زراعة ونمو وصلاحية بكتيريا حمض اللاكتيك: منظور مراقبة الجودة

Summary

تم تأكيد تقييم مراقبة الجودة لمزارع بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) كطريقة فعالة لتعزيز صلاحية ووظائف سلالات LAB لإجراءات التخمير. لدعم هذا التأكيد ، قمنا بتطوير بروتوكول يوضح كيفية تنشيط مزارع LAB وزراعتها لإجراءات التخمير والمعالجة الحيوية.

Abstract

بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) هي مزارع أساسية لبداية الألبان تستخدم بشكل كبير لتصنيع منتجات الألبان المخمرة مثل الزبادي والجبن. تنتج LAB في الغالب حمض اللاكتيك كمنتج نهائي رئيسي للتخمير ، وتقوم بتوليف المستقلبات المهمة التي تنقل الخصائص الحسية للمنتجات الغذائية المخمرة. LAB هي بكتيريا شديدة الحساسية تزدهر في العديد من البيئات عندما يتم تلبية المتطلبات الغذائية الكافية. أدى الطلب على مزارع بداية الألبان LAB المتفوقة لتطبيقات التخمير في صناعة الأغذية والألبان إلى الحاجة إلى توفير مزارع قابلة للحياة ونشطة لجميع عمليات المعالجة الحيوية. وبالتالي فإن تطوير بروتوكول قياسي لضمان الجدوى والوظائف المحسنة لمزارع LAB في المختبر وكذلك بيئات معالجة الألبان أمر بالغ الأهمية. في معالجة المخاوف المرتبطة بإنعاش خلايا زراعة LAB الضعيفة والمجهدة والمصابة ، فإن البروتوكول الذي يحدد بوضوح الخطوات البارزة للتعافي ، وتعزيز تجديد الخلايا ، وتحسين وظائف التمثيل الغذائي لسلالات LAB له أهمية قصوى. يعد الحفاظ على نقاء الثقافة ووظائفها وصلاحيتها لثقافات بداية LAB أمرا بالغ الأهمية أيضا. لذلك ، سيؤدي الالتزام بإرشادات بروتوكول فريدة إلى تعزيز أداء التخمير للعديد من سلالات LAB المخصصة لعمليات التخمير والتكنولوجيا الحيوية. نتيجة لذلك ، طور مختبر علم الأحياء الدقيقة الغذائية والتكنولوجيا الحيوية في جامعة ولاية كارولينا الشمالية للزراعة والتقنية بروتوكولا قياسيا لتنشيط ومراقبة جودة سلالات LAB المختارة التي أدت إلى سلالات ثقافة LAB عالية الأداء وقابلة للحياة تستخدم في أبحاث التخمير. سيساعد تكييف بروتوكول مثل هذا والتوصية به للاستخدام في صناعة الألبان والأغذية على ضمان صلاحية LAB ووظائفه للعديد من التطبيقات.

Introduction

بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) هي مجموعة من البكتيريا المتنوعة بشكل فريد والتي لديها إمكانات صناعية. تستخدم السلالات التي تنتمي إلى Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus و Streptococcus thermophilus في الغالب كمزارع بداية الألبان لمنتجات الألبان الغذائية المخمرة مثل الزبادي¹. تصنف سلالات LAB المختارة أيضا على أنها بروبيوتيك لأنها تمنح فوائد صحية للبشر عندما يتم إعطاء الجرعات بشكل كاف². بكتيريا حمض اللاكتيك هي أيضا كائنات دقيقة إيجابية الجرام ، وغير مكونة للأبواغ ، وغير قابلة للتنفس ولكنها متحملة للهواء تتميز عموما بإنتاج حمض اللاكتيك كمنتج تخمير رئيسي. يقوم LAB أيضا بتصنيع المستقلبات الأساسية ، على سبيل المثال ، الأحماض العضوية ، والبكتيريا ، والمركبات المضادة للميكروبات^{الأخرى 3} التي يمكن أن تمنع مجموعة واسعة من مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء⁴. حمض اللاكتيك ، وهو منتج نهائي رئيسي لهدم الكربوهيدرات ومنتج ثانوي لتخمير LAB ، هو مستقلب عضوي يمتلك خصائص مضادة للميكروبات ويحتمل أن يكون مفيدا لتطبيقات الحفظ الحيوي للأغذية³،^5،6. علاوة على ذلك ، فإن الأحماض العضوية التي تنتجها LAB تضفي نكهة وملمس ورائحة الأطعمة ، وبالتالي تعزز خصائصها الحسية الشاملة ^5,6. المتطلبات الغذائية المتميزة ل LAB إلى جانب طبيعتها في كل مكان ، تمكن البكتيريا في النهاية من الازدهار بسهولة في بيئات مختلفة مثل الأطعمة القائمة على الألبان والأطعمة المخمرة والخضروات وكذلك في الأمعاء البشرية⁷.

