Ensaios de imunocitoquímica de células 3D vivas de glioma difuso da linha média pediátrica

Resumo

Este estudo apresenta um protocolo de imunocitoquímica de células vivas 3D aplicado a uma linhagem celular pediátrica de glioma difuso da linha média, útil para estudar em tempo real a expressão de proteínas na membrana plasmática durante processos dinâmicos como invasão e migração de células 3D.

Resumo

A migração e invasão celular são características específicas dos tumores mutantes H3K27M de glioma difuso da linha média (DMG). Já modelamos essas características usando ensaios tridimensionais (3D) de invasão e migração baseados em células. Neste estudo, otimizamos esses ensaios 3D para imunocitoquímica de células vivas. Um Antibody Labeling Reagent foi usado para detectar em tempo real a expressão da molécula de adesão CD44, na membrana plasmática de células migratórias e invasoras de uma linhagem celular primária derivada de paciente DMG H3K27M. O CD44 está associado ao fenótipo de células-tronco cancerígenas e à migração e invasão de células tumorais e está envolvido nas interações diretas com a matriz extracelular do sistema nervoso central (SNC). As neuroesferas (NS) da linhagem celular DMG H3K27M foram embutidas na matriz de membrana basal (BMM) ou colocadas em uma fina camada de revestimento de BMM, na presença de um anticorpo anti-CD44 em conjunto com o reagente de marcação de anticorpos (ALR). A análise de imagens imunocitoquímicas de células vivas em 3D foi realizada em um instrumento de análise de células vivas para medir quantitativamente a expressão global de CD44, especificamente nas células migrantes e invasoras. O método também permite visualizar em tempo real a expressão intermitente de CD44 na membrana plasmática de células migratórias e invasoras. Além disso, o ensaio também forneceu novos conhecimentos sobre o papel potencial do CD44 na transição mesenquimal para ameboide em células DMG H3K27M.

Introdução

A capacidade das células tumorais de evadir e disseminar-se através do tecido circundante é uma característica do câncer¹. Em particular, a motilidade das células tumorais é uma característica dos tumores malignos, seja um tipo de tumor metastático, como^{o câncer de} mama² ou colorretal3, ou um tipo localmente invasivo, como o glioma^difuso4,5.

Os exames de imagem têm um papel central na investigação de muitos aspectos dos fenótipos de células tumorais; No entanto, a imagem de células vivas é definitivamente preferida quando se estudam processos celulares dinâmicos, como migração e invasão, quando ocorrem mudanças na morfologia e na interação^{célula-célula6,7} e podem ser mais facilmente examinadas ao longo do tempo. Para imagens de células vivas, diferentes sistemas de microscopia óptica podem ser usados, desde contraste de fase até microscópios confocais fluorescentes, e aquisição de imagens realizadas por um curto ou longo período de tempo em um microscópio invertido equipado com uma câmara para controle de temperatura e CO₂, ou em sistemas de análise de imagem de alto conteúdo que possuem câmaras embutidas, ou alternativamente em sistemas de imagem que podem ficar na incubadora sem a necessidade de perturbar as células durante toda a duração do experimento. A escolha do sistema utilizado é frequentemente ditada por uma série de fatores, tais como a resolução necessária, a duração do tempo total de aquisição e intervalos de tempo, o tipo de vaso utilizado e o rendimento do ensaio (câmara única ou placa de poço múltiplo), a sensibilidade das células utilizadas (células preciosas e/ou raras) e a fototoxicidade das células se fluoroforóricos estiverem presentes.

No que diz respeito à imagem fluorescente em modo vivo, isso pode ser obtido pela transdução de células para a expressão de proteínas fluorescentes para expressão estável ou como um sistema induzível⁸, por transfecção celular transitória ou pelo uso de corantes celulares que agora estão disponíveis para marcação de células vivas⁷, para rastreamento de células vivas e para marcação de organelas subcelulares⁹.

