Иммуноцитохимический анализ живых 3D-клеток диффузной срединной глиомы у детей

Резюме

В этом исследовании представлен протокол иммуноцитохимии живых 3D-клеток, применяемый к детской диффузной срединной клеточной линии глиомы, полезный для изучения в режиме реального времени экспрессии белков на плазматической мембране во время динамических процессов, таких как инвазия и миграция 3D-клеток.

Аннотация

Миграция и инвазия клеток являются специфическими признаками диффузной срединной глиомы (DMG) H3K27M-мутантных опухолей. Мы уже смоделировали эти особенности с помощью трехмерного (3D) клеточного анализа инвазии и миграции. В этом исследовании мы оптимизировали эти 3D-анализы для иммунохимии живых клеток. Реагент для мечения антител был использован для обнаружения в режиме реального времени экспрессии молекулы адгезии CD44 на плазматической мембране мигрирующих и вторгающихся клеток первичной клеточной линии DMG H3K27M, полученной от пациентов. CD44 связан с фенотипом раковых стволовых клеток, миграцией и инвазией опухолевых клеток и участвует в прямом взаимодействии с внеклеточным матриксом центральной нервной системы (ЦНС). Нейросферы (НС) из клеточной линии DMG H3K27M встраивали в матрицу базальной мембраны (BMM) или помещали на тонкий слой покрытия BMM в присутствии антитела к CD44 в сочетании с реагентом для мечения антител (ALR). Иммуноцитохимический анализ живых 3D-клеток проводили на приборе для анализа живых клеток для количественного измерения общей экспрессии CD44, в частности, мигрирующих и вторгающихся клеток. Метод также позволяет визуализировать в режиме реального времени прерывистую экспрессию CD44 на плазматической мембране мигрирующих и инвирующих клеток. Кроме того, анализ также позволил по-новому взглянуть на потенциальную роль CD44 в мезенхимальном переходе в амебоидный в клетках DMG H3K27M.

Введение

Способность опухолевых клеток уклоняться и распространяться через окружающие ткани является отличительной чертой рака¹. В частности, подвижность опухолевых клеток является характерной чертой злокачественных опухолей, будь то метастатический тип опухоли, такой как рак молочной железы 2 или колоректальный^{рак 3}, или местноинвазивный тип, такой как диффузная глиома ^4,5.

Визуализация играет центральную роль в исследовании многих аспектов фенотипов опухолевых клеток; Тем не менее, визуализация живых клеток, безусловно, предпочтительна при изучении динамических клеточных процессов, таких как миграция и инвазия, когда происходят изменения в морфологии и межклеточном взаимодействии ^6,7 и могут быть легче изучены с течением времени. Для визуализации живых клеток могут использоваться различные системы оптической микроскопии, от фазово-контрастных до конфокальных флуоресцентных микроскопов, и получение изображений выполняется в течение короткого или длительного периода времени на инвертированном микроскопе, оснащенном камерой для контроля температуры и_CO2, или в системах анализа изображений с высоким содержанием изображения, которые имеют встроенные камеры, или, в качестве альтернативы, в системах изображений, которые могут находиться в инкубаторе без необходимости тревожить клетки в течение всего времени эксперимента. Выбор используемой системы часто продиктован рядом факторов, таких как необходимое разрешение, продолжительность общего времени сбора данных и временные интервалы, тип используемого сосуда и пропускная способность анализа (однокамерная или многолуночная планшет), чувствительность используемых клеток (драгоценные и/или редкие клетки) и фототоксичность клеток при наличии флуорофоров.

Что касается флуоресцентной визуализации в режиме реального времени, то это может быть достигнуто путем трансдукции клеток для экспрессии флуоресцентных белков либо для стабильной экспрессии, либо в качестве индуцируемой системы⁸, путем транзиторной клеточной трансфекции или с помощью клеточных красителей, которые в настоящее время доступны для мечения живых клеток⁷, для отслеживания живых клеток, а также для мечения субклеточных органелл⁹.

Недавно был разработан полезный подход для иммуноцитохимии живых клеток, при котором антитело, распознающее поверхностный маркер выбора, может быть связано с реагентом для мечения, а при добавлении питательной среды клетки, экспрессирующие специфический маркер, могут быть легко визуализированы в режиме реального времени с помощью визуализации живых клеток. Визуализация и количественная оценка экспрессии маркеров с помощью такой системы могут быть легко достигнуты при выращивании клеток в двумерных (2D) условиях культивирования¹⁰.