هناك طلب متزايد على الثقافات البادئة من LAB لإنتاج الزبادي والعديد من تطبيقات الألبان المتنوعة ^8,9 ، وبالتالي يجب الالتزام بالاهتمام النقدي والتقنيات العلمية الراسخة ، في زراعة سلالات LAB ، وكذلك في تنشيط كل من السلالات المجففة بالتجميد والمعزولة لأن هذا النشاط حيوي لتحسين أداء التخمير. لذلك ، يشارك مختبر علم الأحياء الدقيقة الغذائية والتكنولوجيا الحيوية بنشاط في تطوير التكنولوجيا المناسبة الموجهة نحو التنشيط والنمو الفائق وخاصية التخمير لسلالات LAB المعزولة من منتجات الألبان المخمرة وكذلك من مزارع المبتدئين الصناعية المستخدمة لإنتاج الزبادي. علاوة على ذلك ، من الجدير بالذكر أن سلالات زراعة LAB المنتجة صناعيا تخضع لأنشطة حافظة مثل التجفيف بالتجميد والتخزين المجمد ، مما يتسبب في إجهاد الخلايا وإصابتها ، نتيجة لعملية الصدمة الباردة التي تتعرض لها¹⁰. في الحد من تحديات الجدوى وتحسين وظائف سلالات LAB التي تم الحصول عليها إما من المنتجات الغذائية المعزولة أو المنتجات المجففة بالتجميد ، من المهم تنشيط هذه الثقافات بشكل صحيح كشكل من أشكال مراقبة الجودة لتعزيز خصائصها التخمرية⁸. في هذه الدراسة ، كان الهدف هو تطوير بروتوكول داخلي لمراقبة الجودة لتنشيط ونمو سلالات الاستزراع البلغارية الفرعية L. delbrueckii التي عززت في النهاية نمو LAB القابل للحياة ، بالإضافة إلى تعزيز أداء التخمير والوظيفة الأيضية لسلالات LAB. يمكن تكييف هذا البروتوكول في النهاية (باستخدام وسائط النمو المثلى وظروف الزراعة المناسبة) لزراعة سلالات LAB الأخرى لأبحاث التخمير ، وكذلك للأغراض الصناعية أو عمليات المعالجة الحيوية. وبالتالي ، سيضمن بروتوكول تنشيط ومراقبة الجودة LAB هذا الحصول على ثقافات بداية منتجات الألبان الفائقة القابلة للتطبيق والتي يمكن أن تكون وظيفية لتطبيقات متنوعة في صناعة الألبان والأغذية العالمية.

