小儿弥漫性中线胶质瘤的活-3D细胞免疫细胞化学测定

摘要

本研究提出了一种应用于儿科弥漫性中线胶质瘤细胞系的活 3D 细胞免疫细胞化学方案，有助于实时研究 3D 细胞侵袭和迁移等动态过程中质膜上蛋白质的表达。

摘要

细胞迁移和侵袭是弥漫性中线胶质瘤（DMG）H3K27M突变肿瘤的特定标志。我们已经使用基于细胞的三维（3D）侵袭和迁移测定对这些特征进行了建模。在这项研究中，我们优化了这些用于活细胞免疫细胞化学的3D测定。抗体标记试剂用于实时检测粘附分子CD44在DMG H3K27M原代患者来源细胞系的迁移和侵袭细胞质膜上的表达。CD44与癌症干细胞表型和肿瘤细胞迁移和侵袭有关，并参与与中枢神经系统（CNS）细胞外基质的直接相互作用。在抗CD44抗体与抗体标记试剂（ALR）存在下，将来自DMG H3K27M细胞系的神经球（NS）嵌入基底膜基质（BMM）或置于BMM的薄涂层上。在活细胞分析仪器上进行活3D细胞免疫细胞化学图像分析，以定量测量整体CD44表达，特别是在迁移和入侵细胞上。该方法还允许实时可视化CD44在迁移和入侵细胞质膜上的间歇表达。此外，该测定还为CD44在DMG H3K27M细胞中间充质到变形虫转变的潜在作用提供了新的见解。

引言

肿瘤细胞逃避和通过周围组织传播的能力是癌症的标志¹。特别是，肿瘤细胞运动是恶性肿瘤的特征，无论是转移性肿瘤类型如乳腺癌²或结直肠癌³，还是局部侵袭性类型如弥漫性胶质瘤^4,5。

成像在肿瘤细胞表型的许多方面研究中具有核心作用;然而，在研究动态细胞过程（例如迁移和侵袭）时，当形态和细胞间相互作用发生变化时，活细胞成像绝对是首选 ^6,7 并且随着时间的推移可以更容易地检查。对于活细胞成像，可以使用不同的光学显微镜系统，从相衬到共聚焦荧光显微镜，并在配备温度和CO₂控制室的倒置显微镜上进行短时间或长时间的图像采集，或在具有内置腔室的高内涵图像分析系统中，或者可以在可以坐在培养箱中的图像系统中，而无需在整个过程中干扰细胞的实验。所用系统的选择通常取决于许多因素，例如所需的分辨率、总采集时间和时间间隔的长度、使用的容器类型和测定的通量（单室或多孔板）、所用细胞（珍贵和/或稀有细胞）的灵敏度以及细胞的光毒性（如果存在荧光团）。

关于活模式下的荧光成像，这可以通过转导细胞以表达荧光蛋白来实现，无论是为了稳定表达还是作为诱导系统⁸，通过瞬时细胞转染，或者通过使用现在可用于活细胞标记⁷的细胞染料，用于活细胞跟踪以及标记亚细胞器⁹。

最近开发了一种用于活细胞免疫细胞化学的有用方法，其中识别所选表面标志物的抗体可以与标记试剂结合，并且在加入培养基后，表达特定标志物的细胞可以很容易地通过活细胞成像实时成像。当细胞在二维（2D）培养条件下生长时，使用这种系统可以轻松实现标记表达的可视化和定量¹⁰。

在这项研究中，我们优化了小儿弥漫性中线胶质瘤（DMG）患者来源细胞的活3D细胞免疫细胞化学侵袭和迁移的方案^11,12。DMG是影响儿童的高度侵袭性脑肿瘤，绝大多数与组蛋白H3变体中的驱动突变K27M有关。DMG起源于脑干和中枢神经系统（CNS）的中线区域，其特征是高度浸润。这种侵入性能力已被证明至少部分是由肿瘤内异质性和DMG细胞的癌症干细胞样特征介导的⁷。