Uma abordagem útil foi recentemente desenvolvida para imunocitoquímica de células vivas, onde um anticorpo reconhecendo um marcador de superfície de escolha pode ser ligado a um reagente de marcação e, após adição ao meio de cultura, as células que expressam o marcador específico podem ser prontamente imageadas em tempo real por imagens de células vivas. A visualização e quantificação da expressão de marcadores por este sistema podem ser facilmente obtidas quando as células são cultivadas em condições de cultura bidimensional (2D)¹⁰.

Neste estudo, otimizamos protocolos para invasão imunocitoquímica de células vivas 3D e migração de células pediátricas derivadas de glioma difuso da linha média (DMG)^{do paciente 11,12}. DMG são tumores cerebrais altamente agressivos que afetam crianças, para a grande maioria associados com a mutação condutora K27M em variantes de histona H3. As DMG surgem no tronco cerebral e nas regiões da linha média do sistema nervoso central (SNC) e são caracterizadas por uma natureza altamente infiltrativa. Demonstrou-se que essa capacidade invasiva é, pelo menos em parte, mediada pela heterogeneidade intratumoral e pelas características cancerígenas das células DMG⁷.

Para exemplificar nossos ensaios, um reagente de marcação de anticorpos (ALR) foi usado em combinação com um anticorpo para CD44. CD44 é uma glicoproteína transmembrana e molécula de adesão expressa em células-tronco e outros tipos celulares, associada ao fenótipo de células-tronco cancerígenas e à migração e invasão de células^tumorais13. Os protocolos incluem a preparação da amostra, a aquisição da imagem em modo de campo claro e fluorescente e a análise em um instrumento de análise de células vivas que permitiu medir quantitativamente em tempo real a expressão global de CD44 na membrana celular DMG durante a invasão e migração 3D. Os ensaios também permitiram visualizar o sinal fluorescente intermitente de CD44 em células individuais durante a migração e a invasão. Curiosamente, um efeito do anticorpo anti-CD44 também foi observado, que potencialmente agindo como um anticorpo bloqueador, também pareceu reduzir a migração e invasão celular, bem como induzir uma mudança do padrão de invasão de um mesenquimal coletivo para um fenótipo amebóide-like de célula única.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes dos comitês de ética em pesquisa com seres humanos das instituições.

NOTA: Este estudo foi realizado utilizando o Incucyte S3 e/ou SX5 Live-Cell Analysis Instrument (referenciado como instrumento de análise de células vivas).

1. Geração de esferoides tumorais de tamanho reprodutível

NOTA: O protocolo (seção 1) descrito por Vinci et al., 2015 ^7,12, foi utilizado conforme relatado a seguir, com algumas modificações:

1. Coletar as neuroesferas mutantes (NS) DMG H3K27M e centrifugar a 170 x g por 10 minutos (min) à temperatura ambiente (TR).
2. Incubar o SN com 500 μL da solução de acutase durante 3 minutos a 37 °C para os quebrar.
3. Neutralizar a solução de acutase com meio de células-tronco tumorais (TSM)⁷ e centrifugar a suspensão celular a 355 x g por 5 min na RT.
4. Ressuspender o pellet de células em 1 mL de meio TSM e, em seguida, contar as células usando uma câmara de contagem de células.
5. Diluir a suspensão celular para obter 2,5-5 x 10³células/mL e semear 100 μL/poço em placas de fundo redondo de 96 poços de fixação ultrabaixa (ULA) (ver Tabela de Materiais). Use uma densidade celular adequada para obter NS individual de ~300 μm de diâmetro, 4 dias após a semeadura celular (250-500 células/poço para células de glioma altamente agressivas).
6. Confirmar visualmente a formação de SN usando um microscópio invertido 4 dias após a semeadura celular.

