소아 미만성 정중선 신경아교종의 Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays

요약

이 연구는 소아 미만성 정중선 신경아교종 세포주에 적용되는 생3D 세포 면역세포화학 프로토콜을 제시하며, 3D 세포 침습 및 이동과 같은 동적 과정에서 원형질막에서 단백질의 발현을 실시간으로 연구하는 데 유용합니다.

초록

세포 이동 및 침습은 미만성 정중선 신경아교종(DMG) H3K27M 돌연변이 종양의 특정 특징입니다. 우리는 이미 3차원(3D) 세포 기반 침입 및 이동 분석을 사용하여 이러한 특징을 모델링했습니다. 이 연구에서 우리는 생세포 면역세포화학을 위해 이러한 3D 분석을 최적화했습니다. 항체 라벨링 시약을 사용하여 DMG H3K27M 일차 환자 유래 세포주의 이동 및 침입 세포의 원형질막에서 접착 분자 CD44의 발현을 실시간으로 검출했습니다. CD44는 암 줄기 세포 표현형 및 종양 세포 이동 및 침윤과 관련이 있으며 중추신경계(CNS) 세포외 기질과의 직접적인 상호작용에 관여합니다. DMG H3K27M 세포주의 신경구(NS)를 항체 표지 시약(ALR)과 함께 항-CD44 항체의 존재 하에 기저막 매트릭스(BMM)에 매립하거나 BMM의 얇은 코팅층 위에 놓았습니다. 전체 CD44 발현, 특히 이동 및 침입 세포에 대한 정량적 측정을 위해 생세포 분석 장비에서 생-3D 세포 면역세포화학 이미지 분석을 수행하였다. 이 방법은 또한 이동 및 침입 세포의 원형질막에서 CD44의 간헐적 발현을 실시간으로 시각화 할 수 있습니다. 또한, 이 분석은 DMG H3K27M 세포의 중간엽에서 아메보이드로의 전이에서 CD44의 잠재적 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다.

서문

종양 세포가 주변 조직을 통해 회피하고 전파하는 능력은 암의 특징입니다¹. 특히, 종양 세포 운동성은 유방² 또는 결장직장암³과 같은 전이성 종양 유형이든 미만성 신경교종과 같은 국소 침습성 유형이든 악성 종양의 특징입니다 ^4,5.

이미징은 종양 세포 표현형의 여러 측면을 조사하는 데 중심적인 역할을 합니다. 그러나, 생세포 이미징은 형태 및 세포-세포 상호작용 ^6,7의 변화가 발생하고 시간이 지남에 따라 더 쉽게 검사될 수 있는 이동 및 침입과 같은 동적 세포 과정을 연구할 때 확실히 선호됩니다. 라이브 셀 이미징의 경우, 위상차에서 컨포칼 형광 현미경에 이르기까지 다양한 광학 현미경 시스템을 사용할 수 있으며, 온도 및_CO2 제어를 위한 챔버가 장착된 도립 현미경에서 단기간 또는 장기간에 걸쳐 이미지 획득을 수행하거나, 챔버가 내장된 고함량 이미지 분석 시스템에서, 또는 전체 기간 동안 세포를 교란할 필요 없이 인큐베이터에 앉을 수 있는 이미지 시스템에서 수행할 수 있습니다 실험의. 사용되는 시스템의 선택은 필요한 분해능, 전체 획득 시간 및 시간 간격의 길이, 사용된 용기 유형 및 분석 처리량(단일 챔버 또는 다중 웰 플레이트), 사용된 세포의 민감도(귀중한 세포/또는 희귀 세포) 및 형광단이 존재하는 경우 세포의 광독성과 같은 여러 요인에 의해 결정되는 경우가 많습니다.

라이브 모드에서의 형광 이미징과 관련하여, 이는 안정적인 발현을 위해 또는 유도성 시스템(inducible system)8으로서 형광 단백질의 발현을 위해 세포를 형질도입하거나, 일시적인 세포 형질감염에 의해, 또는 현재 생세포 표지(live-cell labeling⁾⁷, 생세포 추적(live-cell tracking) 및 세포내 소기관⁽subcellular organelles)⁹의 표지에 사용할 수 있는 세포 염료를 사용함으로써 달성될 수 있다.