为了举例说明我们的检测方法，将抗体标记试剂（ALR）与CD44抗体结合使用。CD44是一种跨膜糖蛋白和粘附分子，在干细胞和其他细胞类型上表达，与癌症干细胞表型和肿瘤细胞迁移和侵袭有关¹³。这些协议包括样品制备、明场和荧光模式下的图像采集以及在活细胞分析仪器上的分析，该仪器允许在 3D 侵袭和迁移过程中实时定量测量 DMG 细胞膜上的整体 CD44 表达。这些测定还允许在迁移和入侵时可视化单个细胞上CD44的间歇荧光信号。有趣的是，还观察到抗CD44抗体的作用，其可能充当阻断抗体，似乎也减少了细胞迁移和侵袭，并诱导侵袭模式从集体间充质样转变为更单细胞的变形虫样表型。

研究方案

该协议遵循机构人类研究伦理委员会的指导方针。

注意:本研究使用Incucyte S3和/或SX5活细胞分析仪器（参考为活细胞分析仪器）进行。

1. 产生可重复大小的肿瘤球体

注意:Vinci 等人 2015 ^7,12 描述的协议（第 1 节）如下所述，并进行了一些修改:

1. 收集DMG H3K27M突变神经球（NS），并在室温（RT）下以170× g 离心10分钟（分钟）。
2. 将NS与500μL的Accutase溶液在37°C下孵育3分钟以将其分解。
3. 用肿瘤干细胞（TSM）培养基⁷ 中和Accutase溶液，并在室温下以355× g 离心细胞悬液5分钟。
4. 将细胞沉淀重悬于1mL TSM培养基中，然后使用细胞计数室对细胞进行计数。
5. 稀释细胞悬液以获得 2.5-5 x 10^{3 个}细胞/mL，并将 100 μL/孔接种到超低附着 （ULA） 96 孔圆底板中（参见 材料表）。在细胞接种后4天，使用适当的细胞密度获得~300μm直径的单个NS（对于高度侵袭性胶质瘤细胞，为250-500个细胞/孔）。
6. 细胞接种后4天使用倒置显微镜目视确认NS形成。

2. ALR/抗体复合物的制备和侵袭测定的设置

注意:对于抗体标记程序，使用用于活细胞免疫细胞化学的抗体标记染料方案¹⁰ 并进行一些修改，如下所述。对于入侵测定，遵循Vinci等人先前描述的协议2015¹² 。

1. 考虑孔数（例如，60孔）以分析和计算每种试剂所需的体积。还包括阴性对照的孔（有ALR但没有抗体的样品）。
2. 向 ALR 中加入 100 μL 无菌水以对试剂进行再水化（终浓度 = 0.5 mg/mL）。移液器混合溶液。
   注意:该试剂对光敏感;因此，请保持黑暗。将剩余的试剂分装并储存在-80°C（避免冷冻和解冻）。
3. 将抗体与TSM培养基（或所选细胞系的适当细胞生长培养基）中的ALR混合在圆底多孔板或琥珀色管中，并避光。
4. 准备足够量的培养基，以 3 倍最终测定浓度分配 25 μL/孔。在室温下孵育15分钟。
   注意:建议抗体与ALR的摩尔比为1:3，测试抗体的最终（1x）浓度为<1.5μg/ mL。对于该协议中的实验，使用终浓度为0.1μg/ mL（3x浓度= 0.3μg/ mL）的抗人CD44小鼠抗体（起始浓度86μg/ mL）。按以下顺序添加试剂:i）抗体;（二） ALR;iii） TSM 介质。通过移液混合。
5. 在TSM培养基（或所选细胞系的适当细胞生长培养基）中以1.5mM（3x）稀释背景抑制剂（BSR），以在测定结束时获得0.5mM的终浓度。
6. 直接在最初接种细胞的ULA 96孔圆底板中进行侵袭测定。在开始之前，使用倒置显微镜目视检查NS。
7. 轻轻缓慢地去除 75 μL/孔的培养基，避免接触 NS 所在的孔底部。目视检查 NS 是否存在。
8. 向每个孔中轻轻加入 25 μL BSR。
9. 向每个孔中轻轻加入 25 μL ALR/抗体复合物。等待2或3分钟，让ALR/抗体复合物与培养基混合。
10. 使用倒置显微镜目视检查，以确保每个NS位于孔底部的中心。避免形成气泡。如果存在任何气泡，请用针将其清除。
11. 将盘子放在冰上，等待5分钟，让盘子的底部变冷。
12. 使用预冷的p200吸头，分配75μL/孔的基础膜基质（BMM），将移液器吸头放在孔的内壁上，避免接触孔的底部。避免形成气泡，并用无菌针头去除现有的气泡。
    注意:确保从前一天晚上开始在4°C下解冻BMM。
13. 将板放在冰上5分钟，让BMM与培养基混合。使用倒置显微镜目视检查NS的存在以及它们是否位于孔的中心。如果没有，将板在4°C以180× g 离心5分钟。
14. 将板转移到置于37°C，5%CO_2,95%湿度的培养箱内的活细胞分析仪器（材料表）中。