2. Preparo do complexo ALR/anticorpo e configuração para o ensaio de invasão

NOTA: Para o procedimento de marcação de anticorpos, o protocolo de marcação de anticorpos¹⁰ para imunocitoquímica de células vivas é usado com algumas modificações, conforme relatado abaixo. Para o ensaio de invasão, é seguido o protocolo descrito anteriormente por Vinci et^{al.12 12} .

1. Considere o número de poços (por exemplo, 60 poços) para analisar e calcular o volume necessário para cada reagente. Incluir também os poços para o controle negativo (amostras com ALR, mas sem anticorpo).
2. Adicionar 100 μL de água estéril à ALR para reidratar o reagente (concentração final = 0,5 mg/mL). Pipetar para misturar a solução.
   NOTA: O reagente é sensível à luz; portanto, mantenha-se no escuro. Aliquot as sobras de reagente e armazenar a -80 °C (evitar congelamento e descongelamento).
3. Misture o anticorpo com a ALR no meio TSM (ou meio de crescimento celular apropriado para a linha celular de escolha) em uma placa de fundo redondo de vários poços ou em um tubo âmbar e proteja da luz.
4. Preparar quantidade suficiente do meio para dispensar 25 μL/poço na concentração final do ensaio de 3x. Incubar em TR por 15 min.
   NOTA: Recomenda-se uma razão molar de 1:3 de anticorpo para ALR, com uma concentração final (1x) do anticorpo teste <1,5 μg/mL. Para os experimentos deste protocolo é utilizado um anticorpo anti-humano CD44 de camundongo (concentração inicial 86 μg/mL) na concentração final de 0,1 μg/mL (concentração 3x = 0,3 μg/mL). Adicionar os reagentes na seguinte ordem: i) anticorpo; ii) ALR; iii) Meio TSM. Misture por pipetagem.
5. Diluir o reagente supressor de fundo (BSR) em meio TSM (ou meio de crescimento celular apropriado para a linhagem celular de escolha) a 1,5 mM (3x) para obter no final do ensaio uma concentração final de 0,5 mM.
6. Realizar o ensaio de invasão diretamente na placa de fundo redondo de 96 poços da ULA, onde as células foram inicialmente semeadas. Verifique visualmente o SN usando um microscópio invertido antes de iniciar.
7. Remover suave e lentamente 75 μL/poço do meio, evitando tocar o fundo do poço onde se encontra o SN. Verifique visualmente a presença do SN.
8. Adicione suavemente 25 μL da BSR a cada poço.
9. Adicione suavemente 25 μL do complexo ALR/anticorpo a cada poço. Aguarde 2 ou 3 minutos para deixar o complexo ALR/anticorpo misturar-se com o meio.
10. Verifique visualmente usando um microscópio invertido para garantir que cada NS esteja localizado centralmente na parte inferior do poço. Evite a formação de bolhas. Se houver alguma bolha, remova-a usando uma agulha.
11. Coloque a placa no gelo e espere 5 min para deixar o fundo da placa esfriar.
12. Com uma ponta p200 pré-resfriada, dispense 75 μL/poço de matriz de membrana basal (BMM), colocando a ponta da pipeta na parede interna do poço e evitando tocar o fundo do poço. Evite a formação de bolhas e remova com uma agulha estéril as existentes.
    NOTA: Certifique-se de ter descongelado o BMM a 4 °C da noite anterior.
13. Deixe a placa no gelo por 5 min para deixar o BMM misturar com o meio. Verificar visualmente, por meio de microscópio invertido, a presença do SN e se eles estão localizados centralmente no poço. Caso contrário, centrifugar a placa a 4 °C a 180 x g durante 5 min.
14. Transfira a placa no instrumento de análise de células vivas (Tabela de Materiais) colocado dentro da incubadora a 37 °C, 5% CO₂, 95% de umidade.

3. Preparação do complexo ALR/anticorpo e configuração para o ensaio de migração

NOTA: Para o procedimento de marcação de anticorpos, o protocolo de Marcação de Corantes¹⁰ para Imunocitoquímica de Células Vivas é usado.

