Tests d’immunocytochimie sur cellules 3D vivantes du gliome médian diffus pédiatrique

Résumé

Cette étude présente un protocole d’immunocytochimie de cellules 3D vivantes appliqué à une lignée cellulaire de gliome diffus pédiatrique, utile pour étudier en temps réel l’expression des protéines sur la membrane plasmique au cours de processus dynamiques tels que l’invasion et la migration des cellules 3D.

Résumé

La migration et l’invasion cellulaires sont des caractéristiques spécifiques des tumeurs mutantes H3K27M du gliome médian diffus (DMG). Nous avons déjà modélisé ces caractéristiques à l’aide de tests tridimensionnels (3D) d’invasion et de migration cellulaires. Dans cette étude, nous avons optimisé ces tests 3D pour l’immunocytochimie des cellules vivantes. Un réactif de marquage des anticorps a été utilisé pour détecter en temps réel l’expression de la molécule d’adhésion CD44, sur la membrane plasmique des cellules migrantes et envahissantes d’une lignée cellulaire primaire dérivée du patient DMG H3K27M. CD44 est associé au phénotype des cellules souches cancéreuses et à la migration et à l’invasion des cellules tumorales et est impliqué dans les interactions directes avec la matrice extracellulaire du système nerveux central (SNC). Les neurosphères (NS) de la lignée cellulaire DMG H3K27M ont été intégrées dans la matrice de la membrane basale (BMM) ou placées sur une fine couche de revêtement de BMM, en présence d’un anticorps anti-CD44 en conjonction avec le réactif de marquage des anticorps (ALR). L’analyse d’images immunocytochimiques de cellules vivantes en 3D a été réalisée sur un instrument d’analyse de cellules vivantes pour mesurer quantitativement l’expression globale de CD44, en particulier sur les cellules migratrices et envahissantes. La méthode permet également de visualiser en temps réel l’expression intermittente de CD44 sur la membrane plasmique des cellules migrantes et envahissantes. De plus, le test a également fourni de nouvelles informations sur le rôle potentiel de CD44 dans la transition mésenchymateuse vers amiboïde dans les cellules DMG H3K27M.

Introduction

La capacité des cellules tumorales à s’échapper et à se disséminer à travers les tissus environnants est une caractéristique du cancer¹. En particulier, la motilité des cellules tumorales est une caractéristique des tumeurs malignes, qu’il s’agisse d’un type de tumeur métastatique tel que le cancer du sein² ou colorectal³ ou d’un type localement invasif tel que le gliome diffus ^4,5.

L’imagerie joue un rôle central dans l’étude de nombreux aspects des phénotypes de cellules tumorales; Cependant, l’imagerie de cellules vivantes est certainement à privilégier lors de l’étude de processus cellulaires dynamiques tels que la migration et l’invasion, lorsque des changements de morphologie et d’interaction cellule-cellule ^6,7 se produisent et peuvent être examinés plus facilement au fil du temps. Pour l’imagerie de cellules vivantes, différents systèmes de microscopie optique peuvent être utilisés, du contraste de phase aux microscopes confocaux fluorescents, et l’acquisition d’images effectuée sur une courte ou longue période de temps sur un microscope inversé équipé d’une chambre pour le contrôle de la température et du CO₂, ou dans des systèmes d’analyse d’images à haut contenu qui ont des chambres intégrées, ou bien dans des systèmes d’image qui peuvent rester dans l’incubateur sans avoir besoin de déranger les cellules pendant toute la durée de l’expérience. Le choix du système utilisé est souvent dicté par un certain nombre de facteurs tels que la résolution nécessaire, la durée du temps global d’acquisition et les intervalles de temps, le type de récipient utilisé et le débit du test (chambre unique ou plaque multipuits), la sensibilité des cellules utilisées (cellules précieuses et/ou rares) et la phototoxicité des cellules en présence de fluorophores.

En ce qui concerne l’imagerie fluorescente en mode vivant, cela peut être réalisé en transduisant des cellules pour l’expression de protéines fluorescentes soit pour une expression stable, soit en tant que système inductible⁸, par transfection cellulaire transitoire, soit en utilisant des colorants cellulaires qui sont maintenant disponibles pour le marquage des cellules vivantes⁷, pour le suivi des cellules vivantes ainsi que pour le marquage des organites subcellulaires⁹.

