乳酸菌の培養・増殖・生存率:品質管理の視点から

要約

乳酸菌(LAB)培養物の品質管理評価は、発酵手順のためのLAB株の生存率と機能性を高める効果的な方法として確認されています。この主張を裏付けるために、LAB培養物がどのように活性化され、発酵およびバイオプロセシング手順のために培養されるかを解明するプロトコルを開発しました。

要約

乳酸菌(LAB)は、ヨーグルトやチーズなどの発酵乳製品の製造に大きく採用されている必須の乳製品スターター培養物です。LABは主に発酵の主要な最終産物として乳酸を生産し、発酵食品の官能特性を付与する重要な代謝産物を合成します。LABは、適切な栄養要件が満たされると多くの環境で繁殖する潔癖な細菌です。食品および乳製品業界での発酵用途向けの優れたLAB乳製品スターター培養の需要により、すべてのバイオプロセシング操作に実行可能で活性な培養を提供する必要が生じています。したがって、実験室および乳製品加工環境でのLAB培養の実行可能性と強化された機能を確保するための標準プロトコルの開発は非常に重要です。弱く、ストレスを受け、損傷したLAB培養細胞の蘇生に関連する懸念に対処する上で、LAB株の回復、細胞再生の促進、代謝機能の改善のための顕著なステップを鮮明に概説するプロトコルが最も重要です。LABスターター培養の培養純度、機能性、生存率の維持も同様に重要です。したがって、独自のプロトコルガイドラインを順守することで、発酵およびバイオテクノロジープロセスに特化した多くのLAB株の発酵性能が促進されます。その結果、ノースカロライナ農業技術州立大学の食品微生物学およびバイオテクノロジー研究所は、選択されたLAB株の活性化と品質管理のための標準プロトコルを開発し、発酵研究に使用される高機能で実行可能なLAB培養株をもたらしました。このようなプロトコルを乳製品および食品業界で使用するための適応と推奨は、多くのアプリケーションでLABの実行可能性と機能を確保するのに役立ちます。

概要

乳酸菌(LAB)は、産業の可能性を秘めたユニークで多様な細菌のグループです。ラクトバチルス・デルブレウッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスに属する株は、主にヨーグルト¹などの発酵乳製品の乳製品スターター培養物として使用されます。選択されたLAB株は、投与量が適切に投与された場合に人間に健康上の利点を与えるため、プロバイオティクスとしても分類されます²。乳酸菌はまた、グラム陽性、非芽胞形成、非呼吸性であるが好気性微生物であり、一般に重要な発酵産物としての乳酸の生産によって特徴付けられる。LABはまた、必須代謝物、例えば有機酸、バクテリオシン、および広範囲の食品媒介病原体を阻害することができる他の抗菌化合物³を合成する⁴。炭水化物異化の主要な最終産物であり、LAB発酵の副産物である乳酸は、抗菌特性を有する有機代謝産物であり、食品の生物保存用途に潜在的に有用である^3,5,6。さらに、LABによって生成された有機酸は、食品の風味、食感、および香りを与え、その結果、それらの全体的な官能特性を高めます^5,6。LABの明確な栄養要件とそのユビキタスな性質が相まって、最終的には、乳製品ベースの食品、発酵食品、野菜、および人間の腸などのさまざまな環境で細菌が容易に繁殖することを可能にします⁷。

ヨーグルト生産および多くの多様な乳製品用途のためのLABからのスターター培養に対する需要が高まっています^8,9したがって、この活性は発酵性能の向上に不可欠であるため、LAB株の栽培、および凍結乾燥株と単離株の両方の活性化において、重要な注意と確立された科学的技術を順守する必要があります。食品微生物学・バイオテクノロジー研究室では、発酵乳製品やヨーグルト製造に使用される工業用スターター培養物から分離されたLAB株の特性である活性化、優れた増殖、発酵に向けた適切な技術開発に積極的に取り組んでいます。さらに、工業的に生産されたLAB培養株は、凍結乾燥や凍結保存などの保存活性を受け、コールドショックプロセスの結果として細胞ストレスや損傷を引き起こすことは注目に値します¹⁰。単離された食品または凍結乾燥製品のいずれかから得られるLAB株の生存率の課題および機能性の改善を制限するには、それらの発酵特性を高めるための品質管理の一形態としてこれらの培養物を適切に活性化することが重要です⁸。本研究では、L. delbrueckii subsp. bulgaricus培養株の活性化と増殖のための社内品質管理プロトコルを開発し、最終的にLAB株の増殖を促進し、LAB株の発酵性能と代謝機能を向上させることを目的としています。このプロトコルは、最終的には(最適な増殖培地と適切な培養条件を使用して)発酵研究のための他のLAB株の培養、ならびに産業目的またはバイオプロセシング操作に適合させることができます。したがって、このLAB活性化および品質管理プロトコルにより、優れた実行可能な乳製品スターター培養が得られ、世界の乳製品および食品業界の多様なアプリケーションで機能する可能性があります。

