Ensayos de inmunocitoquímica de células 3D vivas del glioma difuso de línea media infantil

Resumen

Este estudio presenta un protocolo de inmunocitoquímica de células vivas en 3D aplicado a una línea celular de glioma difuso de línea media pediátrico, útil para estudiar en tiempo real la expresión de proteínas en la membrana plasmática durante procesos dinámicos como la invasión y migración de células 3D.

Resumen

La migración celular y la invasión son características distintivas específicas de los tumores con mutación H3K27M en glioma difuso de línea media (DMG). Ya hemos modelado estas características utilizando ensayos tridimensionales (3D) de invasión y migración basados en células. En este estudio, hemos optimizado estos ensayos 3D para la inmunocitoquímica de células vivas. Se utilizó un reactivo de marcaje de anticuerpos para detectar en tiempo real la expresión de la molécula de adhesión CD44, en la membrana plasmática de células migratorias e invasoras de una línea celular primaria derivada del paciente DMG H3K27M. CD44 se asocia con el fenotipo de las células madre cancerosas y la migración e invasión de células tumorales y está involucrado en las interacciones directas con la matriz extracelular del sistema nervioso central (SNC). Las neuroesferas (NS) de la línea celular DMG H3K27M se incrustaron en la matriz de la membrana basal (BMM) o se colocaron sobre una capa delgada de BMM, en presencia de un anticuerpo anti-CD44 junto con el reactivo de marcaje de anticuerpos (ALR). El análisis de imágenes de inmunocitoquímica de células vivas en 3D se realizó en un instrumento de análisis de células vivas para medir cuantitativamente la expresión general de CD44, específicamente en las células migratorias e invasoras. El método también permite visualizar en tiempo real la expresión intermitente de CD44 en la membrana plasmática de las células migratorias e invasoras. Además, el ensayo también proporcionó nuevos conocimientos sobre el papel potencial de CD44 en la transición mesenquimal a ameboide en células DMG H3K27M.

Introducción

La capacidad de las células tumorales para evadir y diseminarse a través del tejido circundante es un sello distintivo^{del cáncer.} En particular, la motilidad de las células tumorales es un rasgo característico de los tumores malignos, ya sea un tipo de tumor metastásico como el cáncer de mama² o colorrectal³ o un tipo localmente invasivo como el glioma difuso ^4,5.

Las imágenes tienen un papel central en la investigación de muchos aspectos de los fenotipos de las células tumorales; Sin embargo, la obtención de imágenes de células vivas es definitivamente preferible cuando se estudian procesos celulares dinámicos como la migración y la invasión, cuando se producen cambios en la morfología y la interacción célula-célula ^6,7 y pueden examinarse más fácilmente a lo largo del tiempo. Para la obtención de imágenes de células vivas, se pueden utilizar diferentes sistemas de microscopía óptica, desde el contraste de fase hasta los microscopios fluorescentes confocal, y la adquisición de imágenes realizada durante un corto o largo período de tiempo en un microscopio invertido equipado con una cámara para el control de la temperatura y el_CO2, o en sistemas de análisis de imágenes de alto contenido que tienen cámaras incorporadas, o alternativamente en sistemas de imágenes que pueden permanecer en la incubadora sin necesidad de perturbar las células durante toda la duración del experimento. La elección del sistema utilizado suele estar dictada por una serie de factores, como la resolución necesaria, la duración del tiempo total de adquisición y los intervalos de tiempo, el tipo de recipiente utilizado y el rendimiento del ensayo (cámara única o placa de pocillos múltiples), la sensibilidad de las células utilizadas (células preciosas y/o raras) y la fototoxicidad de las células si hay fluoróforos presentes.

Con respecto a las imágenes fluorescentes en modo vivo, esto puede lograrse mediante la transducción de células para la expresión de proteínas fluorescentes, ya sea para una expresión estable o como un sistema inducible⁸, mediante la transfección celular transitoria o mediante el uso de colorantes celulares que ahora están disponibles para el marcaje de células vivas⁷, para el seguimiento de células vivas y para el etiquetado de orgánulos subcelulares⁹.