최근 생세포 면역세포화학을 위한 유용한 접근법이 개발되었는데, 여기서 선택한 표면 마커를 인식하는 항체를 라벨링 시약에 결합할 수 있으며, 배양 배지에 추가하면 특정 마커를 발현하는 세포를 생세포 이미징을 통해 실시간으로 쉽게 이미징할 수 있습니다. 이러한 시스템을 이용한 마커 발현의 시각화 및 정량화는 세포가 2차원(2D) 배양 조건(¹⁰)에서 성장할 때 용이하게 달성될 수 있다.

이 연구에서 우리는 소아 미만성 정중선 신경아교종(DMG) 환자 유래 세포의 생3D 세포 면역세포화학 침습 및 이동에 대한 프로토콜을 최적화했습니다^11,12. DMG는 어린이에게 영향을 미치는 매우 공격적인 뇌종양으로, 대다수는 히스톤 H3 변이체의 드라이버 돌연변이 K27M과 관련이 있습니다. DMG는 뇌간과 중추신경계(CNS)의 정중선 영역에서 발생하며 침윤성이 높은 특성이 특징입니다. 이러한 침습 능력은 DMG 세포의 종양 내 이질성 및 암 줄기 유사 특징에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 것으로 나타났다⁷.

우리의 분석을 예시하기 위해 항체 표지 시약(ALR)을 CD44에 대한 항체와 함께 사용했습니다. CD44는 암 줄기 세포 표현형 및 종양 세포 이동 및 침습과 관련된 줄기 세포 및 기타 세포 유형에서 발현되는 막횡단 당단백질 및 부착 분자이다¹³. 프로토콜에는 샘플 준비, 명시야 및 형광 모드에서의 이미지 획득, 3D 침습 및 이동 중에 DMG 세포막에서 전체 CD44 발현을 실시간으로 정량적으로 측정할 수 있는 생세포 분석 기기에서의 분석이 포함됩니다. 이 분석은 또한 이동 및 침입하는 동안 개별 세포에서 CD44의 간헐적 형광 신호를 시각화할 수 있는 가능성을 허용했습니다. 흥미롭게도 잠재적으로 차단 항체로 작용하는 항-CD44 항체의 효과도 관찰되었으며, 세포 이동 및 침습을 감소시킬 뿐만 아니라 집단 중간엽 유사에서 보다 단일 세포 아메보이드 유사 표현형으로 침입 패턴의 전환을 유도하는 것으로 보였습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

이 프로토콜은 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

참고: 이 연구는 Incucyte S3 및/또는 SX5 Live-Cell Analysis Instrument(라이브 셀 분석 기기로 참조)를 사용하여 수행되었습니다.

1. 재현 가능한 크기의 종양 스페로이드 생성

참고: Vinci et al. 2015 ^7,12에 의해 설명된 프로토콜(섹션 1)은 일부 수정을 거쳐 아래에 보고된 대로 사용되었습니다.

1. DMG H3K27M-돌연변이 신경구(NS)를 수집하고 실온(RT)에서 10분(분) 동안 170 x g 에서 원심분리합니다.
2. NS를 500 μL의 아큐타제 용액과 함께 37°C에서 3분 동안 인큐베이션하여 이들을 분해한다.
3. 아큐타제 용액을 종양 줄기 세포 (TSM) 배지⁷ 로 중화시키고, 세포 현탁액을 RT에서 5분 동안 355 x g 에서 원심분리한다.
4. 세포 펠릿을 TSM 배지 1mL에 재현탁한 다음 세포 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.
5. 세포 현탁액을 희석하여 2.5-5 x 10³cells/mL를 얻고 100μL/웰을 초저 부착(ULA) 96웰 둥근 바닥 플레이트에 시드합니다( 재료 표 참조). 적절한 세포 밀도를 사용하여 세포 파종 후 4일 후에 직경 ~300μm의 개별 NS를 얻습니다(매우 공격적인 신경아교종 세포의 경우 250-500 세포/웰).
6. 세포 파종 4일 후 도립 현미경을 이용하여 NS 형성을 육안으로 확인하였다.

2. ALR/항체 복합체 준비 및 침윤 분석을 위한 설정

참고: 항체 표지 절차의 경우 아래에 보고된 바와 같이 생세포 면역세포화학을 위한 항체 표지 염료 프로토콜¹⁰ 이 일부 수정과 함께 사용됩니다. 침습 분석의 경우 이전에 Vinci et al. 2015¹² 에 의해 기술된 프로토콜을 따른다.

