Ensayos de inmunocitoquímica de células 3D vivas del glioma difuso de línea media infantil

Resumen

Este estudio presenta un protocolo de inmunocitoquímica de células vivas en 3D aplicado a una línea celular de glioma difuso de línea media pediátrico, útil para estudiar en tiempo real la expresión de proteínas en la membrana plasmática durante procesos dinámicos como la invasión y migración de células 3D.

Resumen

La migración celular y la invasión son características distintivas específicas de los tumores con mutación H3K27M en glioma difuso de línea media (DMG). Ya hemos modelado estas características utilizando ensayos tridimensionales (3D) de invasión y migración basados en células. En este estudio, hemos optimizado estos ensayos 3D para la inmunocitoquímica de células vivas. Se utilizó un reactivo de marcaje de anticuerpos para detectar en tiempo real la expresión de la molécula de adhesión CD44, en la membrana plasmática de células migratorias e invasoras de una línea celular primaria derivada del paciente DMG H3K27M. CD44 se asocia con el fenotipo de las células madre cancerosas y la migración e invasión de células tumorales y está involucrado en las interacciones directas con la matriz extracelular del sistema nervioso central (SNC). Las neuroesferas (NS) de la línea celular DMG H3K27M se incrustaron en la matriz de la membrana basal (BMM) o se colocaron sobre una capa delgada de BMM, en presencia de un anticuerpo anti-CD44 junto con el reactivo de marcaje de anticuerpos (ALR). El análisis de imágenes de inmunocitoquímica de células vivas en 3D se realizó en un instrumento de análisis de células vivas para medir cuantitativamente la expresión general de CD44, específicamente en las células migratorias e invasoras. El método también permite visualizar en tiempo real la expresión intermitente de CD44 en la membrana plasmática de las células migratorias e invasoras. Además, el ensayo también proporcionó nuevos conocimientos sobre el papel potencial de CD44 en la transición mesenquimal a ameboide en células DMG H3K27M.

Introducción

La capacidad de las células tumorales para evadir y diseminarse a través del tejido circundante es un sello distintivo^{del cáncer.} En particular, la motilidad de las células tumorales es un rasgo característico de los tumores malignos, ya sea un tipo de tumor metastásico como el cáncer de mama² o colorrectal³ o un tipo localmente invasivo como el glioma difuso ^4,5.

Las imágenes tienen un papel central en la investigación de muchos aspectos de los fenotipos de las células tumorales; Sin embargo, la obtención de im....

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices de los comités de ética en investigación en humanos de las instituciones.

NOTA: Este estudio se realizó utilizando el instrumento de análisis de células vivas Incucyte S3 y/o SX5 (referenciado como instrumento de análisis de células vivas).

1. Generación de esferoides tumorales de tamaño reproducible

NOTA: Se utilizó el protocolo (sección 1) descrito por Vinci et al. 2015 ^7,12, como se informa a continuación, con algunas modificaciones:

1. Recoja las neuroesferas (NS)....

Resultados

El protocolo de inmunocitoquímica de células vivas en 3D para la invasión y la migración se resume en un flujo de trabajo sencillo y reproducible en la Figura 1. Al sembrar las células DMG en placas de fondo redondo ULA de 96 pocillos, se obtienen NS de tamaño reproducible y se utilizan en los pasos que se muestran. Cuando los SN han alcanzado el tamaño ideal de ~300 μm (aproximadamente 4 días después de la siembra) se inician los ensayos de invasión¹² y mi.......

Discusión

La inmunocitoquímica de células vivas en 3D que hemos adoptado aquí para la invasión y migración pediátrica de DMG podría adaptarse fácilmente también a otros tipos de células tumorales altamente invasivas, incluidas las líneas celulares de cáncer de mama y colon.

A diferencia de los ensayos de inmunocitoquímica de células vivas 2D realizados anteriormente¹⁰, cuando se trabaja en 3D, se sugiere prestar atención a algunos pasos críticos. En particular, p.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well TC-Treated Microplates	Corning	3595	size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom
Accutase	Euroclone	ECB3056D	solution for neurosphere dissociation
Burker chamber	Mv medical	FFL16034	cell counting chamber
CD-44 (156-3C11)	Cell Signaling Technology	3570	Mouse mAb IgG2a
Corning Matrigel Matrix	Corning	356237	Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free
Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye	Incucyte	4743	Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry
Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	-	The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.
Inverted Microscope		-	any inverted microscope
Opti-Green Background Suppressor Reagent	Incucyte	6500-0045	Backgroung suppressor reagent (BSR)
Tumor stem cell (TSM) medium	-	-	growth cell medium (see reference in the text for details)
Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Corning Costar	7007	size 96 well, round bottom clear