Saggi di immunocitochimica delle cellule 3D del glioma diffuso della linea mediana pediatrica

Riepilogo

Questo studio presenta un protocollo di immunocitochimica delle cellule 3D vive applicato ad una linea cellulare di glioma diffuso pediatrico della linea mediana, utile per studiare in tempo reale l'espressione delle proteine sulla membrana plasmatica durante processi dinamici come l'invasione e la migrazione delle cellule 3D.

Abstract

La migrazione e l'invasione cellulare sono caratteristiche specifiche dei tumori mutanti H3K27M del glioma diffuso della linea mediana (DMG). Abbiamo già modellato queste caratteristiche utilizzando saggi di invasione e migrazione tridimensionali (3D) basati su cellule. In questo studio, abbiamo ottimizzato questi saggi 3D per l'immunocitochimica delle cellule vive. Un antibody labeling reagent è stato utilizzato per rilevare in tempo reale l'espressione della molecola di adesione CD44, sulla membrana plasmatica delle cellule migranti e invasive di una linea cellulare primaria DMG H3K27M derivata dal paziente. CD44 è associato al fenotipo delle cellule staminali tumorali e alla migrazione e invasione delle cellule tumorali ed è coinvolto nelle interazioni dirette con la matrice extracellulare del sistema nervoso centrale (SNC). Le neurosfere (NS) della linea cellulare DMG H3K27M sono state incorporate nella matrice della membrana basale (BMM) o posizionate su un sottile strato di rivestimento di BMM, in presenza di un anticorpo anti-CD44 in combinazione con il reagente di etichettatura degli anticorpi (ALR). L'analisi dell'immagine immunocitochimica delle cellule 3D vive è stata eseguita su uno strumento di analisi delle cellule vive per misurare quantitativamente l'espressione complessiva di CD44, in particolare sulle cellule migratorie e invasori. Il metodo consente inoltre di visualizzare in tempo reale l'espressione intermittente di CD44 sulla membrana plasmatica delle cellule migratorie e invasori. Inoltre, il test ha anche fornito nuove informazioni sul potenziale ruolo di CD44 nella transizione da mesenchimale ad ameboide nelle cellule DMG H3K27M.

Introduzione

La capacità delle cellule tumorali di eludere e diffondersi attraverso il tessuto circostante è un segno distintivo del cancro¹. In particolare, la motilità delle cellule tumorali è una caratteristica dei tumori maligni, sia che si tratti di un tipo di tumore metastatico come il cancro della mammella² o del colon-retto³ o di un tipo localmente invasivo come il glioma diffuso ^4,5.

L'imaging ha un ruolo centrale nello studio di molti aspetti dei fenotipi delle cellule tumorali; Tuttavia, l'imaging delle cellule vive è sicuramente da preferire quando si studiano processi cellulari dinamici come la migrazione e l'invasione, quando si verificano cambiamenti nella morfologia e nell'interazione cellula-cellula ^6,7 e possono essere esaminati più facilmente nel tempo. Per l'imaging di cellule vive possono essere utilizzati diversi sistemi di microscopia ottica, dal contrasto di fase ai microscopi fluorescenti confocali, e l'acquisizione di immagini eseguita per un breve o lungo periodo di tempo su un microscopio invertito dotato di una camera per il controllo della temperatura e della CO₂, o in sistemi di analisi delle immagini ad alto contenuto che hanno camere incorporate, o in alternativa in sistemi di immagini che possono stare nell'incubatore senza la necessità di disturbare le cellule durante l'intera durata dell'esperimento. La scelta del sistema utilizzato è spesso dettata da una serie di fattori quali la risoluzione necessaria, la durata del tempo e degli intervalli di tempo complessivi di acquisizione, il tipo di vaso utilizzato e la produttività del saggio (monocamera o piastra multipozzetto), la sensibilità delle cellule utilizzate (cellule preziose e/o rare) e la fototossicità delle cellule se sono presenti fluorofori.

Per quanto riguarda l'imaging fluorescente in modalità live, ciò può essere ottenuto trasducendo le cellule per l'espressione di proteine fluorescenti sia per l'espressione stabile che come sistema inducibile⁸, mediante trasfezione di cellule transitorie, o utilizzando coloranti cellulari che sono ora disponibili per l'etichettatura di cellule vive⁷, per il tracciamento di cellule vive e per l'etichettatura di organelli subcellulari⁹.

