Die Kultivierung, das Wachstum und die Lebensfähigkeit von Milchsäurebakterien: Eine Qualitätskontrollperspektive

Zusammenfassung

Die Qualitätskontrolle von Milchsäurebakterienkulturen (LAB) wurde als wirksamer Weg zur Verbesserung der Lebensfähigkeit und Funktionalität von LAB-Stämmen für Fermentationsverfahren bestätigt. Um diese Behauptung zu untermauern, haben wir ein Protokoll entwickelt, das aufklärt, wie LAB-Kulturen für Fermentations- und Bioprozessprozesse aktiviert und kultiviert werden.

Zusammenfassung

Milchsäurebakterien (LAB) sind essentielle Milchstarterkulturen, die maßgeblich für die Herstellung fermentierter Milchprodukte wie Joghurt und Käse eingesetzt werden. LAB produziert überwiegend Milchsäure als Hauptendprodukt der Fermentation und synthetisiert wichtige Metaboliten, die fermentierten Lebensmitteln die organoleptischen Eigenschaften verleihen. LAB sind anspruchsvolle Bakterien, die in vielen Umgebungen gedeihen, wenn ausreichende Ernährungsanforderungen erfüllt sind. Die Nachfrage nach überlegenen LAB-Molkerei-Starterkulturen für Fermentationsanwendungen in der Lebensmittel- und Milchindustrie hat dazu geführt, dass lebensfähige und aktive Kulturen für alle Bioprozessbetriebe bereitgestellt werden müssen. Die Entwicklung eines Standardprotokolls zur Sicherstellung der Lebensfähigkeit und verbesserten Funktionalität von LAB-Kulturen sowohl im Labor als auch in der Milchverarbeitung ist daher sehr wichtig. Bei der Behandlung von Bedenken im Zusammenhang mit der Wiederbelebung schwacher, gestresster und verletzter LAB-Kulturzellen ist ein Protokoll, das die wichtigsten Schritte zur Genesung, zur Verbesserung der Zellregeneration und zur Verbesserung der metabolischen Funktionalität von LAB-Stämmen anschaulich umreißt, von größter Bedeutung. Die Aufrechterhaltung der Reinheit, Funktionalität und Lebensfähigkeit der Kultur für LAB-Starterkulturen ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Daher wird die Einhaltung einer einzigartigen Protokollrichtlinie zur Förderung der Fermentationsleistung für viele LAB-Stämme führen, die für Fermentations- und Biotechnologieprozesse bestimmt sind. Infolgedessen hat das Labor für Lebensmittelmikrobiologie und Biotechnologie an der North Carolina Agriculture and Technical State University ein Standardprotokoll für die Aktivierung und Qualitätskontrolle ausgewählter LAB-Stämme entwickelt, das zu hochfunktionellen und lebensfähigen LAB-Kulturstämmen geführt hat, die für die Fermentationsforschung eingesetzt werden. Die Anpassung und Empfehlung eines solchen Protokolls für den Einsatz in der Milch- und Lebensmittelindustrie wird dazu beitragen, die Lebensfähigkeit und Funktionalität von LAB für viele Anwendungen sicherzustellen.

