בדיקות אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים של גליומה מפושטת בקו האמצע בילדים

Summary

מחקר זה מציג פרוטוקול של אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים המיושמים על קו תאי גליומה מפוזר בקו האמצע בילדים, שימושי כדי לחקור בזמן אמת את ביטוי החלבונים על קרום הפלזמה במהלך תהליכים דינמיים כמו פלישה ונדידה של תאים תלת-ממדיים.

Abstract

נדידת תאים ופלישה הם סימני היכר ספציפיים של גידולים מוטנטיים מסוג Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M. כבר מידלנו תכונות אלה באמצעות מבחני פלישה והגירה תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) מבוססי תאים. במחקר זה, ביצענו אופטימיזציה של מבחני תלת-ממד אלה עבור אימונוציטוכימיה של תאים חיים. מגיב תיוג נוגדנים שימש כדי לזהות בזמן אמת את הביטוי של מולקולת ההידבקות CD44, על קרום הפלזמה של תאים נודדים ופולשים של קו תאים ראשוני שמקורו בחולה DMG H3K27M. CD44 קשור לפנוטיפ של תאי גזע סרטניים ולנדידה ופלישה של תאי גידול והוא מעורב באינטראקציות ישירות עם המטריצה החוץ תאית של מערכת העצבים המרכזית (CNS). נוירוספרות (NS) מקו התאים DMG H3K27M הוטמעו במטריצת קרום הבסיס (BMM) או הונחו על שכבת ציפוי דקה של BMM, בנוכחות נוגדן אנטי-CD44 בשילוב עם מגיב תיוג נוגדנים (ALR). ניתוח התמונה האימונוציטוכימית של תאים חיים בתלת-ממד בוצע על מכשיר ניתוח תאים חיים כדי למדוד כמותית את ביטוי CD44 הכולל, במיוחד על התאים הנודדים והפולשים. השיטה מאפשרת גם הדמיה בזמן אמת של ביטוי לסירוגין של CD44 על קרום הפלזמה של תאים נודדים ופולשים. יתר על כן, הבדיקה גם סיפקה תובנות חדשות לגבי התפקיד הפוטנציאלי של CD44 במעבר מזנכימלי לאמבואיד בתאי DMG H3K27M.

Introduction

היכולת של תאי הגידול להתחמק ולהתפשט דרך הרקמה שמסביב היא סימן ההיכר של סרטן¹. בפרט, תנועתיות תאי הגידול היא מאפיין אופייני של גידולים ממאירים, בין אם מדובר בסוג גידול גרורתי כגון שד² או סרטן המעי הגס³ או מסוג פולשני מקומי כגון גליומה מפושטת ^4,5.

לדימות תפקיד מרכזי בחקירת היבטים רבים של פנוטיפים של תאי גידול; עם זאת, הדמיה של תאים חיים בהחלט עדיפה כאשר חוקרים תהליכים תאיים דינמיים כגון נדידה ופלישה, כאשר שינויים במורפולוגיה ובאינטראקציה בין תאים ^6,7 מתרחשים וניתן לבחון אותם בקלות רבה יותר לאורך זמן. לצורך דימות תאים חיים ניתן להשתמש במערכות מיקרוסקופיה אופטיות שונות, החל מניגוד פאזה ועד מיקרוסקופים פלואורסצנטיים קונפוקליים, וקליטת תמונה המבוצעת על פני פרק זמן קצר או ארוך במיקרוסקופ הפוך המצויד בתא לבקרת טמפרטורה_ו-CO2, או במערכות ניתוח תמונה בעלות תוכן גבוה בעלות תאים מובנים, או לחילופין במערכות תמונה המסוגלות לשבת באינקובטור ללא צורך להפריע לתאים לאורך כל הזמן של הניסוי. בחירת המערכת בה נעשה שימוש מוכתבת לעיתים קרובות על ידי מספר גורמים כגון הרזולוציה הדרושה, אורך זמן הרכישה הכולל ומרווחי הזמן, סוג כלי הדם המשמש והתפוקה של הבדיקה (תא בודד או צלחת מרובת בארות), רגישות התאים המשמשים (תאים יקרים ו / או נדירים) ופוטוטוקסיות של התאים אם קיימים פלואורופורים.

באשר לדימות פלואורסצנטי במצב חי, ניתן להשיג זאת על ידי התמרת תאים לביטוי חלבונים פלואורסצנטיים או לביטוי יציב או כמערכת אינדוקציה⁸, על ידי התמרה של תאים חולפים, או על ידי שימוש בצבעי תאים הזמינים כעת לסימון תאים חיים⁷, למעקב אחר תאים חיים וכן לתיוג אברונים תת-תאיים⁹.

