Pediatrik Diffüz Orta Hat Gliomunun Canlı 3D Hücre İmmünositokimya Testleri

Özet

Bu çalışma, 3D hücre invazyonu ve göçü gibi dinamik süreçler sırasında plazma zarı üzerindeki proteinlerin ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için yararlı olan, pediatrik diffüz orta hat glioma hücre hattına uygulanan bir canlı 3D hücre immünositokimyası protokolü sunmaktadır.

Özet

Hücre göçü ve invazyonu, Diffüz Orta Hat Gliomu (DMG) H3K27M mutant tümörlerinin ayırt edici özellikleridir. Bu özellikleri, üç boyutlu (3D) hücre tabanlı invazyon ve migrasyon tahlilleri kullanarak zaten modelledik. Bu çalışmada, bu 3D tahlilleri canlı hücre immünositokimyası için optimize ettik. Bir DMG H3K27M primer hasta kaynaklı hücre hattının göç eden ve istilacı hücrelerinin plazma membranı üzerindeki adezyon molekülü CD44'ün ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak tespit etmek için bir Antikor Etiketleme Reaktifi kullanıldı. CD44, kanser kök hücre fenotipi ve tümör hücresi göçü ve invazyonu ile ilişkilidir ve merkezi sinir sistemi (CNS) hücre dışı matrisi ile doğrudan etkileşimlerde rol oynar. DMG H3K27M hücre hattından nörosferler (NS), bazal membran matrisine (BMM) gömüldü veya antikor etiketleme reaktifi (ALR) ile birlikte bir anti-CD44 antikoru varlığında ince bir BMM kaplama tabakasına yerleştirildi. Canlı 3D hücre immünositokimya görüntü analizi, özellikle göç eden ve istilacı hücreler üzerinde genel CD44 ekspresyonunu kantitatif olarak ölçmek için bir canlı hücre analiz cihazında gerçekleştirildi. Yöntem ayrıca, göç eden ve istilacı hücrelerin plazma zarı üzerindeki CD44'ün aralıklı ekspresyonunun gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca, test, CD44'ün DMG H3K27M hücrelerinde mezenkimal - amipoid geçişindeki potansiyel rolü hakkında yeni bilgiler sağladı.

Giriş

Tümör hücrelerinin çevre dokudan kaçma ve yayılma yeteneği, kanserin ayırt edici özelliğidir¹. Özellikle, tümör hücresi motilitesi, meme² veya kolorektal kanser³ gibi metastatik bir tümör tipi veya diffüz glioma^4,5 gibi lokal olarak invaziv bir tip olsun^, malign tümörlerin karakteristik bir özelliğidir.

Görüntüleme, tümör hücresi fenotiplerinin birçok yönünün araştırılmasında merkezi bir role sahiptir; Bununla birlikte, göç ve invazyon gibi dinamik hücresel süreçleri incelerken, morfoloji ve hücre-hücre etkileşiminde ^6,7 değişiklikler meydana geldiğinde ve zaman içinde daha kolay incelenebildiğinde, canlı hücre görüntüleme kesinlikle tercih edilmelidir. Canlı hücre görüntüleme için, faz kontrastından konfokal floresan mikroskoplara kadar farklı optik mikroskopi sistemleri kullanılabilir ve sıcaklık ve_CO2 kontrolü için bir hazne ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskopta kısa veya uzun bir süre boyunca gerçekleştirilen görüntü elde etme veya yerleşik odalara sahip yüksek içerikli görüntü analiz sistemlerinde veya alternatif olarak tüm süre boyunca hücreleri rahatsız etmeye gerek kalmadan inkübatörde oturabilen görüntü sistemlerinde deneyin. Kullanılan sistemin seçimi genellikle ihtiyaç duyulan çözünürlük, genel alım süresinin uzunluğu ve zaman aralıkları, kullanılan kap tipi ve testin verimi (tek odacıklı veya çok kuyulu plaka), kullanılan hücrelerin duyarlılığı (değerli ve/veya nadir hücreler) ve floroforlar varsa hücrelerin fototoksisitesi gibi bir dizi faktör tarafından belirlenir.

Canlı modda floresan görüntüleme ile ilgili olarak, bu, floresan proteinlerin ekspresyonu için hücrelerin kararlı ekspresyon veya indüklenebilir bir sistem⁸ olarak, geçici hücre transfeksiyonu ile transdüksiyonu veya şu anda canlı hücre etiketlemesi⁷, canlı hücre takibi ve hücre altı organelleri etiketleme⁹ için mevcut olan hücre boyaları kullanılarak elde edilebilir.