Einleitung

Milchsäurebakterien (LAB) sind eine Gruppe von einzigartig vielfältigen Bakterien mit industriellem Potenzial. Stämme von Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus und Streptococcus thermophilus werden meist als Milchstarterkulturen für fermentierte Milchprodukte wie Joghurt¹ verwendet. Ausgewählte LAB-Stämme werden ebenfalls als Probiotika eingestuft, da sie dem Menschen gesundheitliche Vorteile bieten, wenn die Dosierungen angemessen verabreicht werden². Milchsäurebakterien sind ebenfalls grampositive, nicht sporenbildende, nicht atmende, aber aerotolerante Mikroorganismen, die sich im Allgemeinen durch die Produktion von Milchsäure als Schlüsselfermentationsprodukt auszeichnen. LAB synthetisiert auch essentielle Metaboliten, z. B. organische Säuren, Bakteriocine und andere antimikrobielle Verbindungen³, die ein breites Spektrum lebensmittelbedingter Krankheitserreger hemmen können⁴. Milchsäure, ein Hauptendprodukt des Kohlenhydratkatabolismus und ein Nebenprodukt der LAB-Fermentation, ist ein organischer Metabolit, der antimikrobielle Eigenschaften besitzt und potenziell für Anwendungen zur Biokonservierung von Lebensmitteln nützlich ist ^3,5,6. Darüber hinaus verleihen die von LAB hergestellten organischen Säuren den Geschmack, die Textur und das Aroma von Lebensmitteln und verbessern so ihre organoleptischen Eigenschaften insgesamt ^5,6. Die unterschiedlichen Ernährungsanforderungen von LAB in Verbindung mit ihrer allgegenwärtigen Natur ermöglichen es den Bakterien schließlich, in verschiedenen Umgebungen wie Milchprodukten, fermentierten Lebensmitteln, Gemüse sowie im menschlichen Darm leicht zu gedeihen⁷.

Es gibt eine wachsende Nachfrage nach Starterkulturen von LAB für die Joghurtherstellung und viele verschiedene Milchanwendungen^8,9, daher sollten kritische Aufmerksamkeit und etablierte wissenschaftliche Techniken eingehalten werden, sowohl bei der Kultivierung von LAB-Stämmen als auch bei der Aktivierung von lyophilisierten und isolierten Stämmen^, da diese Aktivität für eine verbesserte Fermentationsleistung von entscheidender Bedeutung ist. Das Labor für Lebensmittelmikrobiologie und Biotechnologie engagiert sich daher aktiv in der Entwicklung geeigneter Technologien, die auf die Aktivierung, das überlegene Wachstum und die Fermentationseigenschaften von LAB-Stämmen ausgerichtet sind, die aus fermentierten Milchprodukten sowie aus industriellen Starterkulturen für die Joghurtherstellung isoliert werden. Darüber hinaus ist es bemerkenswert, dass industriell hergestellte LAB-Kulturstämme konservierenden Aktivitäten wie Gefriertrocknung und Tiefkühllagerung unterzogen werden, was zu Zellstress und Verletzungen führt, als Folge des Kälteschockprozesses, dem sie ausgesetzt sind¹⁰. Bei der Begrenzung der Lebensfähigkeitsherausforderungen und der Verbesserung der Funktionalität von LAB-Stämmen, die entweder aus isolierten Lebensmittelprodukten oder gefriergetrockneten Produkten gewonnen werden, ist es wichtig, diese Kulturen als eine Form der Qualitätskontrolle richtig zu aktivieren, um ihre fermentativen Eigenschaften zu verbessern⁸. In dieser Studie bestand das Ziel darin, ein internes Qualitätskontrollprotokoll für die Aktivierung und das Wachstum von L. delbrueckii subsp. bulgaricus-Kulturstämmen zu entwickeln, das letztendlich ein lebensfähiges LAB-Wachstum förderte und die Fermentationsleistung und die metabolische Funktionalität von LAB-Stämmen verbesserte. Dieses Protokoll könnte letztendlich (unter Verwendung optimaler Wachstumsmedien und geeigneter Kulturbedingungen) für die Kultivierung anderer LAB-Stämme für die Fermentationsforschung sowie für industrielle Zwecke oder Bioprozessprozesse angepasst werden. Dieses LAB-Aktivierungs- und Qualitätskontrollprotokoll wird daher sicherstellen, dass überlegene lebensfähige Milchstarterkulturen erhalten werden und potenziell für verschiedene Anwendungen in der globalen Molkerei- und Lebensmittelindustrie funktionsfähig sind.