Une approche utile a récemment été développée pour l’immunocytochimie des cellules vivantes, où un anticorps reconnaissant un marqueur de surface de choix peut être lié à un réactif de marquage et, lors de l’ajout au milieu de culture, les cellules exprimant le marqueur spécifique peuvent être facilement imagées en temps réel par imagerie de cellules vivantes. La visualisation et la quantification de l’expression des marqueurs à l’aide d’un tel système peuvent être facilement réalisées lorsque les cellules sont cultivées dans des conditions de culture bidimensionnelles (2D)¹⁰.

Dans cette étude, nous avons optimisé les protocoles pour l’invasion immunocytochimique des cellules 3D vivantes et la migration des cellules pédiatriques de gliome diffus à ligne médiane (DMG) dérivées de patients^11,12. Les DMG sont des tumeurs cérébrales très agressives affectant les enfants, pour la grande majorité associées à la mutation conductrice K27M dans les variantes de l’histone H3. Les DMG apparaissent dans le tronc cérébral et les régions médianes du système nerveux central (SNC) et se caractérisent par une nature hautement infiltrante. Il a été démontré que cette capacité invasive est au moins en partie médiée par l’hétérogénéité intratumorale et les caractéristiques cancéreuses des cellules DMG⁷.

Pour illustrer nos essais, un réactif de marquage d’anticorps (ALR) a été utilisé en combinaison avec un anticorps contre CD44. CD44 est une glycoprotéine transmembranaire et une molécule d’adhésion exprimée sur les cellules souches et d’autres types de cellules, associée au phénotype des cellules souches cancéreuses et à la migration et à l’invasion des cellules tumorales¹³. Les protocoles comprennent la préparation de l’échantillon, l’acquisition d’images en mode fond clair et fluorescent, et l’analyse sur un instrument d’analyse de cellules vivantes qui a permis de mesurer quantitativement en temps réel l’expression globale de CD44 sur la membrane cellulaire DMG pendant l’invasion et la migration 3D. Les tests ont également permis de visualiser le signal fluorescent intermittent de CD44 sur des cellules individuelles lors de la migration et de l’invasion. Il est intéressant de noter qu’un effet de l’anticorps anti-CD44 a également été observé, qui potentiellement agissant comme un anticorps bloquant, semblait également réduire la migration et l’invasion cellulaires ainsi qu’induire un changement du modèle d’invasion d’un phénotype mésenchymateux collectif à un phénotype amiboïde plus unicellulaire.

Protocole

Ce protocole suit les lignes directrices des comités d’éthique de la recherche sur des sujets humains des établissements.

REMARQUE : Cette étude a été réalisée à l’aide de l’instrument d’analyse de cellules vivantes Incucyte S3 et/ou SX5 (référencé comme instrument d’analyse de cellules vivantes).

1. Génération de sphéroïdes tumoraux de taille reproductible

NOTE: Le protocole (section 1) décrit par Vinci et al. 2015 ^7,12, a été utilisé comme indiqué ci-dessous, avec quelques modifications:

1. Recueillir les neurosphères (NS) mutantes DMG H3K27M et centrifuger à 170 x g pendant 10 minutes (min) à température ambiante (RT).
2. Incuber le NS avec 500 μL de la solution d’accutase pendant 3 min à 37 °C pour les briser.
3. Neutraliser la solution d’accutase avec le milieu de cellules souches tumorales (TSM)⁷ et centrifuger la suspension cellulaire à 355 x g pendant 5 min à TA.
4. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de milieu TSM, puis comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage de cellules.
5. Diluer la suspension cellulaire pour obtenir 2,5-5 x 10³cellules/mL et ensemencer 100 μL/puits dans des plaques à fond rond à 96 puits à très faible attache (ULA) (voir le tableau des matériaux). Utiliser une densité cellulaire appropriée pour obtenir une NS individuelle de ~300 μm de diamètre, 4 jours après l’ensemencement cellulaire (250-500 cellules/puits pour les cellules de gliome très agressives).
6. Confirmer visuellement la formation de NS à l’aide d’un microscope inversé 4 jours après l’ensemencement cellulaire.