Recientemente se ha desarrollado un enfoque útil para la inmunocitoquímica de células vivas, en el que un anticuerpo que reconoce un marcador de superficie de elección puede unirse a un reactivo de marcaje y, al agregarlo al medio de cultivo, las células que expresan el marcador específico pueden obtener imágenes fácilmente en tiempo real mediante imágenes de células vivas. La visualización y cuantificación de la expresión de marcadores utilizando un sistema de este tipo puede lograrse fácilmente cuando las células se cultivan en condiciones de cultivo bidimensionales (2D)¹⁰.

En este estudio, optimizamos los protocolos para la invasión inmunocitoquímica de células vivas en 3D y la migración de células derivadas de pacientes con glioma difuso difuso de línea media (DMG) pediátrico^11,12. Los DMG son tumores cerebrales altamente agresivos que afectan a los niños, en su gran mayoría asociados con la mutación conductora K27M en las variantes de la histona H3. Los DMG surgen en el tronco encefálico y en las regiones de la línea media del sistema nervioso central (SNC) y se caracterizan por una naturaleza altamente infiltrativa. Se ha demostrado que esta capacidad invasiva está, al menos en parte, mediada por la heterogeneidad intratumoral y las características similares a las de las células madre cancerosas de las células DMG⁷.

Para ejemplificar nuestros ensayos, se utilizó un reactivo de marcado de anticuerpos (ALR) en combinación con un anticuerpo para CD44. CD44 es una glicoproteína transmembrana y una molécula de adhesión expresada en células madre y otros tipos de células, asociada con el fenotipo de células madre cancerosas y la migración e invasión de células tumorales¹³. Los protocolos incluyen la preparación de la muestra, la adquisición de imágenes en modo de campo claro y fluorescente, y el análisis en un instrumento de análisis de células vivas que permitió medir cuantitativamente en tiempo real la expresión global de CD44 en la membrana celular de DMG durante la invasión y migración 3D. Los ensayos también permitieron visualizar la señal fluorescente intermitente de CD44 en células individuales mientras migran e invaden. Curiosamente, también se observó un efecto del anticuerpo anti-CD44, que potencialmente actuando como un anticuerpo bloqueador, también pareció reducir la migración e invasión celular, así como inducir un cambio en el patrón de invasión de un fenotipo colectivo de tipo mesenquimal a un fenotipo más similar al amebo de una sola célula.

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices de los comités de ética en investigación en humanos de las instituciones.

NOTA: Este estudio se realizó utilizando el instrumento de análisis de células vivas Incucyte S3 y/o SX5 (referenciado como instrumento de análisis de células vivas).

1. Generación de esferoides tumorales de tamaño reproducible

NOTA: Se utilizó el protocolo (sección 1) descrito por Vinci et al. 2015 ^7,12, como se informa a continuación, con algunas modificaciones:

1. Recoja las neuroesferas (NS) mutantes DMG H3K27M y centrifugue a 170 x g durante 10 minutos (min) a temperatura ambiente (RT).
2. Incubar los SN con 500 μL de la solución de accutasa durante 3 min a 37 °C para romperlos.
3. Neutralizar la solución de acutasa con medio de células madre tumorales (TSM)⁷ y centrifugar la suspensión celular a 355 x g durante 5 min a RT.
4. Vuelva a suspender el gránulo de células en 1 ml de medio TSM y luego cuente las células utilizando una cámara de recuento de células.
5. Diluir la suspensión celular para obtener 2,5-5 x 10³células/mL y sembrar 100 μL/pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos de fijación ultrabaja (ULA) (ver Tabla de Materiales). Utilice una densidad celular adecuada para obtener un NS individual de ~300 μm de diámetro, 4 días después de la siembra celular (250-500 células/pocillo para células de glioma altamente agresivas).
6. Confirmar visualmente la formación de NS utilizando un microscopio invertido 4 días después de la siembra celular.

