجارب في هذا البروتوكول ، يتم استخدام جسم مضاد للفأر CD44 مضاد للإنسان (تركيز ابتدائي 86 ميكروغرام / مل) بتركيز نهائي قدره 0.1 ميكروغرام / مل (تركيز 3x = 0.3 ميكروغرام / مل). أضف الكواشف بالترتيب التالي: ط) الأجسام المضادة. ب) ALR ؛ ج) TSM المتوسطة. تخلط عن طريق الماصة.
5. قم بتخفيف كاشف مثبط الخلفية (BSR) في وسط TSM (أو وسائط نمو الخلايا المناسبة لخط الخلية المختار) عند 1.5 mM (3x) للحصول في نهاية الفحص على تركيز نهائي قدره 0.5 mM.
6. قم بإجراء مقايسة الغزو مباشرة في لوحة ULA 96-well مستديرة القاع حيث تم زرع الخلايا في البداية. تحقق من NS بصريا باستخدام مجهر مقلوب قبل البدء.
7. قم بإزالة 75 ميكرولتر / بئر من الوسط برفق وببطء ، وتجنب لمس قاع البئر حيث يوجد NS. تحقق من وجود NS بصريا.
8. أضف برفق 25 ميكرولتر من BSR إلى كل بئر.
9. أضف برفق 25 ميكرولتر من مركب ALR / الأجسام المضادة إلى كل بئر. انتظر 2 أو 3 دقائق للسماح لمركب ALR / الأجسام المضادة بالاختلاط مع الوسيط.
10. تحقق بصريا باستخدام مجهر مقلوب للتأكد من أن كل NS يقع في موقع مركزي في قاع البئر. تجنب تشكيل الفقاعات. في حالة وجود أي فقاعة ، قم بإزالتها باستخدام إبرة.
11. ضع الطبق على الثلج وانتظر 5 دقائق حتى يصبح قاع الطبق باردا.
12. باستخدام طرف p200 المبرد مسبقا ، قم بتوزيع 75 ميكرولتر / بئر من مصفوفة الغشاء القاعدي (BMM) ، ووضع طرف الماصة على الجدار الداخلي للبئر وتجنب لمس قاع البئر. تجنب تشكيل فقاعات وإزالة بإبرة معقمة تلك الموجودة.
    ملاحظة: تأكد من إذابة BMM عند 4 درجات مئوية من الليلة السابقة.
13. اترك الطبق على الثلج لمدة 5 دقائق للسماح ل BMM بالاختلاط مع الوسط. تحقق بصريا باستخدام المجهر المقلوب من وجود NS وأنها تقع في موقع مركزي في البئر. إذا لم يكن كذلك ، قم بطرد اللوحة عند 4 درجات مئوية عند 180 × جم لمدة 5 دقائق.
14. نقل اللوحة في أداة تحليل الخلايا الحية (جدول المواد) الموضوعة داخل الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ ، 95٪ رطوبة.

3. إعداد مركب ALR / الأجسام المضادة والإعداد لمقايسة الهجرة

ملاحظة: بالنسبة لإجراء وضع العلامات على الأجسام المضادة ، يتم استخدام بروتوكول Labeling Dyes¹⁰ للكيمياء المناعية للخلايا الحية.