1. Considere o número de poços para analisar e calcular o volume necessário para cada reagente. Inclua também os poços necessários para os controles negativos. Verifique visualmente o SN usando um microscópio invertido antes de iniciar.
2. Use placas de fundo plano de 96 poços. Realizar o procedimento de revestimento conforme descrito por Vinci et al., 2013¹⁴. Para este estudo, o BMM é usado como um revestimento fino.
3. Assim que o revestimento estiver pronto, remova o excesso de revestimento BMM com uma ponta p200 colocando a ponta na borda do poço e evitando tocar no fundo. Se estiver trabalhando com vários poços, use uma pipeta multicanal.
4. Corte uma ponta p200, pegue 50 μL do meio celular + NS de cada poço selecionado e transfira-o para um poço de fundo plano revestido. Verifique visualmente a presença e a posição do SN em cada poço.
   NOTA: Cada NS deve estar localizado centralmente no poço. Evite apoiar-se na ponta na borda do poço durante a transferência, mas solte o meio centralmente no poço sem tocar no fundo. Para células altamente migratórias, considere um número maior de réplicas do que as três réplicas padrão. Isso ocorre porque quando o NS fica muito perto da borda do poço, as células migratórias podem cobrir uma área menor do poço.
5. Reidratar a ALR conforme descrito acima (passos 2.2-2.3).
   NOTA: O reagente é sensível à luz. Veja acima os bons procedimentos de manuseio.
6. Misture o anticorpo com ALR no meio de crescimento celular completo apropriado em uma placa de fundo redondo de vários poços ou em um tubo âmbar e proteja da luz. Preparar quantidade suficiente para dispensar 50 μL/poço a 3x concentração final do ensaio. Incubar em TR por 15 min.
   NOTA: Adicione os reagentes na ordem indicada acima (passo 2.4).
7. Siga o mesmo procedimento relatado na etapa 2.5.
8. Adicione suavemente 50 μL da BSR a cada poço.
9. Adicione suavemente 50 μL de ALR/anticorpo a cada poço. Aguarde 2 ou 3 min para deixar os reagentes se misturarem e verifique visualmente usando um microscópio invertido para garantir que a maioria dos NS replicados estejam localizados centralmente no poço.
10. Evite a formação de bolhas e remova as existentes usando uma agulha. Transfira suavemente a placa no instrumento de análise de células vivas colocado dentro da incubadora a 37 °C, 5% CO₂, 95% de umidade.

4. Configuração do instrumento de análise de células vivas para aquisição de imagens

1. Digitalize as placas usando o instrumento de análise de células vivas (para especificações, consulte Tabela de Materiais) com intervalos de varredura a partir do ponto de tempo zero (t0) dos ensaios de invasão e migração configurados, respectivamente, após a etapa 2.14. e 3.10. até 96 h.
   NOTA: Garantir a possibilidade de eliminar o instrumento de análise de células vivas imediatamente após o início do ensaio de invasão e migração. Dependendo do tipo de tumor, as células podem começar a invadir ou migrar da SN já dentro de 1 h da instalação do ensaio.
2. No software de instrumento de análise de células vivas, selecione a opção Programar para Adquirir. Clique na guia + e selecione a opção Digitalizar no agendamento.
3. Na janela do software Create or Restore Vessel, clique na opção New.
4. Selecione a aplicação específica no instrumento de análise de células vivas para a aquisição de invasão e migração. Selecione Tipo de varredura esferoide , objetiva 4x, Phase+Brightfield e canais de imagem verde para o ensaio de invasão. Selecione Tipo de varredura de clonagem de diluição , Objetivo 4x e Fase e Verde para o ensaio de migração.
5. Selecione o tipo de placa e defina os poços a serem escaneados, destacando-os no mapa da placa.
6. Definir a frequência de varredura (para os experimentos neste protocolo, a frequência de varredura foi de 15 min para invasão e 30 min para migração).
7. Clique em Adicionar à programação e inicie a verificação.

