Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie-Assays des pädiatrischen diffusen Mittellinienglioms

Zusammenfassung

In dieser Studie wird ein Protokoll der Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie vorgestellt, das auf eine pädiatrische diffuse Mittellinien-Gliomzelllinie angewendet wird, um die Expression von Proteinen auf der Plasmamembran während dynamischer Prozesse wie 3D-Zellinvasion und -migration in Echtzeit zu untersuchen.

Zusammenfassung

Zellmigration und Zellinvasion sind spezifische Kennzeichen von H3K27M-mutierten Tumoren des diffusen Mittellinienglioms (DMG). Wir haben diese Merkmale bereits mit dreidimensionalen (3D) zellbasierten Invasions- und Migrationsassays modelliert. In dieser Studie haben wir diese 3D-Assays für die Immunzytochemie lebender Zellen optimiert. Ein Antikörper-Markierungsreagenz wurde verwendet, um die Expression des Adhäsionsmoleküls CD44 auf der Plasmamembran von migrierenden und eindringenden Zellen einer DMG H3K27M primären Patientenzelllinie in Echtzeit zu detektieren. CD44 ist mit dem Phänotyp von Krebsstammzellen und der Migration und Invasion von Tumorzellen assoziiert und an den direkten Interaktionen mit der extrazellulären Matrix des Zentralnervensystems (ZNS) beteiligt. Neurosphären (NS) aus der DMG H3K27M-Zelllinie wurden in die Basalmembranmatrix (BMM) eingebettet oder in Gegenwart eines Anti-CD44-Antikörpers in Verbindung mit dem Antikörpermarkierungsreagenz (ALR) auf eine dünne Beschichtungsschicht aus BMM aufgebracht. Die immunzytochemische Live-3D-Zellanalyse wurde auf einem Lebendzellanalysegerät durchgeführt, um die gesamte CD44-Expression, insbesondere auf den migrierenden und eindringenden Zellen, quantitativ zu messen. Die Methode ermöglicht es auch, die intermittierende Expression von CD44 auf der Plasmamembran von migrierenden und eindringenden Zellen in Echtzeit zu visualisieren. Darüber hinaus lieferte der Assay auch neue Einblicke in die mögliche Rolle von CD44 beim Übergang von mesenchymal zu amöboid in DMG H3K27M-Zellen.

Einleitung

Die Fähigkeit von Tumorzellen, sich dem umgebenden Gewebe zu entziehen und es zu verbreiten, ist ein Kennzeichen von Krebs¹. Insbesondere die Tumorzellmotilität ist ein charakteristisches Merkmal maligner Tumoren, unabhängig davon, ob es sich um einen metastasierten Tumortyp wie Brust² oder Darmkrebs³ oder einen lokal invasiven Typ wie das diffuse Gliom^{handelt 4,5}.

Die Bildgebung spielt eine zentrale Rolle bei der Untersuchung vieler Aspekte von Tumorzellphänotypen; Bei der Untersuchung dynamischer zellulärer Prozesse wie Migration und Invasion ist jedoch die Bildgebung lebender Zellen definitiv zu bevorzugen, wenn Veränderungen in der Morphologie und der Zell-Zell-Interaktion auftreten ^6,7 und im Laufe der Zeit leichter untersucht werden können. Für die Bildgebung lebender Zellen können verschiedene optische Mikroskopiesysteme verwendet werden, vom Phasenkontrastmikroskop bis zum konfokalen Fluoreszenzmikroskop, und die Bildaufnahme über einen kurzen oder langen Zeitraum auf einem inversen Mikroskop, das mit einer Kammer zur Temperatur- und CO₂ -Kontrolle ausgestattet ist, oder in High-Content-Bildanalysesystemen mit eingebauten Kammern oder alternativ in Bildsystemen, die im Inkubator sitzen können, ohne dass die Zellen während der gesamten Dauer gestört werden müssen des Experiments. Die Wahl des verwendeten Systems wird häufig von einer Reihe von Faktoren bestimmt, wie z. B. der erforderlichen Auflösung, der Länge der Gesamterfassungszeit und der Zeitintervalle, dem verwendeten Gefäßtyp und dem Durchsatz des Assays (Einkammer- oder Multi-Well-Platte), der Empfindlichkeit der verwendeten Zellen (Edel- und/oder seltene Zellen) und der Phototoxizität der Zellen, wenn Fluorophore vorhanden sind.