לאחרונה פותחה גישה שימושית לאימונוציטוכימיה של תאים חיים, שבה נוגדן המזהה סמן פני שטח נבחר יכול להיות קשור למגיב תיוג, ובתוספת מדיה תרבית, תאים המבטאים את הסמן הספציפי יכולים להיות מצולמים בקלות בזמן אמת על ידי הדמיה של תאים חיים. הדמיה וכימות של ביטוי סמן באמצעות מערכת כזו ניתן להשיג בקלות כאשר תאים גדלים בתנאי תרבית דו-ממדית (2D)¹⁰.

במחקר זה, ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקולים לפלישה אימונוציטוכימית של תאים חיים בתלת-ממד והגירה של תאים שמקורם בגליומה מפושטת בקו האמצע בילדים (DMG)^11,12. DMG הם גידולי מוח אגרסיביים מאוד הפוגעים בילדים, עבור רובם המכריע הקשורים למוטציה המניע K27M בגרסאות היסטון H3. DMG מתעוררים בגזע המוח ובאזורי קו האמצע של מערכת העצבים המרכזית (CNS) ומאופיינים באופי חדיר מאוד. יכולת פולשנית זו הוכחה כמתווכת לפחות בחלקה על ידי ההטרוגניות התוך-סרטנית והתכונות דמויות-הגזע הסרטני של תאי DMG⁷.

כדי להדגים את הבדיקות שלנו, נעשה שימוש בריאגנט תיוג נוגדנים (ALR) בשילוב עם נוגדן עבור CD44. CD44 הוא גליקופרוטאין טרנסממברנה ומולקולת היצמדות המתבטאת בתאי גזע ובסוגי תאים אחרים, הקשורים לפנוטיפ של תאי גזע סרטניים ולנדידת תאי גידול ופלישה¹³. הפרוטוקולים כוללים את הכנת הדגימה, רכישת התמונה במצב שדה בהיר ופלואורסצנטי, והניתוח על מכשיר ניתוח תאים חיים שאיפשר למדוד כמותית בזמן אמת את ביטוי CD44 הכולל על קרום תא DMG במהלך פלישה והגירה תלת-ממדית. הבדיקות אפשרו גם את האפשרות לדמיין את האות הפלואורסצנטי לסירוגין של CD44 על תאים בודדים בזמן נדידה ופלישה. מעניין לציין כי נצפתה גם השפעה של נוגדן אנטי-CD44, אשר עשוי לפעול כנוגדן חוסם, נראה גם להפחית נדידת תאים ופלישה, כמו גם לגרום לשינוי של דפוס הפלישה מ mesenchymal קולקטיבי דמוי פנוטיפ דמוי amoeboid תא יחיד יותר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות ועדות האתיקה למחקר אנושי של המוסדות.

הערה: מחקר זה בוצע באמצעות Incucyte S3 ו/או SX5 Live-Cell Analysis Instrument (המכונה מכשיר ניתוח תאים חיים).

1. יצירת ספרואידים סרטניים בגודל שניתן לשכפל

הערה: הפרוטוקול (סעיף 1) שתואר על ידי Vinci et al. 2015 ^7,12, שימש כפי שדווח להלן, עם כמה שינויים:

1. אסוף את הנוירוספרות המוטנטיות DMG H3K27M (NS) והצנטריפוגה במהירות של 170 x גרם למשך 10 דקות (דקות) בטמפרטורת החדר (RT).
2. לדגור את NS עם 500 μL של תמיסת accutase במשך 3 דקות ב 37 ° C כדי לפרק אותם.
3. נטרל את תמיסת האקוטאז עם תא גזע גידולי (TSM) בינוני⁷ וצנטריפוגה את תרחיף התא ב 355 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
4. השהה מחדש את גלולת התא ב -1 מ"ל של מדיום TSM ולאחר מכן ספור את התאים באמצעות תא ספירת תאים.
5. לדלל את תרחיף התא כדי לקבל 2.5-5 x 10³תאים/מ"ל וזרע 100 μL / באר לתוך חיבור נמוך במיוחד (ULA) 96 באר לוחות עגולים למטה (ראה טבלה של חומרים). השתמש בצפיפות תאים נאותה כדי לקבל NS בודד בקוטר ~300 מיקרומטר, 4 ימים לאחר זריעת התאים (250-500 תאים / באר עבור תאי גליומה אגרסיביים מאוד).
6. אשרו ויזואלית את היווצרות NS באמצעות מיקרוסקופ הפוך 4 ימים לאחר זריעת התא.