В этом исследовании мы оптимизировали протоколы для инвазии и миграции клеток диффузной срединной глиомы (DMG) у детей^11,12. DMG являются высокоагрессивными опухолями головного мозга, поражающими детей, в подавляющем большинстве случаев связанными с драйверной мутацией K27M в вариантах гистонов H3. ДМГ возникают в стволе головного мозга и срединных отделах центральной нервной системы (ЦНС) и характеризуются высокой инфильтративной природой. Было показано, что эта инвазивная способность, по крайней мере частично, опосредована внутриопухолевой гетерогенностью и ракоподобными особенностями стволовых клеток DMG⁷.

В качестве примера для наших анализов использовали реагент для мечения антител (ALR) в комбинации с антителами к CD44. CD44 представляет собой трансмембранный гликопротеин и молекулу адгезии, экспрессируемую на стволовых клетках и других типах клеток, связанную с фенотипом раковых стволовых клеток, миграцией и инвазией опухолевых клеток¹³. Протоколы включают в себя подготовку образца, получение изображения в светлопольном и флуоресцентном режиме, а также анализ на приборе для анализа живых клеток, который позволил количественно измерить в режиме реального времени общую экспрессию CD44 на клеточной мембране DMG во время 3D-инвазии и миграции. Анализы также позволили визуализировать прерывистый флуоресцентный сигнал CD44 на отдельных клетках во время миграции и вторжения. Интересно, что также наблюдался эффект антитела к CD44, который, потенциально действуя как блокирующее антитело, также, по-видимому, уменьшал миграцию и инвазию клеток, а также индуцировал переключение паттерна инвазии с коллективного мезенхимоподобного на более одноклеточный амебоидный фенотип.

протокол

Этот протокол соответствует руководящим принципам комитетов по этике исследований на людях.

ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование было выполнено с использованием Incucyte S3 и/или SX5 Live-Cell Analysis Instrument (упоминается как инструмент для анализа живых клеток).

1. Генерация воспроизводимых размеров опухолевых сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол (раздел 1), описанный Vinci et al. 2015 ^7,12, использовался, как описано ниже, с некоторыми изменениями:

1. Соберите DMG H3K27M-мутантные нейросферы (NS) и центрифугируйте при 170 x g в течение 10 минут (мин) при комнатной температуре (RT).
2. Инкубируют NS с 500 мкл раствора аккутазы в течение 3 мин при 37 °C, чтобы разбить их.
3. Нейтрализуют раствор аккутазы средой из опухолевых стволовых клеток (TSM)⁷ и центрифугируют клеточную суспензию при 355 х г в течение 5 мин при РТ.
4. Ресуспендируйте гранулы клеток в 1 мл среды TSM, а затем подсчитайте количество клеток с помощью камеры для подсчета клеток.
5. Разбавляют клеточную суспензию до получения 2,5-5 x 10³клеток/мл и высевают 100 мкл/лунку в 96-луночные планшеты со сверхнизким прикреплением (ULA) с круглым дном (см. Таблицу материалов). Используйте надлежащую плотность клеток для получения индивидуальных НС диаметром ~300 мкм через 4 дня после посева клеток (250-500 клеток/лунку для высокоагрессивных клеток глиомы).
6. Визуально подтвердите образование НС с помощью инвертированного микроскопа через 4 суток после посева клеток.

2. Подготовка комплекса ALR/антитела и подготовка к анализу инвазии

ПРИМЕЧАНИЕ: Для процедуры мечения антител используется протокол¹⁰ для иммунохимии живых клеток с некоторыми модификациями, как сообщается ниже. Для анализа инвазии следуют протоколу, описанному ранее Vinci et al. 2015¹² .