Im Hinblick auf die Fluoreszenzbildgebung im Live-Modus kann dies erreicht werden, indem Zellen für die Expression fluoreszierender Proteine entweder für eine stabile Expression oder als induzierbares System⁸ transduzierbar gemacht werden, durch transiente Zelltransfektion oder durch die Verwendung von Zellfarbstoffen, die jetzt für die Markierung lebender Zellen⁷, für die Verfolgung lebender Zellen sowie für die Markierung subzellulärer Organellen⁹ zur Verfügung stehen.

Kürzlich wurde ein nützlicher Ansatz für die Immunzytochemie lebender Zellen entwickelt, bei dem ein Antikörper, der einen Oberflächenmarker der Wahl erkennt, an ein Markierungsreagenz gebunden werden kann, und nach Zugabe zu den Kulturmedien können Zellen, die den spezifischen Marker exprimieren, leicht in Echtzeit durch Lebendzell-Bildgebung abgebildet werden. Die Visualisierung und Quantifizierung der Markerexpression unter Verwendung eines solchen Systems kann leicht erreicht werden, wenn Zellen unter zweidimensionalen (2D) Kulturbedingungen gezüchtet werden¹⁰.

In dieser Studie haben wir Protokolle für die Invasion und Migration von pädiatrischen diffusen Mittelliniengliomen (DMG)-Patientenzellen optimiert^11,12. DMG sind hochaggressive Hirntumoren, die Kinder betreffen und in der überwiegenden Mehrheit mit der Treibermutation K27M in Histon-H3-Varianten assoziiert sind. DMG entstehen im Hirnstamm und in den Mittellinienregionen des Zentralnervensystems (ZNS) und zeichnen sich durch eine stark infiltrative Natur aus. Es wurde gezeigt, dass diese invasive Fähigkeit zumindest teilweise durch die intratumorale Heterogenität und die krebsstammähnlichen Merkmale von DMG-Zellen vermittelt wird⁷.

Zur Veranschaulichung unserer Assays wurde ein Antikörpermarkierungsreagenz (ALR) in Kombination mit einem Antikörper gegen CD44 verwendet. CD44 ist ein Transmembran-Glykoprotein und Adhäsionsmolekül, das auf Stammzellen und anderen Zelltypen exprimiert wird und mit dem Phänotyp von Krebsstammzellen und der Migration und Invasion von Tumorzellen assoziiert^{ist 13}. Die Protokolle umfassen die Probenvorbereitung, die Bildaufnahme im Hellfeld- und Fluoreszenzmodus und die Analyse auf einem Lebendzellanalysegerät, das es ermöglichte, die gesamte CD44-Expression auf der DMG-Zellmembran während der 3D-Invasion und -Migration quantitativ in Echtzeit zu messen. Die Assays ermöglichten auch die Möglichkeit, das intermittierende Fluoreszenzsignal von CD44 auf einzelnen Zellen während der Migration und Invasion sichtbar zu machen. Interessanterweise wurde auch ein Effekt des Anti-CD44-Antikörpers beobachtet, der möglicherweise als blockierender Antikörper fungiert und auch die Zellmigration und -invasion zu reduzieren schien und einen Wechsel des Invasionsmusters von einem kollektiven mesenchymalartigen zu einem eher einzelligen amöbenartigen Phänotyp zu induzieren schien.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommissionen der Institutionen für die Humanforschung.

HINWEIS: Diese Studie wurde mit dem Incucyte S3 und/oder SX5 Lebendzellanalysegerät (als Lebendzellanalysegerät bezeichnet) durchgeführt.