プロトコル

1.一般的な材料と方法

1. ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスの供給源
   1. 信頼できる情報源から L.ブルガリカス 株を入手してください。
      注:この研究では、合計5つの L.ブルガリカス 株が品質管理研究で使用されました(表1)。発酵乳製品の工業生産のための凍結乾燥 L.ブルガリカス の2つの株は、ブルガリアのプロブディフにある食品技術大学のバイオテクノロジー学部のアルバートクラスタノフ博士によって提供されました。米国市場で入手可能な市販のヨーグルト製品から分離された2つの菌株は、ノースカロライナA&T州立大学の食品微生物学およびバイオテクノロジー研究所の-80°Cのストックから入手し、1つの凍結乾燥株はベンダーCから供給されました。全てのLAB株は、さらなる使用まで-80°Cに保たれた。ノースカロライナA&T州立大学の食品微生物学およびバイオテクノロジー研究所の-80°Cストックから得られた別の細菌株(Limosilactobacillus reuteri)も評価した。
2. 標準L.MRS発酵ブロス培地
   1. 55 gのMRSと0.5 gのL-システインを1 Lの脱イオン水(DW)に完全に溶解して、デマン、ロゴサシャープ(MRS)培地を調製します。
   2. 調製したMRS溶液7 mLと2 mLをそれぞれ試験管に分注し、オートクレーブを121°Cで15分間分注した後、室温(RT)で冷却します。
3. MRS寒天培地
   1. MRS55gおよびL-システイン0.5gを1LのDWに完全に溶解してMRS寒天培地を調製する。寒天粉末(15g)を加え、寒天培地を121°Cで15分間殺菌した後、水浴中で冷却する。
   2. 調製したてのすべての培地を滅菌ペトリ皿に注ぎ、さらに必要になるまで4°Cで保管します。
4. 修飾強化クロストリジウム培地ピルビン酸(mRCM-PYR)
   1. Oyeniran et al.13およびNwamaiohaおよびIbrahim¹⁸に従って強化クロストリジウム培地を最適化し、10 gのペプトン#3、¹⁰ gの牛肉抽出物、5 gの酵母エキス、5 gの塩化ナトリウム、3 gの酢酸ナトリウム、2 gのリン酸二カリウムを溶解することにより、L.ブルガリカスの選択性と正確な列挙を実現します_。 1リットルのDW中に0.1gのウラシル、0.25gの塩化カルシウム、5gのデキストロース、5gのフルクトース、10gのマルトース、2gのピルビン酸ナトリウム、0.2%トゥイーン80、および0.5gのL-システイン。
   2. 0.008%アニリンブルーと15 gの寒天を添加する前に、6 N HClを使用して溶液の最終pH(6.0 ± 0.2)を調整します。培地を121°Cで15分間オートクレーブし、水浴中で冷却し、滅菌ペトリ皿に注ぎます。新しく調製したすべての培地を、必要になるまで4°Cの滅菌ペトリ皿に保管します。
5. LAB培養のグリセロールストック
   1. 100%グリセロールを同量のDWで希釈してグリセロールストック(50%グリセロール)を調製し、乾式滅菌サイクルを使用して100°Cで30分間滅菌します。グリセロールストックをRTまで冷却し、さらに使用するために無菌的に保管します。
   2. 一晩の培養からの細菌増殖(開発されたQCプロトコルを使用して得られた L.ブルガリカス の単一コロニー)を使用します。
   3. 500 μLの一晩培養液を2 mLの遠沈管で50%グリセロールにピペットで入れ、穏やかに混ぜ合わせます。LAB培養物を含むグリセロールストックを凍結し、必要になるまで-80°Cの超低温で保管します。
      注: LAB培養の品質管理と活性化のためのプロトコルのグラフィカルスキームを 図1に示します。

いいえ	製品コード	見本	源	ラベル1の細菌組成
1	S9	純粋な産業ひずみ	ブルガリア	ポンドブルガリカス
2	ポンド6	純粋な産業ひずみ	ブルガリア	ブルガリカス、
3	ATCC 11842	純粋な産業ひずみ	ティッカー	ポンドブルガリカス
4	ダウ	ヨーグルト	米国	ブルガリカス、その他の生きた文化
5	E22	ヨーグルト	米国	ブルガリカス、その他の生きた文化
6	ロイテリ	ヨーグルト	米国	リモシラクトバチルス・ロイテリ
1ポンド=ラクトバチルス

