La culture, la croissance et la viabilité des bactéries lactiques : une perspective de contrôle de la qualité

Résumé

L’évaluation du contrôle de la qualité des cultures de bactéries lactiques (LAB) a été confirmée comme un moyen efficace d’améliorer la viabilité et la fonctionnalité des souches de LAB pour les procédures de fermentation. Pour étayer cette affirmation, nous avons développé un protocole qui explique comment les cultures LAB sont activées et cultivées pour les procédures de fermentation et de biotraitement.

Résumé

Les bactéries lactiques (LAB) sont des cultures lactiques essentielles qui sont utilisées de manière significative pour la fabrication de produits laitiers fermentés tels que le yogourt et le fromage. Les LAB produisent principalement de l’acide lactique en tant que produit final majeur de la fermentation, et ils synthétisent des métabolites importants qui confèrent les caractéristiques organoleptiques des produits alimentaires fermentés. Les LAB sont des bactéries fastidieuses qui se développent dans de nombreux environnements lorsque les besoins nutritionnels adéquats sont satisfaits. La demande de cultures lactiques LAB supérieures pour les applications de fermentation dans l’industrie alimentaire et laitière a entraîné la nécessité de fournir des cultures viables et actives pour toutes les opérations de biotransformation. L’élaboration d’un protocole standard pour assurer la viabilité et la fonctionnalité améliorée des cultures LAB en laboratoire ainsi que dans les environnements de transformation laitière est donc très critique. Pour répondre aux préoccupations liées à la réanimation des cellules de culture LAB faibles, stressées et blessées, un protocole qui décrit de manière vivante les étapes principales pour récupérer, améliorer la régénération cellulaire et améliorer la fonctionnalité métabolique des souches de LAB est de la plus haute importance. Le maintien de la pureté, de la fonctionnalité et de la viabilité des cultures de démarrage LAB est également essentiel. Par conséquent, le respect d’une directive de protocole unique entraînera la promotion des performances de fermentation pour de nombreuses souches LAB dédiées aux processus de fermentation et de biotechnologie. En conséquence, le Food Microbiology and Biotechnology Laboratory de la North Carolina Agriculture and Technical State University a mis au point un protocole standard pour l’activation et le contrôle de la qualité de souches LAB sélectionnées qui a abouti à des souches de culture LAB hautement fonctionnelles et viables utilisées pour la recherche sur la fermentation. L’adaptation et la recommandation d’un protocole comme celui-ci pour une utilisation dans l’industrie laitière et alimentaire aideront à assurer la viabilité et la fonctionnalité de LAB pour de nombreuses applications.

Introduction

Les bactéries lactiques (LAB) sont un groupe de bactéries d’une diversité unique qui ont un potentiel industriel. Les souches appartenant à Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus et Streptococcus thermophilus sont principalement utilisées comme fermentation de fermentation pour les produits laitiers fermentés tels que le yogourt¹. Certaines souches de LAB sont également classées comme probiotiques car elles confèrent des avantages pour la santé humaine lorsque les doses sont correctement administrées². Les bactéries lactiques sont également des microorganismes à Gram positif, non sporulés, non respirants mais aérotolérants qui sont généralement caractérisés par la production d’acide lactique comme produit de fermentation clé. LAB synthétise également des métabolites essentiels, par exemple des acides organiques, des bactériocines et d’autres composés antimicrobiens³ qui peuvent inhiber un large éventail d’agents pathogènes d’origine alimentaire⁴. L’acide lactique, un produit final majeur du catabolisme des glucides et un sous-produit de la fermentation LAB, est un métabolite organique qui possède des propriétés antimicrobiennes et est potentiellement utile pour les applications de bioconservation des aliments ^3,5,6. De plus, les acides organiques produits par LAB confèrent la saveur, la texture et l’arôme des aliments, améliorant ainsi leurs propriétés organoleptiques globales ^5,6. Les besoins nutritionnels distincts de LAB, associés à leur nature omniprésente, permettent finalement aux bactéries de se développer facilement dans différents environnements tels que les aliments à base de produits laitiers, les aliments fermentés, les légumes ainsi que dans l’intestin humain⁷.