1. Generierung von reproduzierbar großen Tumorsphäroiden

HINWEIS: Das von Vinci et al. 2015 ^7,12 beschriebene Protokoll (Abschnitt 1) wurde wie folgt verwendet, mit einigen Modifikationen:

1. Die DMG H3K27M-mutierten Neurosphären (NS) werden gesammelt und bei 170 x g für 10 Minuten (min) bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert.
2. Die NS werden mit 500 μl der Accutase-Lösung für 3 min bei 37 °C inkubiert, um sie aufzubrechen.
3. Neutralisieren Sie die Accutase-Lösung mit Tumorstammzellmedium (TSM)⁷ und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 355 x g für 5 min bei RT.
4. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml TSM-Medium und zählen Sie dann die Zellen in einer Zellzählkammer.
5. Verdünnen Sie die Zellsuspension, um 2,5-5 x 10³Zellen/ml zu erhalten, und säen Sie 100 μl/Well in 96-Well-Platten mit rundem Boden (ULA) ein (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie eine geeignete Zelldichte, um 4 Tage nach der Zellaussaat eine individuelle NS von ~300 μm Durchmesser zu erhalten (250-500 Zellen/Well für hochaggressive Gliomzellen).
6. Visuelle Bestätigung der NS-Bildung mit einem inversen Mikroskop 4 Tage nach der Zellaussaat.

2. Herstellung des ALR/Antikörper-Komplexes und Aufbau für den Invasionsassay

HINWEIS: Für das Antikörpermarkierungsverfahren wird das Antikörpermarkierungsfarbstoffprotokoll¹⁰ für die Immunzytochemie lebender Zellen mit einigen Modifikationen verwendet, wie unten beschrieben. Für den Invasionsassay wird das zuvor von Vinci et al. 2015¹² beschriebene Protokoll befolgt.