2. הכנת קומפלקס ALR/נוגדנים והכנה לבדיקת הפלישה

הערה: עבור הליך תיוג נוגדנים, פרוטוקול תיוג נוגדנים¹⁰ עבור אימונוציטוכימיה של תאים חיים משמש עם כמה שינויים, כפי שמדווח להלן. עבור מבחן הפלישה, הפרוטוקול שתואר בעבר על ידי וינצ'י ואחרים^{2015 12} הוא אחריו.

1. שקול את מספר הבארות (למשל, 60 בארות) כדי לנתח ולחשב את הנפח הדרוש לכל מגיב. כלול גם את הבארות עבור הבקרה השלילית (דגימות עם ALR אך ללא נוגדן).
2. הוסף 100 μL של מים סטריליים ל- ALR כדי להחזיר לחות למגיב (ריכוז סופי = 0.5 מ"ג / מ"ל). פיפטה כדי לערבב את הפתרון.
   הערה: המגיב רגיש לאור; לכן, לשמור בחושך. Aliquot מגיב שאריות ולאחסן ב -80 ° C (למנוע הקפאה והפשרה).
3. ערבבו את הנוגדן עם ה-ALR בתווך TSM (או אמצעי גידול תאים מתאים לקו התאים שבחרתם) בצלחת מרובת בארות תחתונה עגולה או בצינור ענבר והגנו מפני אור.
4. הכינו כמות מספקת של המדיום כדי להוציא 25 μL/well בריכוז סופי פי 3. יש לדגור ב-RT למשך 15 דקות.
   הערה: מומלץ יחס מולארי של 1:3 בין נוגדן ל-ALR, עם ריכוז סופי (1x) של נוגדן הבדיקה <1.5 מיקרוגרם/מ"ל. לצורך הניסויים בפרוטוקול זה נעשה שימוש בנוגדן עכבר CD44 אנטי-אנושי (ריכוז התחלתי 86 מק"ג/מ"ל) בריכוז סופי של 0.1 מק"ג/מ"ל (ריכוז פי 3 = 0.3 מק"ג/מ"ל). הוסף את הריאגנטים בסדר הבא: i) נוגדן; ב) אל"ר; iii) מדיום TSM. מערבבים על ידי pipetting.
5. לדלל את מגיב מדכא הרקע (BSR) בתווך TSM (או מדיה מתאימה לגידול תאים לקו תאים לפי בחירה) ב 1.5 mM (3x) כדי לקבל בסוף הבדיקה ריכוז סופי של 0.5 mM.
6. בצע את בדיקת הפלישה ישירות בלוח התחתון העגול ULA 96 שבו נזרעו תאים בתחילה. בדוק את NS חזותית באמצעות מיקרוסקופ הפוך לפני שמתחילים.
7. הסירו בעדינות ובאיטיות 75 מיקרוליטר/באר של המדיום, תוך הימנעות מלגעת בתחתית הבאר בה יושב ה-NS. בדוק את נוכחותו של NS באופן חזותי.
8. הוסף בעדינות 25 μL של BSR לכל באר.
9. הוסיפו בעדינות 25 μL של קומפלקס ALR/נוגדנים לכל באר. המתן 2 או 3 דקות כדי לתת לקומפלקס ALR/נוגדנים להתערבב עם המדיום.
10. בדוק חזותית באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שכל NS ממוקם במיקום מרכזי בתחתית הבאר. הימנע היווצרות של בועות. אם קיימת בועה כלשהי, הסר אותה באמצעות מחט.
11. מניחים את הצלחת על קרח ומחכים 5 דקות כדי לתת לתחתית הצלחת להתקרר.
12. עם קצה p200 מקורר מראש, מוציאים 75 μL/well של מטריצת קרום הבסיס (BMM), מניחים את קצה הפיפטה על הקיר הפנימי של הבאר ונמנעים מלגעת בתחתית הבאר. הימנע היווצרות של בועות ולהסיר עם מחט סטרילית את הקיימים.
    הערה: הקפד להפשיר את BMM ב 4 °C מהלילה הקודם.
13. השאירו את הצלחת על קרח למשך 5 דקות כדי לתת ל-BMM להתערבב עם המדיום. בדוק חזותית באמצעות מיקרוסקופ הפוך את נוכחותם של NS וכי הם ממוקמים במרכז הבאר. אם לא, צנטריפוגר את הצלחת ב 4 ° C ב 180 x גרם במשך 5 דקות.
14. מעבירים את הצלחת במכשיר ניתוח התא החי (טבלה של חומרים) הממוקם בתוך האינקובטור ב 37 ° C, 5% CO₂, 95% לחות.