Son zamanlarda, seçilen bir yüzey markörünü tanıyan bir antikorun bir etiketleme reaktifine bağlanabildiği ve kültür ortamına eklendikten sonra, spesifik markörü eksprese eden hücrelerin canlı hücre görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak kolayca görüntülenebildiği canlı hücre immünositokimyası için yararlı bir yaklaşım geliştirilmiştir. Böyle bir sistem kullanılarak işaretleyici ekspresyonunun görselleştirilmesi ve miktarının belirlenmesi, hücreler iki boyutlu (2D) kültür koşullarında büyütüldüğünde kolayca elde edilebilir¹⁰.

Bu çalışmada, pediatrik diffüz orta hat glioma (DMG) hasta kaynaklı hücrelerin canlı 3D hücre immünositokimya invazyonu ve migrasyonu için protokolleri optimize ettik^11,12. DMG, çocukları etkileyen oldukça agresif beyin tümörleridir ve büyük çoğunluğu histon H3 varyantlarındaki sürücü mutasyonu K27M ile ilişkilidir. DMG, beyin sapında ve merkezi sinir sisteminin (MSS) orta hat bölgelerinde ortaya çıkar ve oldukça infiltratif bir yapıya sahiptir. Bu invaziv kapasitenin en azından kısmen intratümör heterojenliği ve DMG hücrelerinin kanser kökü benzeri özellikleri tarafından aracılık edildiği gösterilmiştir⁷.

Testlerimizi örneklemek için, CD44 için bir antikor ile kombinasyon halinde bir antikor etiketleme reaktifi (ALR) kullanıldı. CD44, kanser kök hücre fenotipi ve tümör hücresi göçü ve invazyonu ile ilişkili, kök hücre ve diğer hücre tipleri üzerinde eksprese edilen bir transmembran glikoprotein ve adezyon molekülüdür¹³. Protokoller arasında numune hazırlama, parlak alan ve floresan modunda görüntü elde etme ve 3D invazyon ve göç sırasında DMG hücre zarı üzerindeki genel CD44 ekspresyonunun gerçek zamanlı olarak nicel olarak ölçülmesine izin veren bir canlı hücre analiz cihazında analiz yer alır. Tahliller ayrıca, göç ederken ve istila ederken CD44'ün aralıklı floresan sinyalini tek tek hücreler üzerinde görselleştirme olanağına da izin verdi. İlginç bir şekilde, potansiyel olarak bloke edici bir antikor olarak hareket eden anti-CD44 antikorunun bir etkisi de gözlendi, aynı zamanda hücre göçünü ve invazyonunu azalttığı ve ayrıca invazyon modelinin kolektif mezenkimal benzeri bir fenotipten daha tek hücreli amip benzeri bir fenotipe geçişini indüklediği görüldü.

Protokol

Bu protokol, kurumların insan araştırmaları etik kurullarının yönergelerini takip eder.

NOT: Bu çalışma, Incucyte S3 ve/veya SX5 Canlı Hücre Analiz Cihazı (canlı hücre analiz cihazı olarak referans alınmıştır) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

1. Tekrarlanabilir büyüklükte tümör sferoidlerinin üretilmesi

NOT: Vinci ve ark. 2015 ^7,12 tarafından açıklanan protokol (bölüm 1), bazı değişikliklerle aşağıda bildirildiği gibi kullanılmıştır:

1. DMG H3K27M-mutant nörosferleri (NS) toplayın ve oda sıcaklığında (RT) 10 dakika (dk) boyunca 170 x g'da santrifüjleyin.
2. NS'yi parçalamak için 500 μL akaktaz çözeltisi ile 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
3. Accutase solüsyonunu tümör kök hücre (TSM) ortamı⁷ ile nötralize edin ve hücre süspansiyonunu RT'de 5 dakika boyunca 355 x g'da santrifüjleyin.
4. Hücre peletini 1 mL TSM ortamında yeniden süspanse edin ve ardından bir hücre sayma odası kullanarak hücreleri sayın.
5. 2.5-5 x 10³hücre / mL elde etmek için hücre süspansiyonunu seyreltin ve 100 μL / kuyuyu ultra düşük bağlantı (ULA) 96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakalara tohumlayın (bkz. Hücre tohumlamasından 4 gün sonra ~ 300 μm çapında bireysel NS elde etmek için uygun bir hücre yoğunluğu kullanın (oldukça agresif glioma hücreleri için 250-500 hücre / kuyu).
6. Hücre tohumlamasından 4 gün sonra ters mikroskop kullanarak NS oluşumunu görsel olarak doğrulayın.