1. Berücksichtigen Sie die Anzahl der Wells (z. B. 60 Wells), um das für jedes Reagenz benötigte Volumen zu analysieren und zu berechnen. Beziehen Sie auch die Vertiefungen für die Negativkontrolle mit ein (Proben mit ALR, aber ohne Antikörper).
2. Geben Sie 100 μl steriles Wasser in den ALR, um das Reagenz zu rehydrieren (Endkonzentration = 0,5 mg/ml). Pipetten, um die Lösung zu mischen.
   HINWEIS: Das Reagenz ist lichtempfindlich; Halten Sie sich daher im Dunkeln. Aliquotieren Sie das übrig gebliebene Reagenz und lagern Sie es bei -80 °C (Einfrieren und Auftauen vermeiden).
3. Mischen Sie den Antikörper mit dem ALR im TSM-Medium (oder einem geeigneten Zellwachstumsmedium für die Zelllinie Ihrer Wahl) in einer Multiwell-Platte mit rundem Boden oder in einem bernsteinfarbenen Röhrchen und schützen Sie es vor Licht.
4. Bereiten Sie eine ausreichende Menge des Mediums vor, um 25 μl/Well bei der 3-fachen Endkonzentration des Assays abzugeben. 15 Minuten bei RT inkubieren.
   HINWEIS: Es wird ein molares Verhältnis von 1:3 von Antikörper zu ALR empfohlen, mit einer Endkonzentration (1x) des Testantikörpers <1,5 μg/ml. Für die Experimente in diesem Protokoll wird ein Anti-Human-CD44-Maus-Antikörper (Ausgangskonzentration 86 μg/ml) in einer Endkonzentration von 0,1 μg/ml (3-fache Konzentration = 0,3 μg/ml) verwendet. Fügen Sie die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge hinzu: i) Antikörper; ii) ALR; iii) TSM-Medium. Durch Pipettieren mischen.
5. Verdünnen Sie das Hintergrundsuppressor-Reagenz (BSR) in TSM-Medium (oder geeignetem Zellwachstumsmedium für die Zelllinie Ihrer Wahl) bei 1,5 mM (3x), um am Ende des Assays eine Endkonzentration von 0,5 mM zu erhalten.
6. Führen Sie den Invasionsassay direkt in der ULA 96-Well-Platte mit rundem Boden durch, auf der die Zellen ursprünglich ausgesät wurden. Überprüfen Sie den NS visuell mit einem inversen Mikroskop, bevor Sie beginnen.
7. Entfernen Sie vorsichtig und langsam 75 μl/Vertiefung des Mediums und vermeiden Sie es, den Boden der Vertiefung zu berühren, in der sich der NS befindet. Prüfen Sie das Vorhandensein des NS visuell.
8. Geben Sie vorsichtig 25 μl BSR in jede Vertiefung.
9. Geben Sie vorsichtig 25 μl des ALR/Antikörper-Komplexes in jede Vertiefung. Warten Sie 2 oder 3 Minuten, damit sich der ALR/Antikörper-Komplex mit dem Medium vermischt.
10. Überprüfen Sie visuell mit einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich jeder NS zentral am Boden des Brunnens befindet. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Wenn eine Blase vorhanden ist, entfernen Sie sie mit einer Nadel.
11. Den Teller auf Eis legen und 5 Minuten warten, bis der Boden des Tellers kalt wird.
12. Geben Sie mit einer vorgekühlten p200-Spitze 75 μl/Well Basalmembranmatrix (BMM) ab, indem Sie die Pipettenspitze auf die Innenwand des Wells setzen und den Boden des Wells nicht berühren. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen und entfernen Sie die vorhandenen mit einer sterilen Nadel.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie den BMM am Vorabend bei 4 °C aufgetaut haben.
13. Lassen Sie die Platte 5 Minuten lang auf Eis, damit sich das BMM mit dem Medium vermischen kann. Prüfen Sie visuell mit einem inversen Mikroskop, ob die NS vorhanden sind und ob sie sich zentral im Brunnen befinden. Ist dies nicht der Fall, zentrifugieren Sie die Platte bei 4 °C bei 180 x g für 5 min.
14. Die Platte wird in das Lebendzellanalysegerät (Materialtabelle) im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit überführt.

3. Herstellung des ALR/Antikörper-Komplexes und Aufbau für den Migrationsassay

HINWEIS: Für die Antikörpermarkierung wird das Markierungsfarbstoffprotokoll¹⁰ für die Lebendzell-Immunzytochemie verwendet.