Il existe une demande croissante de cultures de démarrage de LAB pour la production de yaourt et de nombreuses applications laitières^{diverses 8,9}, d’où l’attention critique et les techniques scientifiques établies doivent être respectées, dans la culture de souches LAB^, ainsi que dans l’activation de souches lyophilisées et isolées, car cette activité est vitale pour améliorer les performances de fermentation. Le laboratoire de microbiologie et de biotechnologie alimentaires s’engage donc activement dans le développement de technologies appropriées axées sur l’activation, la croissance supérieure et la fermentation caractéristiques des souches LAB isolées à partir de produits laitiers fermentés ainsi que de cultures industrielles de démarrage utilisées pour la production de yogourt. En outre, il convient de noter que les souches de culture LAB produites industriellement subissent des activités de conservation telles que la lyophilisation et le stockage congelé, provoquant un stress et des blessures cellulaires, à la suite du processus de choc dû au froid auquel elles sont soumises¹⁰. En limitant les défis de viabilité et en améliorant la fonctionnalité des souches LAB obtenues à partir de produits alimentaires isolés ou de produits lyophilisés, il est important d’activer correctement ces cultures comme une forme de contrôle de la qualité pour améliorer leur caractéristique fermentative⁸. Dans cette étude, l’objectif était de développer un protocole interne de contrôle de la qualité pour l’activation et la croissance des souches de culture de L. delbrueckii subsp. bulgaricus qui a finalement favorisé une croissance viable de LAB, ainsi que amélioré la performance de fermentation et la fonctionnalité métabolique des souches de LAB. Ce protocole pourrait à terme être adapté (en utilisant des milieux de culture optimaux et des conditions de culture appropriées) pour la culture d’autres souches LAB pour la recherche sur la fermentation, ainsi qu’à des fins industrielles ou des opérations de biotraitement. Ce protocole d’activation et de contrôle de la qualité de LAB garantira donc l’obtention de cultures de démarrage laitières viables supérieures et potentiellement fonctionnelles pour diverses applications dans l’industrie laitière et alimentaire mondiale.

Protocole

1. Matériaux et méthodes généraux

1. Source de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
   1. Obtenir des souches de L. bulgaricus auprès de sources fiables.
      REMARQUE : Dans cette étude, un total de cinq (5) souches de L. bulgaricus ont été utilisées dans l’étude de contrôle de la qualité (tableau 1). Deux souches de L. bulgaricus lyophilisées pour la production industrielle de produits laitiers fermentés ont été fournies par le Dr Albert Krastanov, Département de biotechnologie de l’Université des technologies alimentaires de Plovdiv, Bulgarie. Deux souches isolées de produits de yogourt commerciaux disponibles sur le marché américain ont été obtenues à partir du stock de -80 °C du laboratoire de microbiologie alimentaire et de biotechnologie de la North Carolina A&T State University et une souche lyophilisée a été fournie par un fournisseur C. Toutes les souches de LAB ont été maintenues à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure. Une autre souche bactérienne (Limosilactobacillus reuteri) a été obtenue à partir du stock de -80 °C du laboratoire de microbiologie alimentaire et de biotechnologie de la North Carolina A & T State University a également été évaluée.
2. Standard L. milieu de bouillon de fermentation MRS
   1. Préparer le milieu deMan, Rogosa Sharpe (MRS) en dissolvant complètement 55 g de MRS, et 0,5 g de L-cystéine dans 1 L d’eau désionisée (DW).
   2. Distribuer 7 mL et 2 mL de la solution MRS préparée dans des tubes à essai, respectivement, autoclaver à 121 °C pendant 15 min, puis refroidir à température ambiante (RT).
3. Milieu gélose MRS
   1. Préparer le milieu gélosé MRS en dissolvant complètement 55 g de SMR et 0,5 g de L-cystéine dans 1 L de DW. Ajouter la poudre de gélose (15 g), stériliser le milieu gélosé à 121 °C pendant 15 min, puis refroidir au bain-marie.
   2. Verser tous les milieux fraîchement préparés dans des boîtes de Petri stériles et les conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient encore nécessaires.
4. Milieu clostridial renforcé modifié (mRCM-PYR)
   1. Optimiser un milieu clostridial renforcé selon Oyeniran et al.13 et Nwamaioha et Ibrahim¹⁸, pour la sélectivité et le dénombrement précis de L. bulgaricus en dissolvant 10 g de peptone #3, ¹⁰ g d’extrait de boeuf, 5 g d’extrait de levure, 5 g de chlorure de sodium, 3 g d’acétate de sodium, 2 g de phosphate dibasique de potassium_, 0,1 g d’uracile, 0,25 g de chlorure de calcium, 5 g de dextrose, 5 g de fructose, 10 g de maltose, 2 g de pyruvate de sodium, 0,2 % de Tween 80 et 0,5 g de L-cystéine dans 1 L de DW.
   2. Ajuster le pH final (6,0 ± 0,2) de la solution en utilisant 6 N HCl avant l’ajout de 0,008% de bleu d’aniline et de 15 g de gélose. Autoclaver le milieu à 121 °C pendant 15 min, refroidir au bain-marie et verser dans des boîtes de Petri stériles. Conservez tous les milieux fraîchement préparés dans des boîtes de Petri stériles à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires.
5. Stock de glycérol des cultures LAB
   1. Préparer les stocks de glycérol (50% de glycérol) en diluant 100% de glycérol dans le même volume de DW et stériliser à 100 °C pendant 30 min en utilisant un cycle de stérilisation à sec. Refroidissez les stocks de glycérol à RT et stockez-les de manière aseptique pour une utilisation ultérieure.
   2. Utiliser la croissance bactérienne (une seule colonie de L. bulgaricus obtenue à l’aide du protocole CQ développé) à partir de cultures de nuit.
   3. Pipeter 500 μL des cultures de nuit dans 50% de glycérol dans un tube à centrifuger de 2 ml et mélanger doucement ensemble. Congeler et conserver le stock de glycérol contenant les cultures LAB à une température ultra-basse de -80 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
      REMARQUE : Un schéma graphique du protocole de contrôle de la qualité et d’activation des cultures LAB est illustré à la figure 1.