3. הכנת קומפלקס ALR/נוגדנים והכנה לבדיקת הנדידה

הערה: עבור הליך תיוג נוגדנים, פרוטוקול תוויות^{צבעים 10} עבור אימונוציטוכימיה של תאים חיים משמש.

1. שקול את מספר הבארות לנתח ולחשב את הנפח הדרוש עבור כל מגיב. כלול גם את הבארות הדרושות לבקרות השליליות. בדוק את NS חזותית באמצעות מיקרוסקופ הפוך לפני שמתחילים.
2. השתמשו בצלחות בעלות תחתית שטוחה של 96 בארות. בצע את הליך הציפוי כמתואר על ידי וינצ'י ואחרים, 2013¹⁴. במחקר זה, ה-BMM משמש כציפוי דק.
3. לאחר שהציפוי מוכן, הסירו את עודפי ציפוי ה-BMM עם קצה p200 תוך הנחת החוד בקצה הבאר והימנעות מנגיעה בתחתית. אם אתה עובד עם בארות מרובות, השתמש פיפטה רב ערוצית.
4. חותכים קצה p200, לוקחים 50 μL של תווך התא + NS מכל באר שנבחרה, ומעבירים אותו לבאר תחתית שטוחה מצופה. בדוק את הנוכחות ואת המיקום של NS בכל באר חזותית.
   הערה: כל NS חייב להיות ממוקם במיקום מרכזי בבאר. הימנעו מלהישען על קצה הבאר במהלך ההעברה, אך השליכו את המדיום למרכז הבאר מבלי לגעת בתחתית. עבור תאים נודדים מאוד, שקול מספר גבוה יותר של עותקים משוכפלים מאשר שלושת המשוכפלים הסטנדרטיים. הסיבה לכך היא שכאשר NS יושב קרוב מדי לקצה הבאר, התאים הנודדים עשויים לכסות שטח קטן יותר של הבאר.
5. יש לייבש מחדש את ה-ALR כמתואר לעיל (שלבים 2.2-2.3).
   הערה: מגיב רגיש לאור. ראה לעיל נהלי טיפול טובים.
6. ערבבו את הנוגדן עם ALR במצע צמיחת התאים המלא המתאים בצלחת מרובת בארות תחתונה עגולה או בצינור ענבר והגנו מפני אור. הכינו כמות מספקת כדי להוציא 50 מיקרוליטר/באר בריכוז סופי פי 3. יש לדגור ב-RT למשך 15 דקות.
   הערה: הוסף את הריאגנטים בסדר כפי שצוין לעיל (שלב 2.4).
7. בצע את אותו הליך כפי שדווח בשלב 2.5.
8. מוסיפים בעדינות 50 μL של BSR לכל באר.
9. הוסיפו בעדינות 50 μL של ALR/נוגדן לכל באר. המתינו 2 או 3 דקות כדי לאפשר לריאגנטים להתערבב ובדקו ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שרוב ה-NS המשוכפלים ממוקמים במיקום מרכזי בבאר.
10. הימנע היווצרות של בועות ולהסיר את כל הקיימים באמצעות מחט. העבר בעדינות את הצלחת במכשיר ניתוח התא החי הממוקם בתוך האינקובטור ב 37 ° C, 5% CO₂, 95% לחות.

4. הגדרת מכשיר ניתוח תאים חיים לרכישת תמונה

1. סרוק את הלוחות באמצעות מכשיר ניתוח תאים חיים (לקבלת מפרטים, ראה טבלת חומרים) עם מרווחי סריקה החל מנקודת זמן אפס (t0) של מבחני הפלישה והנדידה שהוגדרו, בהתאמה, לאחר שלב 2.14. ו-3.10. עד 96 שעות.
   הערה: ודא שאתה מסוגל להיפטר ממכשיר ניתוח התאים החיים מיד לאחר תחילת הפלישה ומבחן ההגירה. בהתאם לסוג הגידול, תאים יכולים להתחיל לפלוש או לנדוד מה- NS כבר תוך שעה אחת מהגדרת הבדיקה.
2. בתוכנת המכשיר לניתוח תאים חיים, בחר באפשרות תזמון להשגה. לחץ על הכרטיסייה + ובחר באפשרות סרוק לפי תזמון.
3. בחלון התוכנה צור או שחזר כלי, לחץ על האפשרות חדש.
4. בחר את היישום הספציפי במכשיר ניתוח התא החי עבור הפלישה ורכישת ההגירה. בחר Type Spheroid Scan type, 4x objective, Phase+Brightfield וערוצי תמונה ירוקים לבדיקת הפלישה. בחר סוג סריקה של שכפול דילול, מטרה 4x ושלב וירוק עבור בדיקת ההעברה.
5. בחר את סוג הלוח והגדר את הבארות לסריקה על-ידי הדגשתן במפת הלוחות.
6. הגדר את תדירות הסריקה (עבור הניסויים בפרוטוקול זה תדירות הסריקה הייתה 15 דקות לפלישה ו -30 דקות להגירה).
7. לחץ על הוסף ללוח זמנים והתחל בסריקה.