1. Berücksichtigen Sie die Anzahl der zu analysierenden Wells und berechnen Sie das Volumen, das für jedes Reagenz benötigt wird. Fügen Sie auch die Vertiefungen hinzu, die für die Negativkontrollen benötigt werden. Überprüfen Sie den NS visuell mit einem inversen Mikroskop, bevor Sie beginnen.
2. Verwenden Sie 96-Well-Platten mit flachem Boden. Führen Sie das Beschichtungsverfahren durch, wie von Vinci et al., 2013¹⁴ beschrieben. Für diese Studie wird das BMM als dünne Schicht verwendet.
3. Sobald die Beschichtung fertig ist, entfernen Sie den Überschuss der BMM-Beschichtung mit einer p200-Spitze, indem Sie die Spitze in den Rand der Vertiefung stecken und den Boden nicht berühren. Wenn Sie mit mehreren Wells arbeiten, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette.
4. Schneiden Sie eine p200-Spitze ab, entnehmen Sie 50 μl des Zellmediums + NS aus jeder ausgewählten Vertiefung und geben Sie sie in eine beschichtete Vertiefung mit flachem Boden. Überprüfen Sie das Vorhandensein und die Position des NS in jeder Vertiefung visuell.
   HINWEIS: Jeder NS muss sich zentral im Brunnen befinden. Vermeiden Sie es, sich während des Transfers auf die Spitze am Rand der Vertiefung zu stützen, sondern lassen Sie das Medium mittig in die Vertiefung fallen, ohne den Boden zu berühren. Für stark migrierende Zellen sollten Sie eine höhere Anzahl von Replikaten als die standardmäßigen drei Replikate in Betracht ziehen. Dies liegt daran, dass die migrierenden Zellen einen kleineren Bereich des Wells bedecken können, wenn NS zu nah am Rand des Wells sitzt.
5. Rehydrieren Sie den ALR wie oben beschrieben (Schritte 2.2-2.3).
   HINWEIS: Das Reagenz ist lichtempfindlich. Siehe oben für gute Handhabungsverfahren.
6. Mischen Sie den Antikörper mit ALR in den entsprechenden vollständigen Zellwachstumsmedien in einer Multiwell-Platte mit rundem Boden oder in einem braunen Röhrchen und schützen Sie es vor Licht. Bereiten Sie eine ausreichende Menge vor, um 50 μl/Well bei 3-facher Endkonzentration des Assays abzugeben. 15 Minuten bei RT inkubieren.
   HINWEIS: Fügen Sie die Reagenzien in der oben angegebenen Reihenfolge hinzu (Schritt 2.4).
7. Gehen Sie wie in Schritt 2.5 beschrieben vor.
8. Geben Sie vorsichtig 50 μl BSR in jede Vertiefung.
9. Geben Sie vorsichtig 50 μl des ALR/Antikörpers in jede Vertiefung. Warten Sie 2 oder 3 Minuten, bis sich die Reagenzien vermischen, und überprüfen Sie dies visuell mit einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich die meisten replizierten NS zentral in der Vertiefung befinden.
10. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen und entfernen Sie vorhandene Blasen mit einer Nadel. Die Platte wird vorsichtig in das Lebendzellanalysegerät im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit überführt.

4. Einstellung des Live-Cell-Analysegeräts für die Bildaufnahme

1. Scannen Sie die Platten mit dem Lebendzellanalysegerät (Spezifikationen siehe Materialtabelle) mit Scanintervallen, beginnend mit dem Zeitpunkt Null (t0) der Invasions- bzw. Migrationsassays, die nach Schritt 2.14 eingerichtet wurden. und 3.10. bis zu 96 h.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Lebendzellanalysegerät sofort nach Beginn des Invasions- und Migrationstests entsorgt werden kann. Je nach Tumortyp können Zellen bereits innerhalb von 1 h nach dem Assay-Aufbau in den NS eindringen oder aus ihm migrieren.
2. Wählen Sie in der Software des Live-Cell-Analysegeräts die Option Schedule to Acquisition (Erfassen planen) aus. Klicken Sie auf die Registerkarte + und wählen Sie die Option Scan nach Zeitplan.
3. Klicken Sie im Softwarefenster Vessel erstellen oder wiederherstellen auf die Option Neu.
4. Wählen Sie die spezifische Anwendung im Lebendzellanalysegerät für die Invasions- und Migrationserfassung aus. Wählen Sie den Sphäroid-Scan-Typ , das 4x-Objektiv, Phase+Hellfeld und die grünen Bildkanäle für den Invasionsassay aus. Wählen Sie den Scantyp Verdünnungsklonierung , 4x-Objektiv und Phase und Grün für den Migrationsassay aus.
5. Wählen Sie den Plattentyp aus und definieren Sie die zu scannenden Wells, indem Sie sie auf der Plattenkarte markieren.
6. Richten Sie die Scanfrequenz ein (für die Experimente in diesem Protokoll betrug die Scanfrequenz 15 Minuten für die Invasion und 30 Minuten für die Migration).
7. Klicken Sie auf Zum Zeitplan hinzufügen und starten Sie den Scan.