Protokoll

1. Allgemeine Materialien und Methoden

1. Quelle von Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
   1. Beziehen Sie L. bulgaricus-Stämme aus zuverlässigen Quellen.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden insgesamt fünf (5) L. bulgaricus-Stämme in der Qualitätskontrollstudie verwendet (Tabelle 1). Zwei Stämme von gefriergetrocknetem L. bulgaricus für die industrielle Herstellung von fermentierten Milchprodukten wurden von Dr. Albert Krastanov, Abteilung für Biotechnologie an der Universität für Lebensmitteltechnologien, Plovdiv, Bulgarien, zur Verfügung gestellt. Zwei Stämme, die aus kommerziellen Joghurtprodukten isoliert wurden, die auf dem US-Markt erhältlich sind, wurden aus dem -80 °C-Bestand des Labors für Lebensmittelmikrobiologie und Biotechnologie an der North Carolina A & T State University gewonnen, und ein gefriergetrockneter Stamm wurde von einem Anbieter C geliefert. Alle LAB-Stämme wurden bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gehalten. Ein weiterer Bakterienstamm (Limosilactobacillus reuteri) wurde aus dem -80 °C-Bestand des Labors für Lebensmittelmikrobiologie und Biotechnologie an der North Carolina A&T State University gewonnen.
2. Standard L. MRS Fermentationsbrühe Medium
   1. Bereiten Sie deMan, Rogosa Sharpe (MRS) -Medium vor, indem Sie 55 g MRS und 0,5 g L-Cystein in 1 l entionisiertem Wasser (DW) vollständig auflösen.
   2. 7 ml bzw. 2 ml der vorbereiteten MRS-Lösung in Reagenzgläser geben, 15 min lang bei 121 °C autoklavieren und anschließend bei Raumtemperatur (RT) abkühlen.
3. MRS Agar mittel
   1. Bereiten Sie MRS-Agarmedium vor, indem Sie 55 g MRS und 0,5 g L-Cystein in 1 l DW vollständig auflösen. Agarpulver (15 g) zugeben, das Agarmedium bei 121 °C 15 min sterilisieren und anschließend im Wasserbad abkühlen lassen.
   2. Gießen Sie alle frisch zubereiteten Medien in sterile Petrischalen und lagern Sie sie bei 4 °C, bis sie weiter benötigt werden.
4. Modifiziertes verstärktes Clostridien-Medium-Pyruvat (mRCM-PYR)
   1. Optimierung eines verstärkten Clostridienmediums gemäß Oyeniran et al.13 und Nwamaioha und Ibrahim¹⁸ für Selektivität und genaue Zählung von L. bulgaricus durch Auflösen von 10 g Pepton #3, ¹⁰ g Rindfleischextrakt, 5 g Hefeextrakt, 5 g Natriumchlorid, 3 g Natriumacetat, 2 g Kaliumphosphat _dibasisch, 0,1 g Uracil, 0,25 g Calciumchlorid, 5 g Dextrose, 5 g Fructose, 10 g Maltose, 2 g Natriumpyruvat, 0,2% Tween 80 und 0,5 g L-Cystein in 1 l DW.
   2. Der endgültige pH-Wert (6,0 ± 0,2) der Lösung wird mit 6 N HCl eingestellt, bevor 0,008% Anilinblau und 15 g Agar hinzugefügt werden. Das Medium bei 121 °C 15 min autoklavieren, im Wasserbad abkühlen und in sterile Petrischalen gießen. Lagern Sie alle frisch zubereiteten Medien in sterilen Petrischalen bei 4 °C bis zum Bedarf.
5. Glycerin-Vorrat von LAB-Kulturen
   1. Glycerinbrühen (50% Glycerin) durch Verdünnen von 100% Glycerin im gleichen Volumen DW zubereiten und bei 100 °C für 30 min mit einem trockenen Sterilisationszyklus sterilisieren. Kühlen Sie die Glycerinvorräte auf RT ab und lagern Sie sie für die weitere Verwendung aseptisch.
   2. Verwenden Sie Bakterienwachstum (eine einzelne Kolonie von L. bulgaricus , die mit dem entwickelten QC-Protokoll erhalten wurde) aus Nachtkulturen.
   3. 500 μL der Nachtkulturen in einem 2-ml-Zentrifugenröhrchen zu 50% Glycerin pipettieren und vorsichtig miteinander vermischen. Gefrieren und lagern Sie den Glycerinvorrat mit den LAB-Kulturen bei einer extrem niedrigen Temperatur von -80 °C, bis er benötigt wird.
      HINWEIS: Ein grafisches Schema des Protokolls für die Qualitätskontrolle und Aktivierung von LAB-Kulturen ist in Abbildung 1 dargestellt.