Un approccio utile è stato recentemente sviluppato per l'immunocitochimica delle cellule vive, in cui un anticorpo che riconosce un marcatore di superficie di scelta può essere legato a un reagente di marcatura e, dopo l'aggiunta ai terreni di coltura, le cellule che esprimono il marcatore specifico possono essere prontamente visualizzate in tempo reale mediante imaging di cellule vive. La visualizzazione e la quantificazione dell'espressione dei marcatori utilizzando un tale sistema possono essere facilmente ottenute quando le cellule sono coltivate in condizioni di coltura bidimensionale (2D)¹⁰.

In questo studio, abbiamo ottimizzato i protocolli per l'invasione immunocitochimica delle cellule immunocitochimiche 3D vive e la migrazione delle cellule derivate dai pazienti con glioma diffuso della linea mediana pediatrica (DMG)^11,12. I DMG sono tumori cerebrali altamente aggressivi che colpiscono i bambini, per la stragrande maggioranza associati alla mutazione driver K27M nelle varianti H3 dell'istone. I DMG insorgono nel tronco encefalico e nelle regioni mediane del sistema nervoso centrale (SNC) e sono caratterizzati da una natura altamente infiltrativa. Questa capacità invasiva ha dimostrato di essere almeno in parte mediata dall'eterogeneità intratumorale e dalle caratteristiche simili a staminali tumorali delle cellule DMG⁷.

Per esemplificare i nostri test, è stato utilizzato un reagente di etichettatura anticorpale (ALR) in combinazione con un anticorpo per CD44. CD44 è una glicoproteina transmembrana e una molecola di adesione espressa sulle cellule staminali e su altri tipi di cellule, associata al fenotipo delle cellule staminali tumorali e alla migrazione e invasione delle cellule tumorali¹³. I protocolli includono la preparazione del campione, l'acquisizione di immagini in modalità brightfield e fluorescente e l'analisi su uno strumento di analisi di cellule vive che ha permesso di misurare quantitativamente in tempo reale l'espressione complessiva di CD44 sulla membrana cellulare DMG durante l'invasione e la migrazione 3D. I saggi hanno anche permesso di visualizzare il segnale fluorescente intermittente di CD44 su singole cellule durante la migrazione e l'invasione. È interessante notare che è stato osservato anche un effetto dell'anticorpo anti-CD44, che potenzialmente agendo come anticorpo bloccante, sembrava anche ridurre la migrazione e l'invasione cellulare, nonché indurre un passaggio del modello di invasione da un fenotipo mesenchimale collettivo a un fenotipo più simile all'ameboide a singola cellula.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida dei comitati etici per la ricerca umana delle istituzioni.

NOTA: Questo studio è stato eseguito utilizzando Incucyte S3 e/o SX5 Live-Cell Analysis Instrument (indicato come strumento di analisi delle cellule vive).

1. Generazione di sferoidi tumorali di dimensioni riproducibili

NOTA: Il protocollo (sezione 1) descritto da Vinci et al. 2015 ^7,12, è stato utilizzato come riportato di seguito, con alcune modifiche:

1. Raccogliere le neurosfere (NS) mutanti DMG H3K27M e centrifugare a 170 x g per 10 minuti (min) a temperatura ambiente (RT).
2. Incubare il NS con 500 μL della soluzione di accutasi per 3 minuti a 37 °C per romperli.
3. Neutralizzare la soluzione di accutasi con cellule staminali tumorali (TSM) mezzo⁷ e centrifugare la sospensione cellulare a 355 x g per 5 minuti a RT.
4. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno TSM e quindi contare le cellule utilizzando una camera di conteggio delle cellule.
5. Diluire la sospensione cellulare per ottenere 2,5-5 x 10³cellule/ml e seminare 100 μL/pozzetto in piastre a fondo tondo a 96 pozzetti (ULA) ultra-low attachment (ULA) (vedere Tabella dei materiali). Utilizzare una densità cellulare adeguata per ottenere NS individuali di ~ 300 μm di diametro, 4 giorni dopo la semina cellulare (250-500 cellule / pozzetto per cellule di glioma altamente aggressive).
6. Confermare visivamente la formazione di NS utilizzando un microscopio invertito 4 giorni dopo la semina cellulare.