2. Preparación del complejo ALR/anticuerpo y configuración para el ensayo de invasión

NOTA: Para el procedimiento de marcaje de anticuerpos, se utiliza el protocolo¹⁰ de colorantes de marcaje de anticuerpos para inmunocitoquímica de células vivas con algunas modificaciones, como se informa a continuación. Para el ensayo de invasión, se sigue el protocolo previamente descrito por Vinci et al. 2015¹² .

1. Considere el número de pocillos (por ejemplo, 60 pocillos) para analizar y calcular el volumen necesario para cada reactivo. Incluir también los pocillos para el control negativo (muestras con ALR pero sin anticuerpos).
2. Añadir 100 μL de agua estéril al ALR para rehidratar el reactivo (concentración final = 0,5 mg/mL). Pipetear para mezclar la solución.
   NOTA: El reactivo es sensible a la luz; por lo tanto, manténgase en la oscuridad. Alicuar el reactivo sobrante y almacenar a -80 °C (evitar la congelación y descongelación).
3. Mezcle el anticuerpo con el ALR en el medio TSM (o en el medio de crecimiento celular apropiado para la línea celular de elección) en una placa de pocillos múltiples de fondo redondo o en un tubo ámbar y protéjalo de la luz.
4. Prepare una cantidad suficiente del medio para dispensar 25 μL/pocillo a una concentración final de ensayo de 3x. Incubar en RT durante 15 min.
   NOTA: Se recomienda una relación molar de 1:3 entre el anticuerpo y la ALR, con una concentración final (1x) del anticuerpo de prueba <1,5 μg/ml. Para los experimentos de este protocolo se utiliza un anticuerpo de ratón CD44 antihumano (concentración inicial de 86 μg/mL) a una concentración final de 0,1 μg/mL (concentración 3x = 0,3 μg/mL). Agregue los reactivos en el siguiente orden: i) anticuerpo; ii) ALR; iii) Medio TSM. Mezclar por pipeteo.
5. Diluir el reactivo supresor de fondo (BSR) en medio TSM (o medio de crecimiento celular apropiado para la línea celular de elección) a 1,5 mM (3x) para obtener al final del ensayo una concentración final de 0,5 mM.
6. Realice el ensayo de invasión directamente en la placa de fondo redondo ULA de 96 pocillos donde se sembraron inicialmente las células. Compruebe visualmente el SN con un microscopio invertido antes de empezar.
7. Retire suave y lentamente 75 μL/pocillo del medio, evitando tocar el fondo del pocillo donde se asienta el SN. Compruebe visualmente la presencia del SN.
8. Agregue suavemente 25 μL de BSR a cada pocillo.
9. Agregue suavemente 25 μL del complejo ALR/anticuerpo a cada pocillo. Espere 2 o 3 minutos para que el complejo ALR/anticuerpo se mezcle con el medio.
10. Verifique visualmente con un microscopio invertido para asegurarse de que cada NS esté ubicado en el centro del fondo del pozo. Evitar la formación de burbujas. Si hay alguna burbuja, retírela con una aguja.
11. Coloque el plato sobre hielo y espere 5 minutos para que el fondo del plato se enfríe.
12. Con una punta p200 preenfriada, dispense 75 μL/pocillo de matriz de membrana basal (BMM), colocando la punta de pipeta en la pared interna del pocillo y evitando tocar el fondo del pocillo. Evite la formación de burbujas y retire con una aguja estéril las existentes.
    NOTA: Asegúrese de haber descongelado el BMM a 4 °C desde la noche anterior.
13. Deje la placa en hielo durante 5 minutos para que el BMM se mezcle con el medio. Compruebe visualmente con un microscopio invertido la presencia de los SN y que estén situados en el centro del pocillo. Si no es así, centrifugar la placa a 4 °C a 180 x g durante 5 min.
14. Transfiera la placa en el instrumento de análisis de células vivas (Tabla de materiales) colocado dentro de la incubadora a 37 °C, 5% CO₂, 95% de humedad.

3. Preparación del complejo ALR/anticuerpo y configuración para el ensayo de migración

NOTA: Para el procedimiento de marcaje de anticuerpos, se utiliza el protocolo¹⁰ de colorantes de marcaje para inmunocitoquímica de células vivas.