Nein	Produktcode	Probe	Quelle	Bakterielle Zusammensetzung wie markiert1
1	S9	Reine Industriebelastung	Bulgarien	Lb. bulgaricus
2	LB6	Reine Industriebelastung	Bulgarien	Lb. bulgaricus,
3	ATCC 11842	Reine Industriebelastung	ATCC	Lb. bulgaricus
4	DOHLE	Joghurt	USA	Lb. bulgaricus, andere lebende Kultur
5	E22	Joghurt	USA	Lb. bulgaricus, andere lebende Kultur
6	Reuteri	Joghurt	USA	Limosilactobacillus reuteri
1Pfund = Lactobacillus

Tabelle 1: Probiotische Stämme. Die Tabelle listet die in dieser Studie verwendeten probiotischen Stämme auf.

2. Protokoll zur Aktivierung und Qualitätskontrolle von LAB-Kulturen

1. Nehmen Sie den vorbereiteten Glycerinvorrat der LAB-Stämme (in 2-ml-Zentrifugenröhrchen) aus dem -80 °C Ultra-Low-Gefrierschrank und lassen Sie sie vor Gebrauch nicht auftauen.
2. Reinigen und desinfizieren Sie die Öffnung der Zentrifugenröhrchen mit 70% Alkohol und wirbeln Sie sie vor Gebrauch sanft an.
3. Pipettieren Sie ca. 250 μL (0,25 ml) der LAB-Stammkultur aus den Zentrifugenröhrchen in frische 2 mL MRS-Reagenzgläser.
4. Die Reagenzgläser vorsichtig antexen, parafilmen und anaerob über Nacht bei 42 °C für 12-16 h inkubieren.
5. Nehmen Sie etwa 500 μL (0,5 ml) aus den über Nacht gewachsenen Kulturen aus den 2 mL MRS-Reagenzgläsern in frische 7 mL MRS-Reagenzgläser, wirbeln Sie sie und inkubieren Sie sie anaerob über Nacht bei 42 °C für 12-16 h.
6. Beurteilen Sie das mikrobielle Wachstum, indem Sie die optische Dichte (OD) oder das Wachstum der Kulturen bei 610 nm mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer messen und akzeptable Ergebnisse zwischen 0,7 und 0,9 aufzeichnen.
7. Die Nachtkulturen aus den 7-ml-MRS-Röhrchen auf MRS- und MRCM-PYR-Agarplatten streifen und 72 h bei 42 °C anaerob inkubieren.
8. Nehmen Sie isolierte Kolonien von den Agarplatten, geben Sie sie in frische 7-ml-MRS-Reagenzgläser, wirbeln Sie sie sanft vor und inkubieren Sie sie anaerob über Nacht bei 42 ° C für 12-16 h.
9. Lagern Sie die Agarplatten mit den isolierten Stämmen eine Woche lang bei 4 °C im Kühlschrank.
10. Messen und bestätigen Sie den OD (zwischen 0,7 und 0,9) aus den 7 ml MRS-Reagenzgläsern der LAB-Kulturen, die aus den gestreiften Platten bei 610 nm isoliert wurden, und verwenden Sie sie als Arbeitskulturen für alle verwandten Experimente.
11. Führen Sie zehnfache Verdünnungen (seriell verdünnen) der gewachsenen LAB-Kulturen aus den endgültigen 7-ml-MRS-Reagenzgläsern unter Verwendung von 9 ml Peptonwasser (einem physiologischen Puffer) durch, um ein Verhältnis von 1:10 zu erhalten.
12. Schließlich nehmen Sie etwa 250 μL (0,25 ml) aus geeigneten seriellen Verdünnungen für alle Fermentationsexperimente.
13. Aktivieren Sie die brühehaltigen Stämme (250 μL) aus Schritt 2.12, indem Sie sie in frische 7 mL MRS-Brühe geben und anaerob bei 42 °C für 16 h inkubieren.
14. Wiederholen Sie die Schritte 2.6-2.12, um ein lebensfähiges und überlegenes Zellwachstum aus LAB-Kulturen sicherzustellen.
    HINWEIS: Alle L. bulgaricus-Stämme wurden in der frisch zubereiteten MRS-Brühe aktiviert und dann anaerob bei 42 °C für 16 h inkubiert, um eine optische Dichte (OD_{610 nm}) des Bakterienwachstums zwischen 0,7 und 0,9 zu erreichen. Das Bakterienwachstum wurde mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer bei 610 nm gemessen. Die pH-Werte der Nachtkulturen lagen im Bereich von 3,5 bis 5,3 infolge der Produktion von Milchsäure, einem organischen Endprodukt der LAB-Fermentation. Sicherheitsverfahren wie eine ordnungsgemäße Luftzirkulation in der Biosicherheitshaube und die Vermeidung von Verbrennungen während der Verwendung des Bunsenbrenners wurden eingehalten und eingehalten.