2. ALR / antikor kompleksinin hazırlanması ve invazyon testi için kurulum

NOT: Antikor etiketleme prosedürü için, canlı hücre İmmünositokimyası için antikor etiketleme boyaları^{protokolü 10} , aşağıda bildirildiği gibi bazı modifikasyonlarla birlikte kullanılır. İstila tahlili için, daha önce Vinci ve ark. 2015¹² .

1. Her bir reaktif için gereken hacmi analiz etmek ve hesaplamak için kuyu sayısını (örneğin 60 kuyu) göz önünde bulundurun. Ayrıca negatif kontrol için kuyucukları da dahil edin (ALR'li ancak antikorsuz numuneler).
2. Reaktifi yeniden sulandırmak için ALR'ye 100 μL steril su ekleyin (son konsantrasyon = 0.5 mg/mL). Çözeltiyi karıştırmak için pipetleyin.
   NOT: Reaktif ışığa duyarlıdır; Bu nedenle, karanlıkta tutun. Kalan reaktifi ayırın ve -80 °C'de saklayın (donmaktan ve çözülmekten kaçının).
3. Antikoru TSM ortamında (veya tercih edilen hücre hattı için uygun hücre büyüme ortamında) ALR ile yuvarlak tabanlı çok kuyulu bir plakada veya kehribar bir tüpte karıştırın ve ışıktan koruyun.
4. 3x son tahlil konsantrasyonunda 25 μL / kuyu dağıtmak için yeterli miktarda ortam hazırlayın. RT'de 15 dakika inkübe edin.
   NOT: Test antikorunun son (1x) konsantrasyonu <1.5 μg/mL ile 1:3 molar antikor oranı önerilir. Bu protokoldeki deneyler için, 0.1 μg/mL'lik (3x konsantrasyon = 0.3 μg/mL) nihai konsantrasyonda bir anti-insan CD44 fare antikoru (başlangıç konsantrasyonu 86 μg/mL) kullanılır. Reaktifleri aşağıdaki sırayla ekleyin: i) antikor; ii) ALR; iii) TSM ortamı. Pipetleme ile karıştırın.
5. Testin sonunda 0.5 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için arka plan baskılayıcı reaktifini (BSR) TSM ortamında (veya tercih edilen hücre hattı için uygun hücre büyüme ortamında) 1.5 mM'de (3x) seyreltin.
6. İnvazyon tahlilini doğrudan hücrelerin başlangıçta tohumlandığı ULA 96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakada gerçekleştirin. Başlamadan önce ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak NS'yi görsel olarak kontrol edin.
7. NS'nin oturduğu kuyunun dibine dokunmaktan kaçınarak ortamın 75 μL/kuyusunu nazikçe ve yavaşça çıkarın. NS'nin varlığını görsel olarak kontrol edin.
8. Her bir oyuğa yavaşça 25 μL BSR ekleyin.
9. Her bir oyuğa yavaşça 25 μL ALR / antikor kompleksi ekleyin. ALR / antikor kompleksinin ortamla karışmasına izin vermek için 2 veya 3 dakika bekleyin.
10. Her NS'nin kuyunun dibinde merkezi olarak bulunduğundan emin olmak için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak görsel olarak kontrol edin. Kabarcık oluşumundan kaçının. Herhangi bir kabarcık varsa, bir iğne kullanarak çıkarın.
11. Plakayı buzun üzerine yerleştirin ve tabağın tabanının soğuması için 5 dakika bekleyin.
12. Önceden soğutulmuş bir p200 ucuyla, pipet ucunu kuyunun iç duvarına yerleştirerek ve kuyunun dibine dokunmaktan kaçınarak 75 μL/kuyucuk bazal membran matrisi (BMM) dağıtın. Kabarcık oluşumunu önleyin ve mevcut olanları steril bir iğne ile çıkarın.
    NOT: BMM'yi bir gece önce 4 °C'de çözdürdüğünüzden emin olun.
13. BMM'nin ortamla karışmasını sağlamak için plakayı 5 dakika buz üzerinde bırakın. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak NS'nin varlığını ve kuyuda merkezi olarak bulunduğunu görsel olarak kontrol edin. Değilse, plakayı 4 °C'de 180 x g'de 5 dakika santrifüjleyin.
14. Plakayı, inkübatöre yerleştirilmiş canlı hücre analiz cihazına (Malzeme Tablosu) 37 °C, %5_CO2, %95 nemde aktarın.

3. ALR / antikor kompleksinin hazırlanması ve migrasyon testi için kurulum

NOT: Antikor etiketleme prosedürü için, Canlı Hücre İmmünositokimyası için Etiketleme Boyaları protokolü¹⁰ kullanılır.