Protocol

1. المواد والأساليب العامة

1. مصدر اكتوباسيلوس ديلبروكي subsp. البلغارية
   1. الحصول على سلالات L. bulgaricus من مصادر موثوقة.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام ما مجموعه خمس (5) سلالات L. bulgaricus في دراسة مراقبة الجودة (الجدول 1). تم توفير سلالتين من L. bulgaricus المجفف بالتجميد للإنتاج الصناعي لمنتجات الحليب المخمر من قبل الدكتور ألبرت كراستانوف ، قسم التكنولوجيا الحيوية في جامعة تقنيات الأغذية ، بلوفديف ، بلغاريا. تم الحصول على سلالتين معزولتين من منتجات الزبادي التجارية المتوفرة في سوق الولايات المتحدة من مخزون -80 درجة مئوية من مختبر علم الأحياء الدقيقة الغذائية والتكنولوجيا الحيوية في جامعة ولاية كارولينا الشمالية A&T وتم توفير سلالة واحدة مجففة بالتجميد من قبل البائع C. تم الاحتفاظ بجميع سلالات LAB عند -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. كما تم تقييم سلالة بكتيرية أخرى (Limosilactobacillus reuteri) من مخزون -80 درجة مئوية من مختبر علم الأحياء الدقيقة الغذائية والتكنولوجيا الحيوية في جامعة ولاية كارولينا الشمالية A&T.
2. معيار L. MRS مرق التخمير المتوسطة
   1. تحضير deMan، Rogosa Sharpe (MRS) المتوسطة عن طريق إذابة تماما 55 غرام من MRS، و 0.5 غرام من L-Cysteine في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات (DW).
   2. قم بتوزيع 7 مل و 2 مل من محلول MRS المحضر في أنابيب الاختبار ، على التوالي ، الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم تبرد في درجة حرارة الغرفة (RT).
3. MRS أجار المتوسطة
   1. تحضير MRS أجار المتوسطة عن طريق إذابة تماما 55 غرام من MRS و 0.5 غرام من L-Cysteine في 1 L من DW. أضف مسحوق أجار (15 جم) ، وعقم وسط الآجار عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم قم بتبريده في حمام مائي.
   2. صب جميع الوسائط الطازجة في أطباق بتري معقمة وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الحاجة إليها.
4. تعديل كلوستريديال متوسط البيروفات المقوى (mRCM-PYR)
   1. تحسين وسط كلوستريديال مقوى وفقا ل Oyeniran et al.13 و Nwamaioha و Ibrahim¹⁸ ، من أجل الانتقائية والتعداد الدقيق ل L. bulgaricus عن طريق إذابة 10 جم من الببتون # 3 ، ¹⁰ جم من مستخلص اللحم البقري ، 5 جم من مستخلص الخميرة ، 5 جم من كلوريد الصوديوم ، 3 جم من أسيتات الصوديوم ، 2 جم من فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة _، 0.1 غرام من اليوراسيل ، 0.25 غرام من كلوريد الكالسيوم ، 5 غرام من سكر العنب ، 5 غرام من الفركتوز ، 10 غرام من المالتوز ، 2 غرام من بيروفات الصوديوم ، 0.2 ٪ توين 80 ، و 0.5 غرام من L- السيستين في 1 لتر من DW.
   2. اضبط الرقم الهيدروجيني النهائي (6.0 ± 0.2) للمحلول باستخدام 6 N HCl قبل إضافة 0.008٪ أزرق أنيلين و 15 جم من أجار. الأوتوكلاف الوسط عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، تبرد في حمام مائي ، وتصب في أطباق بتري معقمة. قم بتخزين جميع الوسائط الطازجة في أطباق بتري معقمة على حرارة 4 درجات مئوية لمجرد الحاجة.
5. مخزون الجلسرين من مزارع LAB
   1. تحضير مخزون الجلسرين (50٪ جلسرين) عن طريق تخفيف 100٪ جلسرين في نفس الحجم من DW وتعقيمه عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة باستخدام دورة تعقيم جافة. قم بتبريد مخزون الجلسرين إلى RT وقم بتخزينه بشكل معقم للاستخدام مرة أخرى.
   2. استخدم النمو البكتيري (مستعمرة واحدة من L. bulgaricus تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول مراقبة الجودة المطور) من الثقافات الليلية.
   3. ماصة 500 ميكرولتر من الثقافات الليلية إلى 50٪ جلسرين في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل واخلطها معا برفق. قم بتجميد وتخزين مخزون الجلسرين الذي يحتوي على مزارع LAB في درجة حرارة منخفضة للغاية تبلغ -80 درجة مئوية لآخر حاجة.
      ملاحظة: يظهر في الشكل 1 مخطط رسومي لبروتوكول مراقبة الجودة وتفعيل ثقافات LAB.