Abbildung 1: Ein grafisches Schema des Protokolls zur Aktivierung von Milchsäurebakterien (LAB)-Kulturen. Das Programm enthält Details und die grundlegenden Instrumente, die für die Handhabung und Aktivierung von LAB-Kulturstämmen erforderlich sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergebnisse

Das Zellwachstum der bewerteten LAB-Stämme, die mit dem Qualitätskontrollprotokoll kultiviert wurden, unterschied sich signifikant (P < 0,05) von den Stämmen, die ohne dieses Standardprotokoll kultiviert wurden. Das QC-Protokoll für L. bulgaricus und L. reuteri verwendete einen Multi-Subkultur-Ansatz (Subkulturierung dreimal vor dem Streifen auf Agarplatten), während das Kontrollverfahren nur einmal subkultiviert wurde, wobei alle anderen Bedingungen konstant blieben. Das Koloniewachstum war auch h...

Diskussion

Die Ergebnisse aller Stämme, die mit dem Qualitätskontrollprotokoll und ohne die Verwendung des Protokolls bewertet wurden, waren die gleichen, und als solche wurden Ergebnisse präsentiert, die nur mit Stämmen (S9 und LB6) verknüpft waren. Die aktivierten LAB-Stämme hatten ein überlegenes Zellwachstum, das durch eine hohe Intensität der Zellbiomasse gekennzeichnet war, was zu einem trüben Aussehen der MRS-fermentativen Brühe im Reagenzglas^{führte 11}. Das beobachtete Zellwachstum nach der...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline Blue	Thermo Scientific	R21526	25 g
Beef extract	Research Products International	50-197-7509	500 g
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Calcium Chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500	500 g
Dextrose Anhydrous	Fisher Scientific	BP350500	500 g
D-Fructose	ACROS Organics	AC161355000	500 g
Difco agar powder	Difco	DF0812-07-1	2 kg
TPY agar	Difco	211921	500 g
Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Scientific	05-402-12	2 mL
Glycerol	Thermo Scientific	PI17904	500 mL
Infrared CO2 Incubator	Forma Scientific
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	DAW
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	E22
Lactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	RD2
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Maltose monohydrate	Fisher Scientific	M75-100	100 g
MRS broth	Neogen	50-201-5691	5 kg
Peptone No. 3	Hach	50-199-6719	500 g
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Research Products International	50-712-761	500 g
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	S220-1	1 kg
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	1 kg
Sodium pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100	100 g
Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps	Fisher Scientific	FB70125150	25 x 150 mm
Tween 80	Fisher Scientific	T164-500	500 mL
Ultra low freezer	So-Low
Uracil	ACROS Organics	AC157301000	100 g
UV- visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Evolution 201
Vortex Genie 2	Fisher Scientific
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Ethanol	Fisher Scientific	T08204K7	4 L
Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical)	Fisher Scientific	SA56-500	500 mL