1. Her bir reaktif için gereken hacmi analiz etmek ve hesaplamak için kuyucuk sayısını göz önünde bulundurun. Negatif kontroller için gerekli kuyuları da dahil edin. Başlamadan önce ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak NS'yi görsel olarak kontrol edin.
2. Düz tabanlı 96 oyuklu plakalar kullanın. Kaplama prosedürünü Vinci ve diğerleri, 2013¹⁴ tarafından açıklandığı gibi gerçekleştirin. Bu çalışma için BMM ince bir kaplama olarak kullanılmıştır.
3. Kaplama hazır olduğunda, ucu kuyunun kenarına yerleştirerek ve tabana dokunmaktan kaçınarak bir p200 ucu ile BMM kaplamasının fazlalığını çıkarın. Birden fazla kuyucukla çalışıyorsanız, çok kanallı bir pipet kullanın.
4. Bir p200 ucu kesin, seçilen her kuyucuktan 50 μL hücre ortamı + NS alın ve kaplanmış düz tabanlı bir kuyuya aktarın. Her bir kuyucuktaki NS'nin varlığını ve konumunu görsel olarak kontrol edin.
   NOT: Her NS, kuyuda merkezi olarak bulunmalıdır. Transfer sırasında kuyu kenarındaki uca yaslanmaktan kaçının, ancak ortamı dibe dokunmadan kuyunun ortasına bırakın. Yüksek oranda göç eden hücreler için, standart üç kopyadan daha fazla sayıda kopya düşünün. Bunun nedeni, NS kuyunun kenarına çok yakın oturduğunda, göç eden hücrelerin kuyunun daha küçük bir alanını kaplayabilmesidir.
5. ALR'yi yukarıda açıklandığı gibi yeniden sulandırın (adım 2.2-2.3).
   NOT: Reaktif ışığa duyarlıdır. İyi kullanım prosedürleri için yukarıya bakın.
6. Antikoru ALR ile uygun tam hücre büyüme ortamında, yuvarlak tabanlı çok kuyulu bir plakada veya kehribar bir tüpte karıştırın ve ışıktan koruyun. 3x son tahlil konsantrasyonunda 50 μL/kuyu dağıtmak için yeterli miktarda hazırlayın. RT'de 15 dakika inkübe edin.
   NOT: Reaktifleri yukarıda belirtildiği sırayla ekleyin (adım 2.4).
7. Adım 2.5'te bildirilen prosedürün aynısını izleyin.
8. Her bir oyuğa yavaşça 50 μL BSR ekleyin.
9. Her oyuğa yavaşça 50 μL ALR / antikor ekleyin. Reaktiflerin karışmasına izin vermek için 2 veya 3 dakika bekleyin ve replikasyon NS'lerinin çoğunun kuyuda merkezi olarak bulunduğundan emin olmak için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak görsel olarak kontrol edin.
10. Kabarcık oluşumunu önleyin ve bir iğne kullanarak mevcut olanları çıkarın. Plakayı 37 °C, %5_CO2, %95 nemde inkübatöre yerleştirilmiş canlı hücre analiz cihazına yavaşça aktarın.

4. Görüntü elde etmek için canlı hücre analiz cihazı ayarı

1. Plakaları, canlı hücre analiz cihazını kullanarak (spesifikasyonlar için, Malzeme Tablosuna bakın), adım 2.14'ten sonra ayarlanan invazyon ve migrasyon tahlillerinin sırasıyla sıfır zaman noktasından (t0) başlayan tarama aralıklarıyla tarayın. ve 3.10. 96 saate kadar.
   NOT: Canlı hücre analiz cihazını, istila ve migrasyon tahlilinin başlamasından hemen sonra imha edebildiğinizden emin olun. Tümör tipine bağlı olarak, hücreler test kurulumundan itibaren 1 saat içinde NS'yi istila etmeye veya göç etmeye başlayabilir.
2. Canlı hücre analiz cihazı yazılımında, Alınacak Zamanlama seçeneğini seçin. + sekmesine tıklayın ve Programa Göre Tara seçeneğini seçin.
3. Gemi Oluştur veya Geri Yükle yazılım penceresinde, Yeni seçeneğine tıklayın.
4. İstila ve geçiş alımı için canlı hücre analiz aracında belirli bir uygulamayı seçin. İnvazyon testi için Spheroid tarama tipi, 4x objektif, Faz+Parlak Alan ve Yeşil görüntü kanallarını seçin. Geçiş testi için Seyreltme Klonlama tarama tipini, 4x hedefi ve Faz ve Yeşil'i seçin.
5. Plaka tipini seçin ve taranacak kuyucukları plaka haritası üzerinde vurgulayarak tanımlayın.
6. Tarama sıklığını ayarlayın (bu protokoldeki deneyler için tarama frekansı invazyon için 15 dakika ve geçiş için 30 dakika idi).
7. Programa Ekle'ye tıklayın ve taramayı başlatın.