2. Preparazione del complesso ALR/anticorpo e messa a punto per il test di invasione

NOTA: Per la procedura di etichettatura degli anticorpi, viene utilizzato il protocollo di etichettatura degli anticorpi¹⁰ per l'immunocitochimica delle cellule vive con alcune modifiche, come riportato di seguito. Per il test di invasione, viene seguito il protocollo precedentemente descritto da Vinci et al. 2015¹² .

1. Considerare il numero di pozzi (ad esempio, 60 pozzi) per analizzare e calcolare il volume necessario per ciascun reagente. Includere anche i pozzetti per il controllo negativo (campioni con ALR ma senza anticorpi).
2. Aggiungere 100 μL di acqua sterile all'ALR per reidratare il reagente (concentrazione finale = 0,5 mg/ml). Pipetta per miscelare la soluzione.
   NOTA: Il reagente è sensibile alla luce; Pertanto, tenere al buio. Aliquotare il reattivo residuo e conservare a -80 °C (evitare il congelamento e lo scongelamento).
3. Mescolare l'anticorpo con l'ALR nel mezzo TSM (o nel mezzo di crescita cellulare appropriato per la linea cellulare scelta) in una piastra multipozzetto a fondo rotondo o in un tubo ambra e proteggere dalla luce.
4. Preparare una quantità sufficiente di terreno per erogare 25 μL/pozzetto a una concentrazione finale di 3 volte quella del dosaggio. Incubare a RT per 15 min.
   NOTA: Si raccomanda un rapporto molare di 1:3 tra anticorpo e ALR, con una concentrazione finale (1x) dell'anticorpo in esame <1,5 μg/ml. Per gli esperimenti in questo protocollo viene utilizzato un anticorpo di topo CD44 anti-umano (concentrazione iniziale 86 μg/mL) ad una concentrazione finale di 0,1 μg/mL (concentrazione 3x = 0,3 μg/mL). Aggiungere i reagenti nel seguente ordine: i) anticorpo; ii) ALR; iii) Medium TSM. Miscelare mediante pipettaggio.
5. Diluire il reagente soppressore di fondo (BSR) nel terreno TSM (o nel mezzo di crescita cellulare appropriato per la linea cellulare di scelta) a 1,5 mM (3x) per ottenere alla fine del test una concentrazione finale di 0,5 mM.
6. Eseguire il test di invasione direttamente nella piastra di fondo rotondo ULA a 96 pozzetti dove le cellule sono state inizialmente seminate. Controllare visivamente il NS utilizzando un microscopio invertito prima di iniziare.
7. Rimuovere delicatamente e lentamente 75 μL/pozzetto del mezzo, evitando di toccare il fondo del pozzetto dove si trova il NS. Verificare visivamente la presenza del NS.
8. Aggiungere delicatamente 25 μL di BSR a ciascun pozzetto.
9. Aggiungere delicatamente 25 μL del complesso ALR/anticorpo a ciascun pozzetto. Attendere 2 o 3 minuti per lasciare che il complesso ALR/anticorpo si mescoli con il mezzo.
10. Controllare visivamente utilizzando un microscopio invertito per assicurarsi che ogni NS sia posizionato centralmente sul fondo del pozzo. Evitare la formazione di bolle. Se è presente una bolla, rimuoverla usando un ago.
11. Posizionare il piatto sul ghiaccio e attendere 5 minuti per lasciare che il fondo del piatto si raffreddi.
12. Con una punta p200 preraffreddata, erogare 75 μL/pozzetto di matrice a membrana basale (BMM), posizionando la punta della pipetta sulla parete interna del pozzetto ed evitando di toccare il fondo del pozzetto. Evitare la formazione di bolle e rimuovere con un ago sterile quelle esistenti.
    NOTA: Assicurarsi di aver scongelato il BMM a 4 °C dalla sera prima.
13. Lasciare la piastra sul ghiaccio per 5 minuti per lasciare che il BMM si mescoli con il mezzo. Controllare visivamente con un microscopio invertito la presenza dei NS e che siano situati centralmente nel pozzo. In caso contrario, centrifugare la piastra a 4 °C a 180 x g per 5 minuti.
14. Trasferire la piastra nello strumento di analisi delle cellule vive (Table of Materials) posto all'interno dell'incubatore a 37 °C, 5% CO₂, 95% umidità.