1. Considere el número de pocillos a analizar y calcule el volumen necesario para cada reactivo. Incluya también los pocillos necesarios para los controles negativos. Compruebe visualmente el SN con un microscopio invertido antes de empezar.
2. Utilice placas de fondo plano de 96 pocillos. Realice el procedimiento de recubrimiento como lo describe Vinci et al., 2013¹⁴. Para este estudio, el BMM se utiliza como una capa delgada.
3. Una vez que el recubrimiento esté listo, retire el exceso de recubrimiento BMM con una punta p200 colocando la punta en el borde del pozo y evitando tocar el fondo. Si trabaja con varios pocillos, utilice una pipeta multicanal.
4. Corte una punta p200, tome 50 μL del medio celular + NS de cada pocillo seleccionado y transfiéralo a un pocillo de fondo plano recubierto. Verifique visualmente la presencia y la posición del NS en cada pozo.
   NOTA: Cada NS debe estar ubicado en el centro del pozo. Evite apoyarse en la punta en el borde del pozo durante la transferencia, pero deje caer el medio en el centro del pozo sin tocar el fondo. En el caso de las células altamente migratorias, considere un número mayor de réplicas que las tres réplicas estándar. Esto se debe a que cuando NS se encuentra demasiado cerca del borde del pocillo, las células migratorias pueden cubrir un área más pequeña del pocillo.
5. Rehidrate el ALR como se ha descrito anteriormente (pasos 2.2-2.3).
   NOTA: El reactivo es sensible a la luz. Consulte más arriba para conocer los procedimientos de buena manipulación.
6. Mezcle el anticuerpo con ALR en el medio de crecimiento celular completo apropiado en una placa de pocillos múltiples de fondo redondo o en un tubo ámbar y protéjalo de la luz. Prepare una cantidad suficiente para dispensar 50 μL/pocillo a una concentración final de ensayo 3x. Incubar en RT durante 15 min.
   NOTA: Agregue los reactivos en el orden indicado anteriormente (paso 2.4).
7. Siga el mismo procedimiento que se indica en el paso 2.5.
8. Agregue suavemente 50 μL de BSR a cada pocillo.
9. Agregue suavemente 50 μL de ALR/anticuerpo a cada pocillo. Espere 2 o 3 minutos para que los reactivos se mezclen y verifique visualmente con un microscopio invertido para asegurarse de que la mayoría de los SN replicados estén ubicados en el centro del pocillo.
10. Evite la formación de burbujas y elimine las existentes con una aguja. Transfiera suavemente la placa en el instrumento de análisis de células vivas colocado dentro de la incubadora a 37 °C, 5% CO₂, 95% de humedad.

4. Configuración del instrumento de análisis de células vivas para la adquisición de imágenes

1. Escanee las placas utilizando el instrumento de análisis de células vivas (para ver las especificaciones, consulte la Tabla de materiales) con intervalos de escaneo a partir del punto de tiempo cero (t0) de los ensayos de invasión y migración establecidos, respectivamente, después del paso 2.14. y 3.10. hasta 96 h.
   NOTA: Asegúrese de poder desechar el instrumento de análisis de células vivas inmediatamente después del inicio del ensayo de invasión y migración. Dependiendo del tipo de tumor, las células pueden comenzar a invadir o migrar desde el SN dentro de 1 h desde la configuración del ensayo.
2. En el software del instrumento de análisis de células vivas, seleccione la opción Programar para adquirir. Haga clic en la pestaña + y seleccione la opción Escanear en programación.
3. En la ventana del software Crear o restaurar recipiente, haga clic en la opción Nuevo.
4. Seleccione la aplicación específica en el instrumento de análisis de células vivas para la adquisición de invasión y migración. Seleccione el tipo de escaneo esferoide , el objetivo 4x, los canales de imagen de fase + campo claro y verde para el ensayo de invasión. Seleccione el tipo de escaneo de clonación por dilución , el objetivo 4x y la fase y el verde para el ensayo de migración.
5. Seleccione el tipo de placa y defina los pozos que se van a escanear resaltándolos en el mapa de placas.
6. Configure la frecuencia de escaneo (para los experimentos en este protocolo, la frecuencia de escaneo fue de 15 min para la invasión y 30 min para la migración).
7. Haga clic en Agregar a la programación e inicie el escaneo.