表1:プロバイオティクス株。 この表は、この研究で使用されたプロバイオティクス株を示しています。

2. LAB培養の活性化と品質管理のためのプロトコル

1. 調製したLAB株のグリセロールストック(2 mL遠沈管)を-80°Cの超低冷凍庫から取り出し、使用前に解凍させないでください。
2. 遠心分離管の開口部を70%アルコールで洗浄して消毒し、使用前に穏やかにボルテックスします。
3. 約250 μL(0.25 mL)のストックLAB培養液を遠心チューブから新鮮な2 mL MRS試験管にピペットで入れます。
4. 穏やかにボルテックスし、試験管をパラフィルム化し、42°Cで12〜16時間一晩嫌気的にインキュベートします。
5. 2 mL MRS試験管から一晩培養した培養物から約500 μL(0.5 mL)を新鮮な7 mL MRS試験管、ボルテックスに取り、42°Cで12〜16時間嫌気的にインキュベートします。
6. UV-可視分光光度計で610 nmでの培養物の光学密度(OD)または増殖を測定し、0.7〜0.9の許容結果を記録することにより、微生物の増殖を評価します。
7. 7 mL MRSチューブからMRSおよびMRCM-PYR寒天プレートに一晩培養物をストリークし、42°Cで72時間嫌気的にインキュベートします。
8. 寒天プレートから単離されたコロニーを選び、新鮮な7 mL MRS試験管に移し、穏やかにボルテックスし、42°Cで12〜16時間一晩嫌気的にインキュベートします。
9. 単離した菌株を含む寒天プレートを冷蔵庫で4°Cで1週間保存する。
10. 610 nmのストリークプレートから分離されたLAB培養の7 mL MRS試験管からのOD(0.7〜0.9)を測定および確認し、関連するすべての実験の作業培養物として使用します。
11. 9 mLのペプトン水(生理的バッファー)を使用して、最終的な7 mL MRS試験管から増殖したLAB培養液を10倍希釈(段階希釈)し、1:10の比率を得ました。
12. 最後に、すべての発酵実験に適した段階希釈液から約250 μL(0.25 mL)を取ります。
13. ステップ2.12の菌株(250 μL)を含むブロスを新鮮な7 mL MRSブロスに移し、42°Cで16時間嫌気的にインキュベートすることにより活性化します。
14. ステップ2.6〜2.12を繰り返して、LAB培養からの生存可能で優れた細胞増殖を確保します。
    注:すべての L.ブルガリカス 株は、新たに調製したMRSブロスで活性化され、次に42°Cで16時間嫌気的にインキュベートされ、0.7〜0.9の細菌増殖の光学密度(OD_{610 nm})に達しました。細菌の増殖は、610nmの紫外可視分光光度計で測定した。一晩培養のpH値は、LAB発酵の有機最終産物である乳酸の生産の結果として3.5〜5.3の範囲でした。バイオセーフティフード内の適切な気流循環やブンゼンバーナーの使用中の火傷の回避などの安全手順が順守され、観察されました。

図1:乳酸菌(LAB)培養の活性化のためのプロトコルのグラフィカルスキーム。 このスキームは、LAB培養株の取り扱いと活性化に必要な詳細と基本的な機器を提供します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

品質管理プロトコルで培養した評価されたLAB株の細胞増殖は、この標準プロトコルなしで培養した株とは有意に異なっていた(P < 0.05)。L. bulgaricusとL. reuteriのQCプロトコルは、マルチ継代培養アプローチ(寒天プレート上でストリーキングする前に3回継代培養する)を採用しましたが、対照手順では、他のすべての条件を一定に保ちながら継代培養を1回だけ行いました。コロニーの?...

ディスカッション

品質管理プロトコルを使用した場合と使用しない場合で評価されたすべての菌株の結果は同じであり、そのため、菌株(S9、およびLB6)のみにリンクした結果が提示されました。活性化されたLAB株は、高強度の細胞バイオマスを特徴とする優れた細胞増殖を有し、したがって、試験管¹¹内のMRS発酵ブロスの濁った外観を引き起こした。培養活性化後に観察された細胞増殖は、嫌?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline Blue	Thermo Scientific	R21526	25 g
Beef extract	Research Products International	50-197-7509	500 g
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Calcium Chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500	500 g
Dextrose Anhydrous	Fisher Scientific	BP350500	500 g
D-Fructose	ACROS Organics	AC161355000	500 g
Difco agar powder	Difco	DF0812-07-1	2 kg
TPY agar	Difco	211921	500 g
Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Scientific	05-402-12	2 mL
Glycerol	Thermo Scientific	PI17904	500 mL
Infrared CO2 Incubator	Forma Scientific
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	DAW
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	E22
Limosilactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	RD2
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Maltose monohydrate	Fisher Scientific	M75-100	100 g
MRS broth	Neogen	50-201-5691	5 kg
Peptone No. 3	Hach	50-199-6719	500 g
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Research Products International	50-712-761	500 g
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	S220-1	1 kg
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	1 kg
Sodium pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100	100 g
Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps	Fisher Scientific	FB70125150	25 x 150 mm
Tween 80	Fisher Scientific	T164-500	500 mL
Ultra low freezer	So-Low
Uracil	ACROS Organics	AC157301000	100 g
UV- visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Evolution 201
Vortex Genie 2	Fisher Scientific
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Ethanol	Fisher Scientific	T08204K7	4 L
Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical)	Fisher Scientific	SA56-500	500 mL