5. Configuração do instrumento de análise de células vivas para análise de imagens

1. Selecione a guia Criar Nova Definição de Análise.
2. Selecione o aplicativo Spheroid Invasion ou Basic Analyzer para invasão e migração, respectivamente, na guia.
3. Selecione os canais apropriados de invasão e migração (para Invasão: Fase+Brightfield-Green; para Migração: Fase-Verde) no canal de imagem.
4. Selecione algumas imagens representativas de 3-4 poços para visualizar e refinar a configuração de análise.
5. Para o ensaio de invasão, na guia Definição de análise , ajuste as configurações do aplicativo nos canais Brightfield e Green com a seguinte configuração para gerar uma segmentação precisa entre as células esferoides inteiras e invasoras (consulte a Figura 5; máscara azul):
   Segmentação de Campo Brilhante: Sensibilidade Esferoide Inteira = 50; Sensibilidade de Células Invasoras = 100; Limpar = padrão.
   Filtros Esferoides Inteiros: defina todos os parâmetros como padrão.
   Filtros de células invasoras: defina todos os parâmetros como padrão.
   Segmentação Verde: Raio = 900.
6. Para o ensaio de migração, ajuste as configurações do aplicativo nos canais Phase e Green para gerar uma segmentação precisa entre as células Confluence e Green (consulte a Figura 5, máscaras amarelas e rosas) com a seguinte configuração:
   Fase: defina todos os parâmetros como padrão.
   Segmentação Verde: Raio = 300; Limiar = 1000
   Limpeza: Preenchimento de furo = 400; Filtros = padrão.
   Whole Well: defina todos os parâmetros como padrão.
7. Verifique se as configurações de análise estão corretas para o SN clicando aleatoriamente em vários poços. A segmentação deve delinear o esferoide. Caso contrário, ajuste a configuração de acordo.
8. Selecione os poços e os pontos de tempo a serem analisados.
9. Salve a Definição de Análise e clique em Concluir.

Resultados

O protocolo de imunocitoquímica de células vivas 3D para invasão e migração é resumido em um fluxo de trabalho simples e reprodutível na Figura 1. Ao semear as células DMG em placas de fundo redondo ULA 96 poços, NS de tamanho reprodutível são obtidos e usados nas etapas exibidas. Quando o SN atinge o tamanho ideal de ~300 μm (aproximadamente 4 dias pós-semeadura), iniciam-se os ensaios de invasão¹² e migração¹⁴ . A adição do ...

Discussão

A imunocitoquímica de células vivas 3D que adotamos aqui para invasão e migração de DMG pediátrica pode ser facilmente adaptada também para outros tipos de células tumorais altamente invasivas, incluindo linhagens de células de câncer de mama e cólon.

Diferentemente dos ensaios de imunocitoquímica de células vivas^{2D previamente realizados 10}, quando se trabalha em 3D, sugere-se atentar para algumas etapas críticas. Em particular, para o ensaio de invasão...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well TC-Treated Microplates	Corning	3595	size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom
Accutase	Euroclone	ECB3056D	solution for neurosphere dissociation
Burker chamber	Mv medical	FFL16034	cell counting chamber
CD-44 (156-3C11)	Cell Signaling Technology	3570	Mouse mAb IgG2a
Corning Matrigel Matrix	Corning	356237	Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free
Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye	Incucyte	4743	Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry
Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	-	The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.
Inverted Microscope		-	any inverted microscope
Opti-Green Background Suppressor Reagent	Incucyte	6500-0045	Backgroung suppressor reagent (BSR)
Tumor stem cell (TSM) medium	-	-	growth cell medium (see reference in the text for details)
Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Corning Costar	7007	size 96 well, round bottom clear