5. הגדרת מכשיר ניתוח תאים חיים לניתוח תמונה

1. בחר בכרטיסיה צור הגדרת ניתוח חדשה.
2. בחר Spheroid Invasion או יישום Basic Analyzer עבור פלישה והגירה, בהתאמה, בכרטיסייה.
3. בחרו בערוצים המתאימים לפלישה ולהעברה (לפלישה: פאזה+שדה בהיר-ירוק; להעברה: פאזה-ירוק) בערוץ התמונה.
4. בחר כמה תמונות מייצגות מ- 3-4 בארות לתצוגה מקדימה ולליטוש הגדרת הניתוח.
5. עבור מבחן הפלישה, בכרטיסייה Analysis Definition , התאם את הגדרות היישום בערוצים Brightfield ו - Green עם ההגדרה הבאה כדי ליצור פילוח מדויק בין התאים הספרואידיים השלמים והתאים הפולשים (ראה איור 5; מסיכה כחולה):
   סגמנטציה של שדה בהיר: רגישות כדורית שלמה = 50; רגישות התא הפולש = 100; ניקוי = ברירת מחדל.
   מסנני ספרואידים שלמים: הגדר את כל הפרמטרים כברירת מחדל.
   מסנני תאים פולשים: הגדר את כל הפרמטרים כברירת מחדל.
   פילוח ירוק: רדיוס = 900.
6. עבור בדיקת העברה, התאם את הגדרות היישום בערוצים פאזה וירוק כדי ליצור פילוח מדויק בין המפגש והתאים הירוקים (ראה איור 5, מסיכות צהובות וורודות) עם ההגדרה הבאה:
   שלב: הגדר את כל הפרמטרים כברירת מחדל.
   פילוח ירוק: רדיוס = 300; סף = 1000
   ניקוי: מילוי חור = 400; מסננים = ברירת מחדל.
   Whole Well: הגדר את כל הפרמטרים כברירת מחדל.
7. בדוק שהגדרות הניתוח נכונות עבור NS על ידי לחיצה אקראית על מספר בארות. הפילוח חייב לשרטט את הספרואידים. אם לא, התאם את ההגדרה בהתאם.
8. בחר את הבארות ונקודות הזמן לניתוח.
9. שמור את הגדרת הניתוח ולחץ על סיום.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

פרוטוקול אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים עבור פלישה והגירה מסוכם בתהליך עבודה פשוט וניתן לשחזור באיור 1. על ידי זריעת תאי DMG בלוחות תחתונים עגולים ULA 96, NS בגודל הניתן לשחזור מתקבלים ומשמשים בשלבים המוצגים. כאשר NS הגיעו לגודל האידיאלי של ~ 300 מיקרומטר (כ -4 ימים לאחר הזר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

האימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים שאימצנו כאן לפלישה והגירה של DMG בילדים יכולה להיות מותאמת בקלות גם לסוגים אחרים של תאי גידול פולשניים מאוד, כולל שורות תאים של סרטן השד והמעי הגס.

בשונה מבדיקות אימונוציטוכימיה של תאים דו-ממדיים חיים^{שבוצעו בעבר 10}, כאשר ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well TC-Treated Microplates	Corning	3595	size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom
Accutase	Euroclone	ECB3056D	solution for neurosphere dissociation
Burker chamber	Mv medical	FFL16034	cell counting chamber
CD-44 (156-3C11)	Cell Signaling Technology	3570	Mouse mAb IgG2a
Corning Matrigel Matrix	Corning	356237	Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free
Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye	Incucyte	4743	Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry
Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	-	The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.
Inverted Microscope		-	any inverted microscope
Opti-Green Background Suppressor Reagent	Incucyte	6500-0045	Backgroung suppressor reagent (BSR)
Tumor stem cell (TSM) medium	-	-	growth cell medium (see reference in the text for details)
Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Corning Costar	7007	size 96 well, round bottom clear