5. Einstellung des Live-Cell-Analysegeräts für die Bildanalyse

1. Wählen Sie den Reiter Neue Analysedefinition anlegen.
2. Wählen Sie auf der Registerkarte Spheroid Invasion oder Basic Analyzer für die Invasion bzw. Migration aus.
3. Wählen Sie die für die Invasion und Migration geeigneten Kanäle (für Invasion: Phase+Hellfeld-Grün; für Migration: Phase-Grün) im Bildkanal aus.
4. Wählen Sie einige repräsentative Bilder aus 3-4 Vertiefungen aus, um eine Vorschau anzuzeigen und die Analyseeinstellung zu verfeinern.
5. Passen Sie für den Invasionsassay auf der Registerkarte Analysedefinition die Anwendungseinstellungen in den Kanälen Hellfeld und Grün mit der folgenden Einstellung an, um eine präzise Segmentierung zwischen dem gesamten Sphäroid und den eindringenden Zellen zu erzeugen (siehe Abbildung 5; blaue Maske):
   Hellfeld-Segmentierung: Empfindlichkeit des gesamten Sphäroids = 50; Empfindlichkeit für eindringende Zellen = 100; Bereinigen = Standard.
   Ganze Sphäroidfilter: Setzt alle Parameter als Standard.
   Filter für eindringende Zellen: Setzen Sie alle Parameter als Standard.
   Grüne Segmentierung: Radius = 900.
6. Passen Sie für den Migrationsassay die Anwendungseinstellungen in den Kanälen Phase und Grün an, um eine präzise Segmentierung zwischen den Confluence- und Green Cells (siehe Abbildung 5, gelbe und rosa Masken) mit der folgenden Einstellung zu erzeugen:
   Phase: Setzen Sie alle Parameter als Standard.
   Grüne Segmentierung: Radius = 300; Schwellenwert = 1000
   Bereinigung: Lochfüllung = 400; Filter = Standard.
   Whole Well: Setzen Sie alle Parameter als Standard.
7. Überprüfen Sie, ob die Analyseeinstellungen für den NS korrekt sind, indem Sie zufällig auf mehrere Vertiefungen klicken. Die Segmentierung muss das Sphäroid umreißen. Ist dies nicht der Fall, passen Sie die Einstellung entsprechend an.
8. Wählen Sie die zu analysierenden Vertiefungen und Zeitpunkte aus.
9. Speichern Sie die Analysedefinition und klicken Sie auf Fertig stellen.

Ergebnisse

Das Live-3D-Zell-Immunzytochemie-Protokoll für Invasion und Migration ist in einem einfachen und reproduzierbaren Arbeitsablauf in Abbildung 1 zusammengefasst. Durch die Aussaat der DMG-Zellen in ULA 96-Well-Rundbodenplatten werden reproduzierbare NS erhalten und in den gezeigten Schritten verwendet. Wenn die NS die ideale Größe von ~300 μm erreicht haben (ca. 4 Tage nach der Aussaat), werden die Assays für Invasion¹² und Migration¹⁴ einge...

Diskussion

Die Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie, die wir hier für die pädiatrische DMG-Invasion und -Migration übernommen haben, könnte auch für andere hochinvasive Tumorzelltypen, einschließlich Brust- und Darmkrebszelllinien, leicht angepasst werden.

Anders als bei zuvor durchgeführten Live-2D-Zell-Immunzytochemie-Assays¹⁰ wird bei der Arbeit in 3D empfohlen, auf einige kritische Schritte zu achten. Insbesondere für den von uns beschriebenen Invasionsassay wird empfohlen,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well TC-Treated Microplates	Corning	3595	size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom
Accutase	Euroclone	ECB3056D	solution for neurosphere dissociation
Burker chamber	Mv medical	FFL16034	cell counting chamber
CD-44 (156-3C11)	Cell Signaling Technology	3570	Mouse mAb IgG2a
Corning Matrigel Matrix	Corning	356237	Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free
Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye	Incucyte	4743	Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry
Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	-	The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.
Inverted Microscope		-	any inverted microscope
Opti-Green Background Suppressor Reagent	Incucyte	6500-0045	Backgroung suppressor reagent (BSR)
Tumor stem cell (TSM) medium	-	-	growth cell medium (see reference in the text for details)
Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Corning Costar	7007	size 96 well, round bottom clear