2. Préparation du complexe ALR/anticorps et configuration pour le test d’invasion

REMARQUE: Pour la procédure de marquage des anticorps, le protocole¹⁰ des colorants de marquage des anticorps pour l’immunocytochimie des cellules vivantes est utilisé avec quelques modifications, comme indiqué ci-dessous. Pour le test d’invasion, le protocole précédemment décrit par Vinci et al. 2015¹² est suivi.

1. Considérez le nombre de puits (p. ex. 60 puits) pour analyser et calculer le volume nécessaire pour chaque réactif. Inclure également les puits pour le témoin négatif (échantillons avec ALR mais sans anticorps).
2. Ajouter 100 μL d’eau stérile à l’ALR pour réhydrater le réactif (concentration finale = 0,5 mg/mL). Pipette pour mélanger la solution.
   REMARQUE: Le réactif est sensible à la lumière; Par conséquent, restez dans l’obscurité. Aliquote du réactif restant et conserver à -80 °C (éviter la congélation et la décongélation).
3. Mélanger l’anticorps avec l’ALR dans le milieu VDMD (ou le milieu de croissance cellulaire approprié pour la lignée cellulaire de votre choix) dans une plaque multipuits à fond rond ou dans un tube ambré et protéger de la lumière.
4. Préparer une quantité suffisante du milieu pour distribuer 25 μL/puits à 3 fois la concentration finale de l’essai. Incuber à TA pendant 15 min.
   REMARQUE : Un rapport molaire de 1:3 entre les anticorps et l’ALR est recommandé, avec une concentration finale (1x) de l’anticorps d’essai <1,5 μg/mL. Pour les expériences de ce protocole, un anticorps anti-humain CD44 de souris est utilisé (concentration initiale de 86 μg/mL) à une concentration finale de 0,1 μg/mL (concentration 3x = 0,3 μg/mL). Ajouter les réactifs dans l’ordre suivant : i) anticorps ; ii) ALR; iii) Moyen VDMD. Mélanger par pipetage.
5. Diluer le réactif suppresseur de fond (BSR) dans le milieu VDMD (ou le milieu de croissance cellulaire approprié pour la lignée cellulaire de votre choix) à 1,5 mM (3x) pour obtenir à la fin de l’essai une concentration finale de 0,5 mM.
6. Effectuer l’essai d’invasion directement dans la plaque à fond rond à 96 puits ULA où les cellules ont été initialement ensemencées. Vérifiez visuellement le NS à l’aide d’un microscope inversé avant de commencer.
7. Retirer doucement et lentement 75 μL/puits du milieu, en évitant de toucher le fond du puits où se trouve le NS. Vérifiez visuellement la présence du NS.
8. Ajouter délicatement 25 μL de BSR à chaque puits.
9. Ajouter doucement 25 μL du complexe ALR/anticorps à chaque puits. Attendez 2 ou 3 minutes pour laisser le complexe ALR/anticorps se mélanger au milieu.
10. Vérifiez visuellement à l’aide d’un microscope inversé pour vous assurer que chaque NS est situé au centre au fond du puits. Évitez la formation de bulles. Si une bulle est présente, retirez-la à l’aide d’une aiguille.
11. Placez l’assiette sur de la glace et attendez 5 minutes pour que le fond de l’assiette refroidisse.
12. Avec une pointe p200 pré-refroidie, distribuer 75 μL/puits de matrice membranaire basale (BMM), en plaçant la pointe de la pipette sur la paroi interne du puits et en évitant de toucher le fond du puits. Évitez la formation de bulles et retirez avec une aiguille stérile celles existantes.
    REMARQUE: Assurez-vous d’avoir décongelé le BMM à 4 ° C de la veille.
13. Laisser l’assiette sur la glace pendant 5 minutes pour laisser le BMM se mélanger au milieu. Vérifiez visuellement à l’aide d’un microscope inversé la présence des NS et qu’ils sont situés au centre du puits. Sinon, centrifuger la plaque à 4 °C à 180 x g pendant 5 min.
14. Transférer la plaque dans l’instrument d’analyse de cellules vivantes (Table des matériaux) placé dans l’incubateur à 37 °C, 5% CO₂, 95% d’humidité.

3. Préparation du complexe ALR/anticorps et configuration pour le test de migration

REMARQUE: Pour la procédure de marquage des anticorps, le protocole de colorants de marquage¹⁰ pour l’immunocytochimie des cellules vivantes est utilisé.