1. ضع في اعتبارك عدد الآبار لتحليل وحساب الحجم المطلوب لكل كاشف. قم أيضا بتضمين الآبار اللازمة للضوابط السلبية. تحقق من NS بصريا باستخدام مجهر مقلوب قبل البدء.
2. استخدم ألواح مسطحة القاع ذات 96 بئرا. قم بإجراء الطلاء كما هو موضح من قبل Vinci et al. ، 2013¹⁴. لهذه الدراسة ، يتم استخدام BMM كطلاء رقيق.
3. بمجرد أن يصبح الطلاء جاهزا ، قم بإزالة الفائض من طلاء BMM بطرف p200 مع وضع الطرف في حافة البئر وتجنب لمس القاع. إذا كنت تعمل مع آبار متعددة ، فاستخدم ماصة متعددة القنوات.
4. اقطع طرف p200 ، خذ 50 ميكرولتر من وسط الخلية + NS من كل بئر محدد ، وانقله إلى بئر قاع مسطح مطلي. تحقق من وجود وموضع NS في كل بئر بصريا.
   ملاحظة: يجب أن يكون كل NS في موقع مركزي في البئر. تجنب الاتكاء على الطرف الموجود على حافة البئر أثناء النقل ولكن قم بإسقاط الوسط مركزيا في البئر دون لمس القاع. بالنسبة للخلايا شديدة الارتحال ، ضع في اعتبارك عددا أكبر من النسخ المتماثلة من النسخ المتماثلة الثلاثة القياسية. هذا لأنه عندما يجلس NS قريبا جدا من حافة البئر ، قد تغطي الخلايا المهاجرة مساحة أصغر من البئر.
5. أعد ترطيب ALR كما هو موضح أعلاه (الخطوات 2.2-2.3).
   ملاحظة: الكاشف حساس للضوء. انظر أعلاه للحصول على إجراءات التعامل الجيدة.
6. امزج الجسم المضاد مع ALR في وسائط نمو الخلايا الكاملة المناسبة في صفيحة مستديرة القاع متعددة الآبار أو في أنبوب كهرماني وحمايته من الضوء. تحضير كمية كافية لتوزيع 50 ميكرولتر / بئر عند تركيز الفحص النهائي 3x. احتضان في RT لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: أضف الكواشف بالترتيب كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.4).
7. اتبع نفس الإجراء كما ورد في الخطوة 2.5.
8. أضف برفق 50 ميكرولتر من BSR إلى كل بئر.
9. أضف برفق 50 ميكرولتر من ALR / الجسم المضاد إلى كل بئر. انتظر 2 أو 3 دقائق للسماح للكواشف بالاختلاط والتحقق بصريا باستخدام مجهر مقلوب للتأكد من أن معظم NS المكررة تقع في موقع مركزي في البئر.
10. تجنب تكوين الفقاعات وإزالة أي فقاعات موجودة باستخدام إبرة. انقل اللوحة برفق في أداة تحليل الخلايا الحية الموضوعة داخل الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ ، 95٪ رطوبة.

4. إعداد أداة تحليل الخلايا الحية للحصول على الصور

1. امسح اللوحات ضوئيا باستخدام أداة تحليل الخلايا الحية (للاطلاع على المواصفات ، انظر جدول المواد) مع فترات مسح تبدأ من النقطة الزمنية صفر (t0) لفحوصات الغزو والهجرة التي تم إعدادها ، على التوالي ، بعد الخطوة 2.14. و 3.10. حتى 96 ساعة.
   ملاحظة: تأكد من القدرة على التخلص من أداة تحليل الخلايا الحية فور بدء فحص الغزو والهجرة. اعتمادا على نوع الورم ، يمكن أن تبدأ الخلايا في الغزو أو الهجرة من NS بالفعل في غضون 1 ساعة من إعداد الفحص.
2. في برنامج أداة تحليل الخلايا الحية ، حدد الخيار جدولة للحصول عليها. انقر فوق علامة التبويب + وحدد الخيار مسح ضوئي في الجدول الزمني.
3. في نافذة البرنامج إنشاء أو استعادة السفينة ، انقر فوق الخيار جديد.
4. حدد التطبيق المحدد في أداة تحليل الخلايا الحية لاكتساب الغزو والهجرة. حدد نوع المسح الكروي ، والهدف 4x ، وقنوات الصورة Phase + Brightfield والخضراء لفحص الغزو. حدد نوع مسح استنساخ التخفيف وهدف 4x والمرحلة والأخضر لفحص الترحيل.
5. حدد نوع اللوحة وحدد الآبار المراد مسحها ضوئيا من خلال تمييزها على خريطة اللوحة.
6. قم بإعداد تردد المسح (بالنسبة للتجارب في هذا البروتوكول ، كان تردد المسح 15 دقيقة للغزو و 30 دقيقة للترحيل).
7. انقر فوق إضافة إلى الجدول الزمني وابدأ الفحص.