1. 웰 수(예: 웰 60개)를 고려하여 각 시약에 필요한 부피를 분석하고 계산합니다. 또한 음성 대조군(ALR은 있지만 항체가 없는 샘플)에 대한 웰도 포함합니다.
2. ALR에 멸균수 100μL를 추가하여 시약을 재수화합니다(최종 농도 = 0.5mg/mL). 용액을 혼합하는 피펫.
   알림: 시약은 빛에 민감합니다. 그러므로 어둠 속에 보관하십시오. 남은 시약을 분취하여 -80°C에서 보관합니다(동결 및 해동 방지).
3. 둥근 바닥 멀티웰 플레이트 또는 호박색 튜브에서 TSM 배지(또는 선택한 세포주에 적합한 세포 성장 배지)에서 ALR과 항체를 혼합하고 빛으로부터 보호합니다.
4. 최종 분석 농도의 3배에서 25μL/웰을 분주하기에 충분한 양의 배지를 준비합니다. RT에서 15분 동안 배양합니다.
   참고: ALR에 대한 항체의 몰비는 1:3이며 테스트 항체의 최종(1x) 농도<1.5μg/mL)가 권장됩니다. 이 프로토콜의 실험을 위해 항-인간 CD44 마우스 항체가 0.1μg/mL(3x 농도 = 0.3μg/mL)의 최종 농도에서 사용됩니다(시작 농도 86μg/mL). 시약을 다음의 순서로 첨가한다: i) 항체; ii) ALR; iii) TSM 매체. 피펫팅으로 혼합합니다.
5. TSM 배지(또는 선택한 세포주에 적합한 세포 성장 배지)에 배경 억제 시약(BSR)을 1.5mM(3x)로 희석하여 분석이 끝날 때 0.5mM의 최종 농도를 얻습니다.
6. 세포가 처음 파종된 ULA 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 직접 침습 분석을 수행합니다. 시작하기 전에 도립 현미경을 사용하여 NS를 육안으로 확인하십시오.
7. NS가 있는 웰의 바닥을 만지지 않도록 배지의 75μL/웰을 부드럽게 천천히 제거합니다. NS의 존재를 시각적으로 확인하십시오.
8. 각 웰에 25μL의 BSR을 부드럽게 추가합니다.
9. 25μL의 ALR/항체 복합체를 각 웰에 부드럽게 추가합니다. ALR/항체 복합체가 배지와 혼합될 때까지 2-3분 정도 기다립니다.
10. 도립 현미경을 사용하여 육안으로 확인하여 각 NS가 우물 바닥의 중앙에 위치하는지 확인합니다. 거품의 형성을 피하십시오. 기포가 있으면 바늘을 사용하여 제거하십시오.
11. 접시를 얼음 위에 놓고 접시 바닥이 차가워질 때까지 5분 정도 기다립니다.
12. 사전 냉각된 p200 팁을 사용하여 75μL/웰의 기저 멤브레인 매트릭스(BMM)를 분주하고 피펫 팁을 웰의 내부 벽에 놓고 웰 바닥을 만지지 않도록 합니다. 기포의 형성을 피하고 멸균 바늘로 기존 기포를 제거하십시오.
    알림: BMM은 전날 밤부터 4°C에서 해동해야 합니다.
13. BMM이 매체와 섞일 수 있도록 접시를 얼음 위에 5분 동안 둡니다. 도립 현미경을 사용하여 NS의 존재와 NS가 우물 중앙에 위치하는지 육안으로 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 플레이트를 4°C에서 180 x g 로 5분 동안 원심분리합니다.
14. 플레이트를 37°C, 5%_CO2, 95% 습도의 배양기 내에 놓인 생세포 분석기(Table of Materials)로 옮긴다.

3. ALR/항체 복합체의 제조 및 이동 분석을 위한 설정

참고: 항체 라벨링 절차의 경우 Live-Cell Immunocytochemistry를 위한 Labeling Dyes 프로토콜¹⁰ 이 사용됩니다.