لا	رمز المنتج	عينة	مصدر	التركيب البكتيري كما هو موضح1
1	م9	سلالة صناعية نقية	بلغاريا	رطل بلغاريكوس
2	رطل 6	سلالة صناعية نقية	بلغاريا	رطل بولغاريكوس ،
3	ATCC 11842	سلالة صناعية نقية	إيه تي سي سي	رطل بلغاريكوس
4	داو	زبادي	الولايات المتحدة الأمريكية	Lb. بلغاريا ، ثقافة حية أخرى
5	اي 22	زبادي	الولايات المتحدة الأمريكية	Lb. بلغاريا ، ثقافة حية أخرى
6	روتيري	زبادي	الولايات المتحدة الأمريكية	ليموسيلاكتوباكيللوس روتيري
1رطل = الملبنة

الجدول 1: سلالات بروبيوتيك. يسرد الجدول سلالات البروبيوتيك المستخدمة في هذه الدراسة.

2. بروتوكول تفعيل ومراقبة جودة مزارع LAB

1. خذ مخزون الجلسرين المحضر من سلالات LAB (في أنابيب طرد مركزي سعة 2 مل) من الفريزر المنخفض للغاية -80 درجة مئوية ، ولا تسمح لها بالذوبان قبل الاستخدام.
2. قم بتنظيف وتطهير فتحة أنابيب الطرد المركزي بنسبة 70٪ كحول ، ودوامة بلطف قبل الاستخدام.
3. ماصة حوالي 250 ميكرولتر (0.25 مل) من مخزون LAB من أنابيب الطرد المركزي إلى أنابيب اختبار MRS جديدة سعة 2 مل.
4. دوامة برفق ، بارافيلم أنابيب الاختبار ، واحتضانها لاهوائيا طوال الليل عند 42 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
5. خذ حوالي 500 ميكرولتر (0.5 مل) من المزارع المزروعة بين عشية وضحاها من أنابيب اختبار MRS سعة 2 مل إلى أنابيب اختبار MRS سعة 7 مل ، دوامة ، واحتضانها لاهوائيا طوال الليل عند 42 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
6. تقييم النمو الميكروبي عن طريق قياس الكثافة البصرية (OD) أو نمو الثقافات عند 610 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية وتسجيل نتائج مقبولة بين 0.7 و 0.9.
7. قم بترتيب المزارع الليلية من أنابيب MRS سعة 7 مل على ألواح أجار MRS و MRCM-PYR واحتضانها لاهوائيا لمدة 72 ساعة عند 42 درجة مئوية.
8. اختر مستعمرات معزولة من ألواح الآجار ، وانقلها إلى أنابيب اختبار MRS جديدة سعة 7 مل ، ودوامة برفق ، واحتضنها لاهوائيا طوال الليل عند 42 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
9. قم بتخزين ألواح الآجار التي تحتوي على السلالات المعزولة عند 4 درجات مئوية في الثلاجة لمدة أسبوع.
10. قم بقياس وتأكيد OD (بين 0.7 و 0.9) من أنابيب اختبار MRS سعة 7 مل لمزارع LAB المعزولة عن الألواح المخططة عند 610 نانومتر واستخدمها كمزارع عمل لجميع التجارب ذات الصلة.
11. قم بإجراء تخفيفات عشرة أضعاف (مخففة بشكل متسلسل) لمزارع LAB المزروعة من أنابيب اختبار MRS النهائية سعة 7 مل باستخدام 9 مل من ماء الببتون (مخزن مؤقت فسيولوجي) للحصول على نسبة 1:10.
12. أخيرا ، خذ حوالي 250 ميكرولتر (0.25 مل) من التخفيفات التسلسلية المناسبة لجميع تجارب التخمير.
13. قم بتنشيط المرق الذي يحتوي على سلالات (250 ميكرولتر) من الخطوة 2.12 عن طريق نقلها إلى مرق MRS طازج سعة 7 مل واحتضانها لاهوائيا عند 42 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
14. استمر في تكرار الخطوات 2.6-2.12 لضمان نمو الخلايا القابلة للحياة والمتفوقة من مزارع LAB.
    ملاحظة: تم تنشيط جميع سلالات L. bulgaricus في مرق MRS المحضر حديثا ثم تم تحضينها لاهوائيا عند 42 درجة مئوية لمدة 16 ساعة من أجل الوصول إلى كثافة بصرية (OD_{610 نانومتر}) من النمو البكتيري بين 0.7 و 0.9. تم قياس نمو البكتيريا باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية عند 610 نانومتر. كانت قيم الأس الهيدروجيني للمزارع الليلية في حدود 3.5 إلى 5.3 نتيجة لإنتاج حمض اللاكتيك ، وهو منتج نهائي عضوي لتخمير LAB. تم الالتزام بإجراءات السلامة مثل الدوران السليم لتدفق الهواء في غطاء السلامة البيولوجية وتجنب الحروق أثناء استخدام موقد بنسن ومراعاتها.