3. ALR/抗体复合物的制备和迁移测定的设置

注意:对于抗体标记程序，使用用于活细胞免疫细胞化学的标记染料方案¹⁰ 。

1. 考虑要分析的孔数，并计算每种试剂所需的体积。还包括阴性对照所需的孔。在开始之前，使用倒置显微镜目视检查NS。
2. 使用平底 96 孔板。按照Vinci等人2013¹⁴的描述执行涂层程序。在这项研究中，BMM被用作薄涂层。
3. 涂层准备好后，用 p200 尖端将尖端放在孔边缘并避免接触底部，去除多余的 BMM 涂层。如果使用多个孔，请使用多通道移液器。
4. 切割 p200 尖端，从每个选定孔中取出 50 μL 细胞培养基 + NS，并将其转移到包被的平底孔中。目视检查NS在每个孔中的存在和位置。
   注意:每个NS必须位于井的中心位置。在转移过程中避免将尖端靠在孔边缘，但将培养基放在孔的中心，不要接触底部。对于高度迁移的细胞，请考虑比标准三个重复更多的重复次数。这是因为当NS离孔边缘太近时，迁移的细胞可能会覆盖孔的较小区域。
5. 如上所述对ALR进行再水化（步骤2.2-2.3）。
   注意:试剂对光敏感。有关良好的处理程序，请参见上文。
6. 将抗体与ALR在圆底多孔板或琥珀色管中的适当完整细胞生长培养基中混合，并避光。准备足够的量，以 3 倍最终测定浓度分配 50 μL/孔。在室温下孵育15分钟。
   注意:按上述顺序添加试剂（步骤2.4）。
7. 按照步骤 2.5 中报告的相同过程进行操作。
8. 向每个孔中轻轻加入 50 μL BSR。
9. 向每个孔中轻轻加入 50 μL ALR/抗体。等待2或3分钟，让试剂混合并使用倒置显微镜目视检查，以确保大多数重复的NS位于孔的中心。
10. 避免形成气泡，并使用针头去除任何现有的气泡。轻轻转移活细胞分析仪器中的板，置于37°C，5%CO_2,95%湿度的培养箱内。

4. 用于图像采集的活细胞分析仪器设置

1. 使用活细胞分析仪器（有关规格，请参阅 材料表）扫描板，扫描间隔从步骤2.14之后分别设置的侵袭和迁移测定的时间点零（t0）开始。和 3.10。长达96小时。
   注意:确保能够在入侵和迁移测定开始后立即处理活细胞分析仪器。根据肿瘤类型，细胞可以在测定设置后1小时内开始侵入或迁移NS。
2. 在活细胞分析仪器软件上，选择" 计划采集"选项。单击 + 选项卡并选择选项 按计划扫描.
3. 在软件窗口创建 或恢复船只上，单击 选项新建。
4. 在活细胞分析仪器中选择特定应用进行侵袭和迁移采集。选择球状体扫描类型、4倍物镜、相位+明场和绿色图像通道进行侵袭测定。选择稀释克隆扫描类型、4x物镜和相和绿色进行迁移分析。
5. 选择板类型并通过在板图上突出显示要扫描的孔来定义要扫描的孔。
6. 设置扫描频率（对于该协议中的实验，入侵扫描频率为15分钟，迁移扫描频率为30分钟）。
7. 单击添加到 计划 并开始扫描。