1. Considérez le nombre de puits à analyser et calculez le volume nécessaire pour chaque réactif. Inclure également les puits nécessaires pour les contrôles négatifs. Vérifiez visuellement le NS à l’aide d’un microscope inversé avant de commencer.
2. Utilisez des plaques à fond plat à 96 puits. Effectuer la procédure de revêtement décrite par Vinci et al., 2013¹⁴. Pour cette étude, le BMM est utilisé comme revêtement mince.
3. Une fois que le revêtement est prêt, retirez l’excès de revêtement BMM avec une pointe p200 plaçant la pointe dans le bord du puits et évitant de toucher le fond. Si vous travaillez avec plusieurs puits, utilisez une pipette multicanal.
4. Coupez une pointe p200, prenez 50 μL du milieu cellulaire + NS de chaque puits sélectionné et transférez-la dans un puits à fond plat revêtu. Vérifiez visuellement la présence et la position du NS dans chaque puits.
   REMARQUE : Chaque NS doit être située au centre du puits. Évitez de vous appuyer sur la pointe sur le bord du puits pendant le transfert, mais laissez tomber le milieu au centre du puits sans toucher le fond. Pour les cellules hautement migratoires, envisager un nombre plus élevé de réplications que les trois réplicas standard. En effet, lorsque NS se trouve trop près du bord du puits, les cellules migrantes peuvent couvrir une plus petite zone du puits.
5. Réhydrater l’ALR comme décrit ci-dessus (étapes 2.2-2.3).
   REMARQUE: Le réactif est sensible à la lumière. Voir ci-dessus pour de bonnes procédures de manipulation.
6. Mélanger l’anticorps avec l’ALR dans le milieu de croissance cellulaire complet approprié dans une plaque multipuits à fond rond ou dans un tube ambré et protéger de la lumière. Préparer une quantité suffisante pour distribuer 50 μL/puits à 3x la concentration finale de l’essai. Incuber à TA pendant 15 min.
   REMARQUE : Ajoutez les réactifs dans l’ordre indiqué ci-dessus (étape 2.4).
7. Suivez la même procédure que celle décrite à l’étape 2.5.
8. Ajouter délicatement 50 μL de BSR à chaque puits.
9. Ajouter doucement 50 μL de l’ALR/anticorps à chaque puits. Attendez 2 ou 3 minutes pour laisser les réactifs se mélanger et vérifier visuellement à l’aide d’un microscope inversé pour vous assurer que la plupart des NS répliqués sont situés au centre du puits.
10. Évitez la formation de bulles et enlevez celles existantes à l’aide d’une aiguille. Transférer délicatement la plaque dans l’instrument d’analyse des cellules vivantes placé dans l’incubateur à 37 °C, 5% CO₂, 95% d’humidité.

4. Réglage de l’instrument d’analyse de cellules vivantes pour l’acquisition d’images

1. Scanner les plaques à l’aide de l’instrument d’analyse de cellules vivantes (pour les spécifications, voir le tableau des matériaux) avec des intervalles de balayage à partir du point de temps zéro (t0) des essais d’invasion et de migration mis en place, respectivement, après l’étape 2.14. et 3.10. jusqu’à 96 h.
   NOTA : S’assurer d’être en mesure d’éliminer l’instrument d’analyse des cellules vivantes immédiatement après le début de l’essai d’invasion et de migration. Selon le type de tumeur, les cellules peuvent commencer à envahir ou à migrer du NS déjà dans les 1 heure suivant la configuration du test.
2. Sur le logiciel de l’instrument d’analyse de cellules vivantes, sélectionnez l’option Planifier l’acquisition. Cliquez sur l’onglet + et sélectionnez l’option Analyser selon le calendrier.
3. Dans la fenêtre du logiciel Créer ou restaurer un navire, cliquez sur l’option Nouveau.
4. Sélectionnez l’application spécifique dans l’instrument d’analyse de cellules vivantes pour l’acquisition de l’invasion et de la migration. Sélectionnez le type de balayage sphéroïde , l’objectif 4x, les canaux d’image Phase + Brightfield et Green pour le test d’invasion. Sélectionnez le type d’analyse de clonage de dilution , objectif 4x et Phase et vert pour le test de migration.
5. Sélectionnez le type de plaque et définissez les puits à scanner en les mettant en surbrillance sur la carte des plaques.
6. Configurez la fréquence d’analyse (pour les expériences de ce protocole, la fréquence de balayage était de 15 min pour l’invasion et de 30 min pour la migration).
7. Cliquez sur Ajouter à la planification et lancez l’analyse.