1. 분석할 웰의 수를 고려하고 각 시약에 필요한 부피를 계산합니다. 음성 대조군에 필요한 우물도 포함하십시오. 시작하기 전에 도립 현미경을 사용하여 NS를 육안으로 확인하십시오.
2. 바닥이 평평한 96웰 플레이트를 사용하십시오. Vinci et al., 2013¹⁴에 기술된 바와 같이 코팅 절차를 수행한다. 이 연구를 위해 BMM은 얇은 코팅으로 사용됩니다.
3. 코팅이 준비되면 p200 팁으로 과도한 BMM 코팅을 제거하고 팁을 웰 가장자리에 놓고 바닥에 닿지 않도록 합니다. 여러 웰로 작업하는 경우 다중 채널 피펫을 사용하십시오.
4. p200 팁을 절단하고, 선택된 각 웰로부터 세포 배지 + NS 50 μL를 취하고, 이를 코팅된 평평한 바닥 웰로 옮긴다. 각 웰에서 NS의 존재와 위치를 육안으로 확인하십시오.
   알림: 각 NS는 우물 중앙에 위치해야 합니다. 옮기는 동안 우물 가장자리의 팁에 기대지 말고 바닥을 건드리지 않고 매체를 우물 중앙에 떨어뜨리십시오. 이동이 많은 셀의 경우 표준 3회 반복실험보다 더 많은 반복실험 횟수를 고려합니다. 이는 NS가 우물의 가장자리에 너무 가까이 있을 때 이동하는 세포가 우물의 더 작은 영역을 덮을 수 있기 때문입니다.
5. 위에서 설명한대로 ALR을 재수화합니다 (2.2-2.3 단계).
   참고: 시약은 빛에 민감합니다. 좋은 취급 절차는 위를 참조하십시오.
6. 항체를 적절한 완전한 세포 성장 배지, 둥근 바닥 멀티웰 플레이트 또는 호박색 튜브에 혼합하고 빛으로부터 보호합니다. 최종 분석 농도의 3배에서 50μL/웰을 분주하기에 충분한 양을 준비합니다. RT에서 15분 동안 배양합니다.
   알림: 위에 표시된 순서대로 시약을 추가합니다(2.4단계).
7. 2.5단계에서 보고한 것과 동일한 절차를 수행합니다.
8. 각 웰에 50μL의 BSR을 부드럽게 추가합니다.
9. 각 웰에 50μL의 ALR/항체를 부드럽게 추가합니다. 시약이 혼합될 때까지 2-3분 정도 기다렸다가 도립 현미경을 사용하여 육안으로 확인하여 대부분의 복제 NS가 웰 중앙에 위치하는지 확인합니다.
10. 기포의 형성을 피하고 바늘을 사용하여 기존 기포를 제거하십시오. 플레이트를 37°C, 5%_CO2, 95% 습도의 배양기 내에 놓인 생세포 분석 장비로 부드럽게 옮긴다.

4. 이미지 획득을 위한 라이브 셀 분석 기기 설정

1. 2.14단계 후 각각 침습 및 이동 분석이 설정된 시점 0(t0)부터 시작하는 주사 간격으로 라이브 셀 분석 기기(사양은 재료 표 참조)를 사용하여 플레이트를 스캔합니다. 및 3.10. 최대 96 시간
   참고: 침습 및 이동 분석 시작 직후 생세포 분석 기기를 폐기할 수 있는지 확인하십시오. 종양 유형에 따라 세포는 분석 설정으로부터 이미 1시간 이내에 NS에서 침입하거나 이동하기 시작할 수 있습니다.
2. 라이브 셀 분석 기기 소프트웨어에서 Schedule to Acquire(획득 예약) 옵션을 선택합니다. + 탭을 클릭하고 일정에 따라 스캔 옵션을 선택합니다.
3. 소프트웨어 창에서 선박 만들기 또는 복원, 새로 만들기 옵션을 클릭합니다.
4. 침입 및 이동 획득을 위해 살아있는 세포 분석 장비에서 특정 응용 프로그램을 선택하십시오. 침습 분석을 위해 스페로이드 스캔 유형, 4x 대물렌즈, 위상+명시야 및 녹색 이미지 채널을 선택합니다. 마이그레이션 분석을 위해 Dilution Cloning 스캔 유형, 4x 대물렌즈, Phase 및 Green 을 선택합니다.
5. 플레이트 유형을 선택하고 플레이트 맵에서 강조 표시하여 스캔할 웰을 정의합니다.
6. 스캐닝 빈도를 설정합니다(이 프로토콜의 실험에서 스캐닝 빈도는 침입의 경우 15분, 이동의 경우 30분이었습니다).
7. Add to Schedule(일정에 추가)을 클릭하고 스캔을 시작합니다.