3. Preparazione del complesso ALR/anticorpo e messa a punto per il saggio di migrazione

NOTA: Per la procedura di etichettatura degli anticorpi, viene utilizzato il protocollo Labeling Dyes¹⁰ per l'immunocitochimica delle cellule vive.

1. Considerare il numero di pozzi da analizzare e calcolare il volume necessario per ciascun reagente. Includere anche i pozzetti necessari per i controlli negativi. Controllare visivamente il NS utilizzando un microscopio invertito prima di iniziare.
2. Utilizzare piastre a fondo piatto da 96 pozzetti. Eseguire la procedura di rivestimento come descritto da Vinci et al., 2013¹⁴. Per questo studio, il BMM viene utilizzato come rivestimento sottile.
3. Una volta che il rivestimento è pronto, rimuovere l'eccesso di rivestimento BMM con una punta p200 posizionando la punta nel bordo del pozzetto ed evitando di toccare il fondo. Se si lavora con più pozzetti, utilizzare una pipetta multicanale.
4. Tagliare una punta p200, prelevare 50 μL del mezzo cellulare + NS da ciascun pozzetto selezionato e trasferirlo in un pozzetto a fondo piatto rivestito. Controllare visivamente la presenza e la posizione del NS in ciascun pozzetto.
   NOTA: Ogni NS deve essere posizionato centralmente nel pozzo. Evitare di appoggiarsi alla punta sul bordo del pozzo durante il trasferimento, ma lasciare cadere il mezzo centralmente nel pozzo senza toccare il fondo. Per le celle altamente migratorie, considerare un numero maggiore di repliche rispetto alle tre repliche standard. Questo perché quando NS si trova troppo vicino al bordo del pozzo, le cellule in migrazione possono coprire un'area più piccola del pozzo.
5. Reidratare l'ALR come descritto sopra (fasi 2.2-2.3).
   NOTA: il reagente è sensibile alla luce. Vedi sopra per buone procedure di gestione.
6. Mescolare l'anticorpo con ALR nell'apposito mezzo di crescita cellulare completo in una piastra multipozzetto a fondo rotondo o in un tubo ambrato e proteggere dalla luce. Preparare una quantità sufficiente per erogare 50 μL/pozzetto a una concentrazione finale di 3 volte quella del test. Incubare a RT per 15 min.
   NOTA: Aggiungere i reagenti nell'ordine indicato sopra (punto 2.4).
7. Seguire la stessa procedura riportata nel passaggio 2.5.
8. Aggiungere delicatamente 50 μL di BSR a ciascun pozzetto.
9. Aggiungere delicatamente 50 μL di ALR/anticorpo a ciascun pozzetto. Attendere 2 o 3 minuti per lasciare che i reagenti si mescolino e controllare visivamente utilizzando un microscopio invertito per assicurarsi che la maggior parte dei NS replicati si trovino centralmente nel pozzo.
10. Evitare la formazione di bolle e rimuovere quelle esistenti utilizzando un ago. Trasferire delicatamente la piastra nello strumento di analisi delle cellule vive posto all'interno dell'incubatore a 37 °C, 5% CO₂, 95% umidità.

4. Impostazione dello strumento di analisi delle cellule vive per l'acquisizione di immagini

1. Scansionare le lastre utilizzando lo strumento di analisi delle cellule vive (per le specifiche, vedere la Tabella dei materiali) con intervalli di scansione a partire dal punto di tempo zero (t0) dei saggi di invasione e migrazione impostati, rispettivamente, dopo il passaggio 2.14. e 3.10. fino a 96 h.
   NOTA: Assicurarsi di essere in grado di smaltire lo strumento di analisi delle cellule vive immediatamente dopo l'inizio del test di invasione e migrazione. A seconda del tipo di tumore, le cellule possono iniziare a invadere o migrare dal NS già entro 1 ora dalla configurazione del test.
2. Nel software dello strumento di analisi delle cellule vive, selezionare l'opzione Pianifica acquisizione. Fare clic sulla scheda + e selezionare l'opzione Scansione in programma.
3. Nella finestra del software Crea o ripristina nave, fare clic sull'opzione Nuovo.
4. Selezionare l'applicazione specifica nello strumento di analisi delle cellule vive per l'acquisizione dell'invasione e della migrazione. Selezionare il tipo di scansione sferoide , l'obiettivo 4x, i canali immagine Phase + Brightfield e Green per il test di invasione. Selezionare il tipo di scansione di clonazione a diluizione , obiettivo 4x e Fase e verde per il test di migrazione.
5. Selezionare il tipo di piastra e definire i pozzi da scansionare evidenziandoli sulla mappa della piastra.
6. Impostare la frequenza di scansione (per gli esperimenti in questo protocollo la frequenza di scansione era di 15 minuti per l'invasione e 30 minuti per la migrazione).
7. Fare clic su Aggiungi a programma e avviare la scansione.