1. Учитывайте количество лунок (например, 60 лунок) для анализа и расчета объема, необходимого для каждого реагента. Также включают лунки для отрицательного контроля (пробы с ALR, но без антител).
2. Добавьте 100 мкл стерильной воды в ALR для регидратации реагента (конечная концентрация = 0,5 мг/мл). Пипеткой перемешать раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент светочувствителен; Поэтому держитесь в темноте. Аликвотируйте остатки реагента и храните при температуре -80 °C (избегать замораживания и оттаивания).
3. Смешайте антитело с ALR в среде TSM (или соответствующей питательной среде для выбранной клеточной линии) в многолуночной планшете с круглым дном или в янтарной пробирке и защищайте от света.
4. Приготовьте достаточное количество среды для дозирования 25 мкл/лунка при 3-кратной конечной концентрации анализа. Инкубируют при РТ в течение 15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется молярное соотношение антител к ALR 1:3 с конечной (1x) концентрацией тестируемого антитела <1,5 мкг/мл. Для экспериментов по этому протоколу используется мышиное антитело к CD44 (начальная концентрация 86 мкг/мл) в конечной концентрации 0,1 мкг/мл (3-кратная концентрация = 0,3 мкг/мл). Добавляют реагенты в следующем порядке: i) антитела; ii) АЮР; iii) TSM средний. Смешать пипеткой.
5. Разбавьте реагент для подавления фона (BSR) в среде TSM (или подходящей питательной среде для выбранной клеточной линии) в дозе 1,5 мМ (3x), чтобы получить в конце анализа конечную концентрацию 0,5 мМ.
6. Анализ инвазии проводят непосредственно в 96-луночном планшете с круглым дном ULA, где клетки были первоначально засеяны. Перед началом работы проверьте NS визуально с помощью инвертированного микроскопа.
7. Осторожно и медленно удалите 75 мкл/лунку среды, избегая касания дна лунки, где находится NS. Проверьте наличие NS визуально.
8. Аккуратно добавьте 25 мкл BSR в каждую лунку.
9. Аккуратно добавьте 25 мкл комплекса ALR/антитела в каждую лунку. Подождите 2 или 3 минуты, чтобы дать комплексу ALR/антитела смешаться со средой.
10. Проверьте визуально с помощью перевернутого микроскопа, чтобы убедиться, что каждый NS расположен по центру на дне лунки. Не допускать образования пузырей. Если какой-либо пузырь присутствует, удалите его с помощью иглы.
11. Поставьте тарелку на лед и подождите 5 минут, пока дно тарелки остынет.
12. С помощью предварительно охлажденного наконечника p200 дозируйте 75 мкл/лунку матрицы базальной мембраны (BMM), поместив наконечник пипетки на внутреннюю стенку лунки и избегая касания дна лунки. Избегайте образования пузырьков и удаляйте стерильной иглой уже имеющиеся.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что BMM разморозился при температуре 4 °C накануне вечером.
13. Оставьте тарелку на льду на 5 минут, чтобы BMM смешался со средой. Проверьте визуально с помощью инвертированного микроскопа наличие НС и то, что они расположены по центру скважины. Если нет, центрифугируйте планшет при 4 °C при 180 x g в течение 5 минут.
14. Перенесите планшет в прибор для анализа живых клеток (таблица материалов), помещенный в инкубатор при температуре 37 °C, 5% CO₂, влажности 95%.

3. Подготовка комплекса ALR/антитела и подготовка к миграционному анализу

ПРИМЕЧАНИЕ: Для процедуры мечения антител используется протокол Labeling Dyes¹⁰ для иммунохимии живых клеток.

1. Учитывайте количество лунок для анализа и рассчитывайте объем, необходимый для каждого реагента. Включите также скважины, необходимые для отрицательного контроля. Перед началом работы проверьте NS визуально с помощью инвертированного микроскопа.
2. Используйте плоскодонные 96-луночные планшеты. Выполните процедуру нанесения покрытия, как описано в Vinci et al., 2013¹⁴. Для данного исследования БММ используется в качестве тонкого покрытия.
3. Когда покрытие будет готово, удалите излишки покрытия BMM с помощью наконечника p200, поместив наконечник в край колодца и не касаясь дна. При работе с несколькими лунками используйте многоканальную пипетку.
4. Отрежьте наконечник p200, возьмите 50 мкл ячеистой среды + NS из каждой выбранной лунки и перенесите ее в лунку с плоским дном с покрытием. Проверьте наличие и положение НС в каждой скважине визуально.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый NS должен быть расположен в центре скважины. Не опирайтесь на наконечник на краю колодца во время перекачки, но опускайте среду по центру лунки, не касаясь дна. Для клеток с высокой миграционной способностью следует учитывать большее количество репликаций, чем стандартные три репликации. Это связано с тем, что, когда NS находится слишком близко к краю скважины, мигрирующие ячейки могут покрыть меньшую площадь скважины.
5. Регидратируйте ALR, как описано выше (шаги 2.2-2.3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент чувствителен к свету. О правильных процедурах обращения см. выше.
6. Смешайте антитело с ALR в соответствующей среде для выращивания клеток в многолуночном планшете с круглым дном или в янтарной пробирке и защищайте от света. Приготовьте достаточное количество для дозирования 50 мкл/лунка при 3-кратной конечной концентрации анализа. Инкубируют при РТ в течение 15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте реагенты в порядке, указанном выше (шаг 2.4).
7. Выполните ту же процедуру, что описана в шаге 2.5.
8. Аккуратно добавьте 50 мкл BSR в каждую лунку.
9. Аккуратно добавьте 50 мкл ALR/антитела в каждую лунку. Подождите 2 или 3 минуты, чтобы реагенты смешались и визуально проверили с помощью инвертированного микроскопа, чтобы убедиться, что большая часть реплицированных NS находится в центре лунки.
10. Избегайте образования пузырьков и удаляйте все имеющиеся с помощью иглы. Осторожно перенесите планшет в прибор для анализа живых клеток, помещенный в инкубатор при температуре 37 °C, 5% CO₂, влажности 95%.