الشكل 1: مخطط رسومي لبروتوكول تنشيط مزارع بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB). يوفر المخطط التفاصيل والأدوات الأساسية اللازمة للتعامل مع سلالات زراعة LAB وتنشيطها. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

كان نمو الخلايا لسلالات LAB التي تم تقييمها المزروعة ببروتوكول مراقبة الجودة مختلفا بشكل كبير (P < 0.05) عن السلالات المزروعة بدون هذا البروتوكول القياسي. استخدم بروتوكول مراقبة الجودة لكل من L. bulgaricus و L. reuteri نهجا متعدد الاستزراع الفرعي (الاستزراع الفرعي ثلاث مرات قبل أن يخط على ألواح...

Discussion

كانت نتائج جميع السلالات التي تم تقييمها باستخدام بروتوكول مراقبة الجودة وبدون استخدام البروتوكول هي نفسها ، وعلى هذا النحو ، تم تقديم النتائج المرتبطة بالسلالات فقط (S9 و LB6). كان لسلالات LAB المنشطة نمو خلوي متفوق يتميز بكثافة عالية من الكتلة الحيوية للخلية ، مما تسبب في ظهور عكر لمرق MRS الم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline Blue	Thermo Scientific	R21526	25 g
Beef extract	Research Products International	50-197-7509	500 g
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Calcium Chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500	500 g
Dextrose Anhydrous	Fisher Scientific	BP350500	500 g
D-Fructose	ACROS Organics	AC161355000	500 g
Difco agar powder	Difco	DF0812-07-1	2 kg
TPY agar	Difco	211921	500 g
Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Scientific	05-402-12	2 mL
Glycerol	Thermo Scientific	PI17904	500 mL
Infrared CO2 Incubator	Forma Scientific
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	DAW
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	E22
Lactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	RD2
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Maltose monohydrate	Fisher Scientific	M75-100	100 g
MRS broth	Neogen	50-201-5691	5 kg
Peptone No. 3	Hach	50-199-6719	500 g
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Research Products International	50-712-761	500 g
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	S220-1	1 kg
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	1 kg
Sodium pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100	100 g
Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps	Fisher Scientific	FB70125150	25 x 150 mm
Tween 80	Fisher Scientific	T164-500	500 mL
Ultra low freezer	So-Low
Uracil	ACROS Organics	AC157301000	100 g
UV- visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Evolution 201
Vortex Genie 2	Fisher Scientific
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Ethanol	Fisher Scientific	T08204K7	4 L
Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical)	Fisher Scientific	SA56-500	500 mL