5. Impostazione dello strumento di analisi delle cellule vive per l'analisi delle immagini

1. Selezionare la scheda Crea nuova definizione di analisi.
2. Selezionare Spheroid Invasion o Basic Analyzer application per invasione e migrazione, rispettivamente, nella scheda.
3. Selezionare i canali appropriati per l'invasione e la migrazione (per Invasione: Fase+Campo Luminoso-Verde; per Migrazione: Fase-verde) nel canale immagine.
4. Selezionare alcune immagini rappresentative da 3-4 pozzetti per visualizzare in anteprima e perfezionare l'impostazione di analisi.
5. Per il saggio di invasione, nella scheda Definizione analisi, regolare le impostazioni dell'applicazione nei canali Brightfield e Green con la seguente impostazione per generare una segmentazione precisa tra le cellule sferoidi intere e invasive (vedere Figura 5; maschera blu):
   Segmentazione in campo chiaro: sensibilità sferoide intera = 50; Sensibilità delle cellule invasori = 100; Pulisci = predefinito.
   Filtri sferoidi interi: imposta tutti i parametri come predefiniti.
   Invading Cells Filters: imposta tutti i parametri come predefiniti.
   Segmentazione verde: raggio = 900.
6. Per il test di migrazione, regolare le impostazioni dell'applicazione nei canali Fase e Verde per generare una segmentazione precisa tra le celle Confluence e Green (vedere la Figura 5, maschere gialle e rosa) con la seguente impostazione:
   Fase: imposta tutti i parametri come predefiniti.
   Segmentazione verde: raggio = 300; Soglia = 1000
   Pulizia: riempimento foro = 400; Filtri = predefinito.
   Whole Well: imposta tutti i parametri come predefiniti.
7. Verificare che le impostazioni di analisi siano corrette per il NS facendo clic in modo casuale su diversi pozzi. La segmentazione deve delineare lo sferoide. In caso contrario, regolare l'impostazione di conseguenza.
8. Selezionare i pozzi e i punti temporali da analizzare.
9. Salvate la definizione dell'analisi e fate clic su Fine (Finish).

Risultati

Il protocollo di immunocitochimica delle cellule 3D vive per l'invasione e la migrazione è riassunto in un flusso di lavoro semplice e riproducibile nella Figura 1. Seminando le celle DMG in piastre a fondo tondo ULA a 96 pozzetti, si ottengono NS di dimensioni riproducibili e vengono utilizzate nei passaggi visualizzati. Quando i NS hanno raggiunto la dimensione ideale di ~300 μm (circa 4 giorni dopo la semina) vengono avviati i saggi di invasione¹² e migrazione

Discussione

L'immunocitochimica delle cellule 3D vive che abbiamo adottato qui per l'invasione e la migrazione del DMG pediatrico potrebbe essere facilmente adattata anche per altri tipi di cellule tumorali altamente invasive, comprese le linee cellulari di cancro al seno e al colon.

A differenza dei saggi di immunocitochimica delle cellule 2D vive precedentemente eseguiti¹⁰, quando si lavora in 3D, si suggerisce di prestare attenzione ad alcuni passaggi critici. In particolare, p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well TC-Treated Microplates	Corning	3595	size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom
Accutase	Euroclone	ECB3056D	solution for neurosphere dissociation
Burker chamber	Mv medical	FFL16034	cell counting chamber
CD-44 (156-3C11)	Cell Signaling Technology	3570	Mouse mAb IgG2a
Corning Matrigel Matrix	Corning	356237	Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free
Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye	Incucyte	4743	Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry
Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	-	The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.
Inverted Microscope		-	any inverted microscope
Opti-Green Background Suppressor Reagent	Incucyte	6500-0045	Backgroung suppressor reagent (BSR)
Tumor stem cell (TSM) medium	-	-	growth cell medium (see reference in the text for details)
Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Corning Costar	7007	size 96 well, round bottom clear