4. Настройка прибора для анализа живых клеток для получения изображений

1. Сканируйте планшеты с помощью прибора для анализа живых клеток (технические характеристики см. в таблице материалов) с интервалами сканирования, начиная с нулевой точки времени (t0) анализов инвазии и миграции, настроенных соответственно после шага 2.14. и 3.10. до 96 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что прибор для анализа живых клеток можно утилизировать сразу после начала анализа инвазии и миграции. В зависимости от типа опухоли, клетки могут начать проникать или мигрировать из НС уже в течение 1 ч после проведения анализа.
2. В программном обеспечении прибора для анализа живых клеток выберите опцию Schedule to Acquire. Нажмите на вкладку + и выберите опцию Сканировать по расписанию.
3. В окне программы Create or Restore Vessel нажмите на опцию New.
4. Выберите конкретное приложение в приборе для анализа живых клеток для захвата инвазии и миграции. Выберите тип сканирования сфероида , 4-кратный объектив, каналы изображения Phase+Brightfield и Green для анализа инвазии. Выберите тип сканирования «Клонирование с разведением », 4-кратный объектив и фазовый и зеленый для анализа миграции.
5. Выберите тип пластины и определите скважины для сканирования, выделив их на карте пластин.
6. Настройте частоту сканирования (для экспериментов в этом протоколе частота сканирования составляла 15 минут для вторжения и 30 минут для миграции).
7. Нажмите « Добавить в расписание » и запустите сканирование.

5. Настройка прибора для анализа живых клеток для анализа изображений

1. Перейдите на вкладку Создать новое определение анализа.
2. Выберите приложение Spheroid Invasion или Basic Analyzer для инвазии и миграции соответственно на вкладке .
3. Выберите подходящие каналы вторжения и миграции (для Вторжения: Фаза+Светлое поле-Зеленый; для Миграции: Фаза-Зеленый) в канале изображения.
4. Выберите несколько репрезентативных изображений из 3-4 лунок для предварительного просмотра и уточнения параметров анализа.
5. Для анализа инвазии на вкладке Analysis Definition (Определение анализа) отрегулируйте настройки приложения в каналах Brightfield (Светлое поле) и Green (Зеленое поле) с помощью следующей настройки, чтобы создать точную сегментацию между целым сфероидом и вторгающимися ячейками (см. рис. 5; синяя маска):
   Сегментация светлого поля: чувствительность всего сфероида = 50; Чувствительность вторгшейся клетки = 100; Очистка = по умолчанию.
   Whole Spheroid Filters: установить все параметры по умолчанию.
   Invasding Cells Filters: установить все параметры по умолчанию.
   Зеленая сегментация: радиус = 900.
6. Для анализа миграции настройте параметры приложения в каналах Phase и Green , чтобы создать точную сегментацию между Confluence и Green Cells (см. рис. 5, желтая и розовая маски) со следующей настройкой:
   Фаза: установить все параметры по умолчанию.
   Зеленая сегментация: радиус = 300; Порог = 1000
   Очистка: Заполнение отверстий = 400; Фильтры = по умолчанию.
   Whole Well: установить все параметры по умолчанию.
7. Проверьте правильность настроек анализа для NS, щелкнув случайным образом по нескольким лункам. Сегментация должна очерчивать сфероид. Если нет, отрегулируйте настройку соответствующим образом.
8. Выберите скважины и временные точки для анализа.
9. Сохраните определение анализа и нажмите кнопку Готово.

Результаты

Протокол иммуноцитохимии живых 3D-клеток для инвазии и миграции обобщен в виде простого и воспроизводимого рабочего процесса на рисунке 1. Путем посева ячеек DMG в 96-луночные пластины с круглым дном ULA получаются NS воспроизводимого размера, которые используются на показан...

Обсуждение

Иммуноцитохимия живых 3D-клеток, которую мы применили для инвазии и миграции DMG у детей, может быть легко адаптирована и для других высокоинвазивных типов опухолевых клеток, включая клеточные линии рака молочной железы и толстой кишки.

В отличие от ранее выполненных имму?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well TC-Treated Microplates	Corning	3595	size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom
Accutase	Euroclone	ECB3056D	solution for neurosphere dissociation
Burker chamber	Mv medical	FFL16034	cell counting chamber
CD-44 (156-3C11)	Cell Signaling Technology	3570	Mouse mAb IgG2a
Corning Matrigel Matrix	Corning	356237	Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free
Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye	Incucyte	4743	Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry
Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	-	The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.
Inverted Microscope		-	any inverted microscope
Opti-Green Background Suppressor Reagent	Incucyte	6500-0045	Backgroung suppressor reagent (BSR)
Tumor stem cell (TSM) medium	-	-	growth cell medium (see reference in the text for details)
Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Corning Costar	7007	size 96 well, round bottom clear