5. 이미지 분석을 위한 생세포 분석 기기 설정

1. Create New Analysis Definition(새 분석 정의 생성) 탭을 선택합니다.
2. 탭에서 침입 및 마이그레이션을 위해 Spheroid Invasion 또는 Basic Analyzer 애플리케이션을 각각 선택합니다.
3. 이미지 채널에서 침입 및 마이그레이션에 적합한 채널(침입: Phase+Brightfield-Green, 마이그레이션: Phase-Green)을 선택합니다.
4. 분석 설정을 미리 보고 구체화하기 위해 3-4개의 웰에서 몇 개의 대표 이미지를 선택합니다.
5. 침습 분석의 경우 Analysis Definition 탭에서 다음 설정으로 Brightfield 및 Green 채널의 애플리케이션 설정을 조정하여 전체 스페로이드와 침입 세포 간의 정확한 분할을 생성합니다( 그림 5 참조, 파란색 마스크).
   명시야 분할: 전체 스페로이드 감도 = 50; 침입 세포 민감도 = 100; 정리 = 기본값.
   전체 스페로이드 필터: 모든 파라미터를 기본값으로 설정합니다.
   침입 셀 필터: 모든 매개변수를 기본값으로 설정합니다.
   녹색 분할: 반경 = 900.
6. 이동 분석의 경우 위상 및 녹색 채널의 애플리케이션 설정을 조정하여 다음 설정으로 Confluence와 녹색 세포( 그림 5, 노란색 및 분홍색 마스크 참조) 간의 정확한 분할을 생성합니다.
   단계: 모든 매개변수를 기본값으로 설정합니다.
   녹색 분할: 반경 = 300; 임계값 = 1000
   정리: 구멍 채우기 = 400; 필터 = 기본값.
   Whole Well: 모든 매개변수를 기본값으로 설정합니다.
7. 여러 웰을 임의로 클릭하여 NS에 대한 분석 설정이 올바른지 확인합니다. 분할은 스페로이드의 윤곽을 잡아야 합니다. 그렇지 않은 경우 그에 따라 설정을 조정하십시오.
8. 분석할 웰과 시점을 선택합니다.
9. Analysis Definition(분석 정의)을 저장하고 Finish(마침)를 클릭합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

침습 및 이동을 위한 Live-3D-Cell Immunocytochemistry 프로토콜은 그림 1에 간단하고 재현 가능한 워크플로우로 요약되어 있습니다. ULA 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 DMG 세포를 시딩함으로써, 재현 가능한 크기의 NS를 얻어지고, 표시된 단계에서 사용된다. NS가 ~300 μm(파종 후 약 4일)의 이상적인 크기에 도달하면 침습¹² 및 이동¹⁴ 분석이 시작됩니다. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

소아 DMG 침습 및 이동을 위해 여기에서 채택한 생3D 세포 면역세포화학은 유방암 및 결장암 세포주를 포함한 다른 고침습성 종양 세포 유형에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

이전에 수행된 생-2D-세포 면역세포화학 분석법(live-2D-cell immunocytochemistry assay)¹⁰과 달리, 3D로 작업할 때, 몇 가지 중요한 단계에 주의를 기울이는 것이 좋다. 특히, 우리가 설명하는 침습 분...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well TC-Treated Microplates	Corning	3595	size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom
Accutase	Euroclone	ECB3056D	solution for neurosphere dissociation
Burker chamber	Mv medical	FFL16034	cell counting chamber
CD-44 (156-3C11)	Cell Signaling Technology	3570	Mouse mAb IgG2a
Corning Matrigel Matrix	Corning	356237	Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free
Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye	Incucyte	4743	Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry
Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	-	The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.
Inverted Microscope		-	any inverted microscope
Opti-Green Background Suppressor Reagent	Incucyte	6500-0045	Backgroung suppressor reagent (BSR)
Tumor stem cell (TSM) medium	-	-	growth cell medium (see reference in the text for details)
Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Corning Costar	7007	size 96 well, round bottom clear