5. Réglage de l’instrument d’analyse de cellules vivantes pour l’analyse d’images

1. Sélectionnez l’onglet Créer une nouvelle définition d’analyse.
2. Sélectionnez Spheroid Invasion ou Basic Analyzer application pour l’invasion et la migration, respectivement, dans l’onglet.
3. Sélectionnez les canaux d’invasion et de migration appropriés (pour Invasion : Phase+Brightfield-Green ; pour Migration : Phase-Green) dans le canal d’image.
4. Sélectionnez quelques images représentatives de 3-4 puits pour prévisualiser et affiner le paramètre d’analyse.
5. Pour le test d’invasion, dans l’onglet Définition de l’analyse , ajustez les paramètres de l’application dans les canaux Brightfield et Green avec le paramètre suivant pour générer une segmentation précise entre les cellules sphéroïdes entières et envahissantes (voir Figure 5 ; masque bleu) :
   Segmentation en fond clair: sensibilité sphéroïde entière = 50; Sensibilité des cellules envahissantes = 100; Nettoyage = valeur par défaut.
   Filtres sphéroïdes entiers : définissez tous les paramètres par défaut.
   Filtres de cellules envahissantes : définissez tous les paramètres par défaut.
   Segmentation verte : rayon = 900.
6. Pour le test de migration, ajustez les paramètres d’application dans les canaux Phase et Vert pour générer une segmentation précise entre la confluence et les cellules vertes (voir Figure 5, masques jaune et rose) avec le paramètre suivant :
   Phase : définissez tous les paramètres par défaut.
   Segmentation verte : rayon = 300; Seuil = 1000
   Nettoyage: Remplissage des trous = 400; Filtres = valeur par défaut.
   Whole Well : définissez tous les paramètres par défaut.
7. Vérifiez que les paramètres d’analyse sont corrects pour le NS en cliquant au hasard sur plusieurs puits. La segmentation doit délimiter le sphéroïde. Si ce n’est pas le cas, ajustez le paramètre en conséquence.
8. Sélectionnez les puits et les points temporels à analyser.
9. Enregistrez la définition de l’analyse et cliquez sur Terminer.

Résultats

Le protocole d’immunocytochimie des cellules vivantes 3D pour l’invasion et la migration est résumé dans un flux de travail simple et reproductible à la figure 1. En ensemençant les cellules DMG dans des plaques à fond rond ULA 96 puits, des NS de taille reproductible sont obtenues et utilisées dans les étapes affichées. Lorsque les NS ont atteint la taille idéale de ~300 μm (environ 4 jours après l’ensemencement), les tests d’invasion¹² et de migra...

Discussion

L’immunocytochimie des cellules 3D vivantes que nous avons adoptée ici pour l’invasion et la migration pédiatriques de DMG pourrait être facilement adaptée également à d’autres types de cellules tumorales hautement invasives, y compris les lignées cellulaires cancéreuses du sein et du côlon.

Contrairement aux tests d’immunocytochimie sur cellules 2D vivantes¹⁰ précédemment réalisés, lorsque vous travaillez en 3D, il est suggéré de prêter attenti...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well TC-Treated Microplates	Corning	3595	size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom
Accutase	Euroclone	ECB3056D	solution for neurosphere dissociation
Burker chamber	Mv medical	FFL16034	cell counting chamber
CD-44 (156-3C11)	Cell Signaling Technology	3570	Mouse mAb IgG2a
Corning Matrigel Matrix	Corning	356237	Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free
Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye	Incucyte	4743	Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry
Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	-	The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.
Inverted Microscope		-	any inverted microscope
Opti-Green Background Suppressor Reagent	Incucyte	6500-0045	Backgroung suppressor reagent (BSR)
Tumor stem cell (TSM) medium	-	-	growth cell medium (see reference in the text for details)
Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Corning Costar	7007	size 96 well, round bottom clear