5. Configuración del instrumento de análisis de células vivas para el análisis de imágenes

1. Seleccione la pestaña Crear nueva definición de análisis.
2. Seleccione Spheroid Invasion o Basic Analyzer application for invasion and migration, respectivamente, en la pestaña.
3. Seleccione los canales apropiados para la invasión y la migración (para Invasión: Fase+Campo claro-Verde; para Migración: Fase-Verde) en el canal de imagen.
4. Seleccione algunas imágenes representativas de 3-4 pocillos para obtener una vista previa y refinar la configuración del análisis.
5. Para el ensayo de invasión, en la pestaña Definición de análisis , ajuste la configuración de la aplicación en los canales Campo claro y Verde con la siguiente configuración para generar una segmentación precisa entre el esferoide completo y las células invasoras (consulte la Figura 5; máscara azul):
   Segmentación de campo claro: Sensibilidad del esferoide completo = 50; Sensibilidad de las células invasoras = 100; Limpiar = predeterminado.
   Filtros esferoides completos: establezca todos los parámetros como predeterminados.
   Filtros de celdas invasoras: establece todos los parámetros como predeterminados.
   Segmentación verde: Radio = 900.
6. Para el ensayo de migración, ajuste la configuración de la aplicación en los canales Fase y Verde para generar una segmentación precisa entre las celdas de confluencia y verde (consulte la Figura 5, máscaras amarillas y rosas) con la siguiente configuración:
   Fase: establece todos los parámetros como predeterminados.
   Segmentación verde: Radio = 300; Umbral = 1000
   Limpieza: Relleno de agujeros = 400; Filtros = predeterminado.
   Pozo entero: establece todos los parámetros como predeterminados.
7. Compruebe que la configuración del análisis es correcta para el NS haciendo clic aleatoriamente en varios pozos. La segmentación debe delinear el esferoide. De lo contrario, ajuste la configuración en consecuencia.
8. Seleccione los pozos y los puntos de tiempo que desea analizar.
9. Guarde la definición de análisis y haga clic en Finalizar.

Resultados

El protocolo de inmunocitoquímica de células vivas en 3D para la invasión y la migración se resume en un flujo de trabajo sencillo y reproducible en la Figura 1. Al sembrar las células DMG en placas de fondo redondo ULA de 96 pocillos, se obtienen NS de tamaño reproducible y se utilizan en los pasos que se muestran. Cuando los SN han alcanzado el tamaño ideal de ~300 μm (aproximadamente 4 días después de la siembra) se inician los ensayos de invasión¹² y mi...

Discusión

La inmunocitoquímica de células vivas en 3D que hemos adoptado aquí para la invasión y migración pediátrica de DMG podría adaptarse fácilmente también a otros tipos de células tumorales altamente invasivas, incluidas las líneas celulares de cáncer de mama y colon.

A diferencia de los ensayos de inmunocitoquímica de células vivas 2D realizados anteriormente¹⁰, cuando se trabaja en 3D, se sugiere prestar atención a algunos pasos críticos. En particular, p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well TC-Treated Microplates	Corning	3595	size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom
Accutase	Euroclone	ECB3056D	solution for neurosphere dissociation
Burker chamber	Mv medical	FFL16034	cell counting chamber
CD-44 (156-3C11)	Cell Signaling Technology	3570	Mouse mAb IgG2a
Corning Matrigel Matrix	Corning	356237	Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free
Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye	Incucyte	4743	Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry
Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	-	The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.
Inverted Microscope		-	any inverted microscope
Opti-Green Background Suppressor Reagent	Incucyte	6500-0045	Backgroung suppressor reagent (BSR)
Tumor stem cell (TSM) medium	-	-	growth cell medium (see reference in the text for details)
Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Corning Costar	7007	size 96 well, round bottom clear