5. 用于图像分析的活细胞分析仪器设置

1. 选择" 创建新分析定义"选项卡。
2. 在选项卡上分别选择" 微球入侵"或 "基本分析器 应用程序"进行入侵和迁移。
3. 在图像通道中选择适合入侵和迁移的通道（对于入侵: 相位+明场绿;对于迁移: 相位绿色）。
4. 从3-4孔中选择一些代表性图像进行预览和优化分析设置。
5. 对于侵袭测定，在 "分析定义 "选项卡中，使用以下设置调整 明场 和 绿色 通道中的应用设置，以在整个球状体和入侵细胞之间生成精确的分割（参见 图5;蓝色掩模）:
   明场分割:整个球体灵敏度 = 50;入侵细胞灵敏度 = 100;清理 = 默认值。
   整个球体过滤器:将所有参数设置为默认值。
   入侵细胞过滤器:将所有参数设置为默认值。
   绿色分割:半径 = 900。
6. 对于迁移测定，调整 相位 和绿色通道中的应用设置，以使用以下设置在汇合细胞和 绿色 细胞之间生成精确的分割（参见 图5，黄色和粉红色掩模）:
   阶段:将所有参数设置为默认值。
   绿色分割:半径 = 300;阈值 = 1000
   清理:孔填充 = 400;筛选器 = 默认值。
   整体井:将所有参数设置为默认值。
7. 通过随机单击多个孔来检查NS的分析设置是否正确。分割必须勾勒出球体的轮廓。如果没有，请相应地调整设置。
8. 选择要分析的井和时间点。
9. 保存 分析定义 ，然后单击 完成。

结果

用于侵袭和迁移的活-3D细胞免疫细胞化学方案总结在 图1中简单且可重复的工作流程中。通过将DMG细胞接种在ULA 96孔圆底板中，可以获得可重现大小的NS并将其用于所示步骤。当NS达到~300μm的理想尺寸（接种后约4天）时，开始入侵¹² 和迁移¹⁴ 测定。在单个NS的培养基中加入ALR /抗体复合物与背景抑制因子一起，允许在实时成像和随时间推移?...

讨论

我们在这里采用的用于儿科DMG侵袭和迁移的活3D细胞免疫细胞化学也可以很容易地适应其他高度侵袭的肿瘤细胞类型，包括乳腺癌和结肠癌细胞系。

与以前进行的活2D细胞免疫细胞化学测定¹⁰不同，在3D中工作时，建议注意一些关键步骤。特别是，对于我们描述的侵袭测定，建议在添加BMM之前，将ALR /抗体混合物直接添加到每个孔中具有NS的培养基中，而不是?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well TC-Treated Microplates	Corning	3595	size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom
Accutase	Euroclone	ECB3056D	solution for neurosphere dissociation
Burker chamber	Mv medical	FFL16034	cell counting chamber
CD-44 (156-3C11)	Cell Signaling Technology	3570	Mouse mAb IgG2a
Corning Matrigel Matrix	Corning	356237	Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free
Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye	Incucyte	4743	Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry
Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	-	The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.
Inverted Microscope		-	any inverted microscope
Opti-Green Background Suppressor Reagent	Incucyte	6500-0045	Backgroung suppressor reagent (BSR)
Tumor stem cell (TSM) medium	-	-	growth cell medium (see reference in the text for details)
Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Corning Costar	7007	size 96 well, round bottom clear