5. Görüntü analizi için canlı hücre analiz cihazı ayarı

1. Yeni Analiz Tanımı Oluştur sekmesini seçin.
2. Sekmede sırasıyla istila ve geçiş için Spheroid Invasion veya Basic Analyzer uygulamasını seçin.
3. Görüntü kanalında invasion ve migration için uygun kanalları (Invasion için: Phase+Brightfield-Green; Migration için: Phase-Green) seçin.
4. Analiz ayarını önizlemek ve iyileştirmek için 3-4 kuyudan birkaç temsili görüntü seçin.
5. İstila testi için, Analiz Tanımı sekmesinde, Tüm Küresel ve İstilacı Hücreler arasında kesin bir segmentasyon oluşturmak için Parlak Alan ve Yeşil kanallardaki uygulama ayarlarını aşağıdaki ayarla ayarlayın (bkz. Şekil 5; mavi maske):
   Brightfield Segmentasyonu: Tüm Küresel duyarlılık = 50; İstilacı Hücre duyarlılığı = 100; Temizle = varsayılan.
   Tüm Küresel Filtreler: tüm parametreleri varsayılan olarak ayarlayın.
   İstilacı Hücre Filtreleri: tüm parametreleri varsayılan olarak ayarlayın.
   Yeşil Segmentasyon: Yarıçap = 900.
6. Migrasyon tahlili için, aşağıdaki ayarla Confluence ve Green Cells (bkz. Şekil 5, sarı ve pembe maskeler) arasında kesin bir segmentasyon oluşturmak için Faz ve Yeşil kanallardaki uygulama ayarlarını ayarlayın:
   Aşama: tüm parametreleri varsayılan olarak ayarlayın.
   Yeşil Segmentasyon: Yarıçap = 300; Eşik = 1000
   Temizleme: Delik Doldurma = 400; Filtreler = varsayılan.
   Whole Well: tüm parametreleri varsayılan olarak ayarlayın.
7. Birkaç kuyucuğa rastgele tıklayarak NS için analiz ayarlarının doğru olup olmadığını kontrol edin. Segmentasyon, sferoidin ana hatlarını çizmelidir. Değilse, ayarı buna göre ayarlayın.
8. Analiz edilecek kuyuları ve zaman noktalarını seçin.
9. Analiz Tanımını kaydedin ve Son'a tıklayın.

Sonuçlar

İnvazyon ve migrasyon için Live-3D-Cell İmmünositokimya protokolü, Şekil 1'de basit ve tekrarlanabilir bir iş akışında özetlenmiştir. DMG hücrelerinin ULA 96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakalara tohumlanmasıyla, tekrarlanabilir boyutta NS elde edilir ve görüntülenen adımlarda kullanılır. NS ~300 μm'lik ideal boyuta ulaştığında (tohumlamadan yaklaşık 4 gün sonra) invazyon¹² ve göç¹⁴ tahlilleri başlatılır. ALR/antik...

Tartışmalar

Burada pediatrik DMG invazyonu ve göçü için benimsediğimiz canlı 3D hücre immünositokimyası, meme ve kolon kanseri hücre hatları dahil olmak üzere diğer yüksek invaziv tümör hücre tipleri için de kolayca uyarlanabilir.

Daha önce gerçekleştirilen canlı 2D hücre immünositokimya testlerinden farklı olarak,^{3D olarak} çalışırken, bazı kritik adımlara dikkat edilmesi önerilir. Özellikle, tarif ettiğimiz invazyon testi için, ALR/antikor karı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well TC-Treated Microplates	Corning	3595	size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom
Accutase	Euroclone	ECB3056D	solution for neurosphere dissociation
Burker chamber	Mv medical	FFL16034	cell counting chamber
CD-44 (156-3C11)	Cell Signaling Technology	3570	Mouse mAb IgG2a
Corning Matrigel Matrix	Corning	356237	Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free
Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye	Incucyte	4743	Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry
Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	-	The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.
Inverted Microscope		-	any inverted microscope
Opti-Green Background Suppressor Reagent	Incucyte	6500-0045	Backgroung suppressor reagent (BSR)
Tumor stem cell (TSM) medium	-	-	growth cell medium (see reference in the text for details)
Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Corning Costar	7007	size 96 well, round bottom clear