Non	Code de produit	Échantillon	Source	Composition bactérienne telle qu’étiquetée1
1	S9	Pure souche industrielle	Bulgarie	Lb. bulgaricus
2	LB6	Pure souche industrielle	Bulgarie	Lb. bulgaricus,
3	ATCC 11842	Pure souche industrielle	L’ATCC	Lb. bulgaricus
4	CHOUCAS	Yaourt	ÉTATS-UNIS	Lb. bulgaricus, autre culture vivante
5	E22	Yaourt	ÉTATS-UNIS	Lb. bulgaricus, autre culture vivante
6	Reuteri	Yaourt	ÉTATS-UNIS	Limosilactobacillus reuteri
1lb. = lactobacille

Tableau 1 : Souches probiotiques. Le tableau énumère les souches probiotiques utilisées dans cette étude.

2. Protocole d’activation et de contrôle de la qualité des cultures LAB

1. Prélevez le stock de glycérol préparé des souches LAB (dans des tubes à centrifuger de 2 mL) du congélateur ultra-bas à -80 °C et ne les laissez pas décongeler avant utilisation.
2. Nettoyez et désinfectez l’ouverture des tubes de centrifugation avec de l’alcool à 70% et tourbillonnez doucement avant utilisation.
3. Introduire à la pipette environ 250 μL (0,25 mL) de la culture mère LAB des tubes à centrifuger dans des tubes à essai MRS frais de 2 mL.
4. Vortex doucement, parafilmer les tubes à essai et les incuber en anaérobiose pendant une nuit à 42 °C pendant 12-16 h.
5. Prélever environ 500 μL (0,5 mL) des cultures cultivées pendant la nuit des tubes à essai MRS de 2 mL dans des tubes à essai MRS frais de 7 mL, vortex, et les incuber en anaérobiose pendant la nuit à 42 °C pendant 12-16 h.
6. Évaluer la croissance microbienne en mesurant la densité optique (DO) ou la croissance des cultures à 610 nm avec un spectrophotomètre UV-visible et enregistrer les résultats acceptables entre 0,7 et 0,9.
7. Étaler les cultures de nuit des tubes MRS de 7 ml sur des plaques de gélose MRS et MRCM-PYR et les incuber en anaérobiose pendant 72 h à 42 °C.
8. Prélever les colonies isolées dans les plaques de gélose, les transférer dans des tubes à essai MRS frais de 7 mL, vortex doucement et les incuber en anaérobiose pendant une nuit à 42 °C pendant 12 à 16 h.
9. Conservez les plaques de gélose contenant les souches isolées à 4 °C au réfrigérateur pendant une semaine.
10. Mesurer et confirmer la DO (entre 0,7 et 0,9) des tubes à essai MRS de 7 mL des cultures LAB isolées des plaques striées à 610 nm et les utiliser comme cultures de travail pour toutes les expériences connexes.
11. Effectuer des dilutions dix fois (diluées en série) des cultures LAB cultivées à partir des tubes à essai MRS finaux de 7 ml en utilisant 9 mL d’eau peptonée (un tampon physiologique) pour obtenir un rapport de 1:10.
12. Enfin, prélever environ 250 μL (0,25 mL) à partir de dilutions en série appropriées pour toutes les expériences de fermentation.
13. Activer le bouillon contenant des souches (250 μL) de l’étape 2.12 en les transférant dans un bouillon MRS frais de 7 ml et en les incubant en anaérobiose à 42 °C pendant 16 h.
14. Continuez en répétant les étapes 2.6-2.12 pour assurer une croissance cellulaire viable et supérieure à partir de cultures de laboratoire.
    NOTE: Toutes les souches de L. bulgaricus ont été activées dans le bouillon MRS fraîchement préparé et ont ensuite été incubées en anaérobiose à 42 °C pendant 16 h afin d’atteindre une densité optique (OD_{610 nm}) de croissance bactérienne comprise entre 0,7 et 0,9. La croissance bactérienne a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible à 610 nm. Les valeurs de pH des cultures de nuit étaient comprises entre 3,5 et 5,3 en raison de la production d’acide lactique, un produit final organique de la fermentation LAB. Les procédures de sécurité telles que la circulation de l’air dans la hotte de biosécurité et l’évitement des brûlures pendant l’utilisation du brûleur bunsen ont été respectées et observées.