5. إعداد أداة تحليل الخلايا الحية لتحليل الصور

1. حدد علامة التبويب إنشاء تعريف تحليل جديد.
2. حدد تطبيق Spheroid Invasion أو Basic Analyzer للغزو والترحيل ، على التوالي ، في علامة التبويب.
3. حدد القنوات المناسبة للغزو والترحيل (للغزو: المرحلة + برايتفيلد جرين ؛ للترحيل: المرحلة الخضراء) في قناة الصورة.
4. حدد بعض الصور التمثيلية من 3-4 آبار لمعاينة إعداد التحليل وتحسينه.
5. بالنسبة لفحص الغزو ، في علامة التبويب تعريف التحليل ، اضبط إعدادات التطبيق في قنوات Brightfield و Green باستخدام الإعداد التالي لإنشاء تجزئة دقيقة بين الخلايا الكروية الكاملة والخلايا الغازية (انظر الشكل 5 ؛ القناع الأزرق):
   تجزئة برايتفيلد: حساسية كروية كاملة = 50 ؛ حساسية الخلية الغازية = 100 ؛ تنظيف = افتراضي.
   مرشحات كروية كاملة: قم بتعيين جميع المعلمات كإعداد افتراضي.
   عوامل تصفية الخلايا الغازية: قم بتعيين جميع المعلمات كافتراضي.
   التجزئة الخضراء: نصف القطر = 900.
6. بالنسبة لمقايسة الترحيل ، اضبط إعدادات التطبيق في قنوات الطور والأخضر لإنشاء تجزئة دقيقة بين التقاء الخلايا الخضراء (انظر الشكل 5 ، الأقنعة الصفراء والوردية) مع الإعداد التالي:
   المرحلة: تعيين جميع المعلمات كإعداد افتراضي.
   التجزئة الخضراء: نصف القطر = 300 ؛ العتبة = 1000
   التنظيف: ملء حفرة = 400 ؛ الفلاتر = افتراضي.
   حسنا كله: قم بتعيين جميع المعلمات كإعداد افتراضي.
7. تحقق من صحة إعدادات التحليل ل NS بالنقر بشكل عشوائي على عدة آبار. يجب أن يحدد التجزئة الكروية. إذا لم يكن كذلك ، فاضبط الإعداد وفقا لذلك.
8. حدد الآبار والنقاط الزمنية لتحليلها.
9. احفظ تعريف التحليل وانقر فوق إنهاء.

النتائج

يتم تلخيص بروتوكول الكيمياء المناعية للخلايا الحية 3D للغزو والهجرة في سير عمل مباشر وقابل للتكرار في الشكل 1. من خلال زرع خلايا DMG في ألواح ULA 96-well ذات القاع المستدير ، يتم الحصول على NS ذات الحجم القابل للتكرار واستخدامها في الخطوات المعروضة. عندما تصل NS إلى الحجم المثالي ~ 300 ...

Discussion

يمكن تكييف الكيمياء المناعية للخلايا الحية 3D التي اعتمدناها هنا لغزو DMG للأطفال والهجرة بسهولة أيضا لأنواع الخلايا السرطانية الأخرى شديدة التوغل ، بما في ذلك خطوط خلايا سرطان الثدي والقولون.

تختلف عن فحوصات الكيمياء المناعية للخلايا الحية^{2D التي تم إجراؤها سابقا...}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well TC-Treated Microplates	Corning	3595	size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom
Accutase	Euroclone	ECB3056D	solution for neurosphere dissociation
Burker chamber	Mv medical	FFL16034	cell counting chamber
CD-44 (156-3C11)	Cell Signaling Technology	3570	Mouse mAb IgG2a
Corning Matrigel Matrix	Corning	356237	Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free
Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye	Incucyte	4743	Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry
Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	-	The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.
Inverted Microscope		-	any inverted microscope
Opti-Green Background Suppressor Reagent	Incucyte	6500-0045	Backgroung suppressor reagent (BSR)
Tumor stem cell (TSM) medium	-	-	growth cell medium (see reference in the text for details)
Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Corning Costar	7007	size 96 well, round bottom clear