Figure 1 : Schéma graphique du protocole d’activation des cultures de bactéries lactiques (LAB). Le programme fournit des détails et les instruments de base nécessaires à la manipulation et à l’activation des souches de culture LAB. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

La croissance cellulaire des souches LAB évaluées cultivées avec le protocole de contrôle de la qualité était significativement différente (P < 0,05) des souches cultivées sans ce protocole standard. Le protocole de CQ pour L. bulgaricus et L. reuteri utilisait une approche de sous-culture multiple (sous-culture trois fois avant de strier sur des plaques de gélose), alors que la procédure de contrôle n’avait fait qu’une seule sous-culture avec toutes les autres conditions maintenues const...

Discussion

Les résultats de toutes les souches évaluées avec le protocole de contrôle de la qualité et sans l’utilisation du protocole étaient les mêmes, et à ce titre, les résultats liés uniquement aux souches (S9 et LB6) ont été présentés. Les souches LAB activées avaient une croissance cellulaire supérieure caractérisée par une forte intensité de biomasse cellulaire, provoquant ainsi un aspect trouble du bouillon fermentatif MRS dans le tube à essai¹¹. La croissance cellulaire observ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline Blue	Thermo Scientific	R21526	25 g
Beef extract	Research Products International	50-197-7509	500 g
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Calcium Chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500	500 g
Dextrose Anhydrous	Fisher Scientific	BP350500	500 g
D-Fructose	ACROS Organics	AC161355000	500 g
Difco agar powder	Difco	DF0812-07-1	2 kg
TPY agar	Difco	211921	500 g
Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Scientific	05-402-12	2 mL
Glycerol	Thermo Scientific	PI17904	500 mL
Infrared CO2 Incubator	Forma Scientific
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	DAW
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	E22
Limosilactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	RD2
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Maltose monohydrate	Fisher Scientific	M75-100	100 g
MRS broth	Neogen	50-201-5691	5 kg
Peptone No. 3	Hach	50-199-6719	500 g
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Research Products International	50-712-761	500 g
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	S220-1	1 kg
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	1 kg
Sodium pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100	100 g
Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps	Fisher Scientific	FB70125150	25 x 150 mm
Tween 80	Fisher Scientific	T164-500	500 mL
Ultra low freezer	So-Low
Uracil	ACROS Organics	AC157301000	100 g
UV- visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Evolution 201
Vortex Genie 2	Fisher Scientific
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Ethanol	Fisher Scientific	T08204K7	4 L
Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical)	Fisher Scientific	SA56-500	500 mL