乳酸菌的培养、生长和活力:质量控制视角

摘要

乳酸菌（LAB）培养物的质量控制评估已被证实是增强乳酸菌菌株在发酵过程中的活力和功能的有效方法。为了支持这一说法，我们开发了一个协议，阐明了乳酸菌培养物是如何被激活和培养用于发酵和生物工艺程序的。

摘要

乳酸菌 （LAB） 是必需的乳制品发酵剂培养物，主要用于生产酸奶和奶酪等发酵乳制品。乳酸主要生产乳酸作为发酵的主要最终产物，它们合成重要的代谢物，赋予发酵食品的感官特性。乳酸菌是挑剔的细菌，当满足足够的营养需求时，它们在许多环境中茁壮成长。食品和乳制品行业对用于发酵应用的优质乳品发酵剂发酵剂的需求导致需要为所有生物工艺操作提供可行和活性的培养物。因此，制定标准方案以确保实验室和乳品加工环境中乳酸菌种的可行性和增强功能非常重要。在解决与复苏脆弱、应激和受伤的乳酸菌培养细胞相关的问题时，一个生动地概述恢复、增强细胞再生和改善乳酸菌株代谢功能的突出步骤的方案至关重要。保持 LAB 起始培养物的培养物纯度、功能性和活力同样至关重要。因此，遵守独特的方案指南将提高许多专门用于发酵和生物技术过程的LAB菌株的发酵性能。因此，北卡罗来纳州农业技术州立大学的食品微生物学和生物技术实验室开发了一种标准方案，用于所选乳酸菌株的活化和质量控制，从而产生了用于发酵研究的高功能和可行的乳酸菌株。对乳制品和食品行业使用这样的协议进行调整和推荐将有助于确保许多应用的LAB可行性和功能。

引言

乳酸菌（LAB）是一组具有工业潜力的独特多样化细菌。属于保加利亚乳杆菌亚种和嗜热链球菌的菌株主要用作发酵乳制品（如酸奶¹）的乳制品发酵剂培养物。选定的乳酸菌菌株也被归类为益生菌，因为当剂量充分施用时，它们会给人类带来健康益处².乳酸菌也是革兰氏阳性，非孢子形成，非呼吸但耐气的微生物，其特征通常是生产乳酸作为关键发酵产物。乳酸菌还合成必需代谢物，例如有机酸、细菌素和其他可抑制广谱食源性病原体的抗菌化合物^34。乳酸是碳水化合物分解代谢的主要最终产物和LAB发酵的副产物，是一种具有抗菌特性的有机代谢物，可能对食品生物保鲜应用有用³，^5，6。此外，乳酸产生的有机酸赋予食物的风味、质地和香气，从而增强其整体感官特性^5，6。乳酸菌独特的营养需求加上其无处不在的性质，最终使细菌能够在不同的环境中轻松茁壮成长，例如乳制品，发酵食品，蔬菜以及人体肠道^7。

乳酸乳酸对发酵剂的需求不断增长，用于酸奶生产和许多不同的乳制品应用⁸，⁹，因此在乳酸菌株培养以及冻干和分离菌株的活化中，应坚持关键关注和既定的科学技术^，因为这种活性对于提高发酵性能至关重要。因此，食品微生物学和生物技术实验室积极从事合适的技术开发，旨在从发酵乳制品以及用于酸奶生产的工业发酵剂中分离的乳酸菌株的活化、卓越生长和发酵特性。此外，值得注意的是，工业生产的LAB培养菌株经过冷冻干燥和冷冻储存等防腐活动，导致细胞应激和损伤，由于冷休克过程，它们受到¹⁰。为了限制从分离食品或冷冻干燥产品中获得的LAB菌株的生存能力挑战和改善其功能，重要的是适当激活这些培养物作为质量控制的一种形式，以增强其发酵特性⁸。在这项研究中，目标是开发一种内部质量控制方案，用于激活和生长L. delbrueckii保加利亚亚种培养菌株，最终促进可行的LAB生长，并增强LAB菌株的发酵性能和代谢功能。该方案最终可以调整（使用最佳生长培养基和适当的培养条件）用于培养用于发酵研究的其他LAB菌株，以及用于工业目的或生物工艺操作。因此，该 LAB 活化和质量控制方案将确保获得卓越的活乳制品发酵剂培养物，并有可能在全球乳制品和食品行业的各种应用中发挥作用。

研究方案

1. 一般材料和方法

1. 保加利亚乳杆菌亚种的来源
   1. 从可靠来源获取 保加利亚乳杆菌 菌株。
      注意:在本研究中，在质量控制研究中总共使用了五（5）株 保加利亚乳杆菌 菌株（表1）。保加利亚普罗夫迪夫食品技术大学生物技术系的Albert Krastanov博士提供了两种用于发酵乳制品工业生产的冻干 保加利亚乳杆菌 菌株。从北卡罗来纳州A&T州立大学食品微生物学和生物技术实验室的-80°C库存中获得从美国市场上的商业酸奶产品中分离出的两种菌株，一种冻干菌株由供应商C提供。所有LAB菌株均保持在-80°C直至进一步使用。还评估了另一种细菌菌株（罗伊氏利莫西乳杆菌）从北卡罗来纳州A&T州立大学食品微生物学和生物技术实验室的-80°C库存中获得。
2. 标准L. MRS发酵液培养基
   1. 通过完全溶解 55 克 MRS 和 0.5 克 L-半胱氨酸在 1 升去离子水 （DW） 中制备 deMan， 罗戈萨夏普 （MRS） 培养基。
   2. 将7mL和2mL制备的MRS溶液分别分配到试管中，在121°C高压灭菌15分钟，然后在室温（RT）下冷却。
3. MRS琼脂培养基
   1. 通过将55gMRS和0.5gL-半胱氨酸完全溶解在1L DW中来制备MRS琼脂培养基。加入琼脂粉（15g），将琼脂培养基在121°C灭菌15分钟，然后在水浴中冷却。
   2. 将所有新鲜制备的培养基倒入无菌培养皿中，并将其储存在4°C直至需要。
4. 改良增强梭菌中-丙酮酸（mRCM-PYR）
   1. 根据Oyeniran等人¹³ 和Nwamaioha和Ibrahim¹⁸优化增强梭菌培养基，通过溶解10g蛋白胨#3，10g牛肉提取物，5g酵母提取物，5g氯化钠，3g乙酸钠，2g磷酸 钾二元 ， 尿嘧啶0.1g，氯化钙0.25g，葡萄糖5g，果糖5g，麦芽糖10g，丙酮酸钠2g，吐温80和L-半胱氨酸0.5g在1L的DW中。
   2. 在加入0.008%苯胺蓝和15g琼脂之前，使用6N HCl调节溶液的最终pH（6.0±0.2）。将培养基在121°C高压灭菌15分钟，在水浴中冷却，然后倒入无菌培养皿中。将所有新鲜制备的培养基储存在4°C的无菌培养皿中，直到需要为止。
5. 乳酸菌培养物的甘油原液
   1. 通过在相同体积的DW中稀释100%甘油来制备甘油储备液（50%甘油），并使用干燥灭菌循环在100°C下灭菌30分钟。将甘油原料冷却至室温，并无菌储存以备将来使用。
   2. 使用来自过夜培养物的细菌生长（使用开发的QC方案获得的 保加利亚乳杆菌 的单个菌落）。
   3. 将 500 μL 过夜培养物移液到 2 mL 离心管中的 50% 甘油中，并轻轻混合在一起。将含有LAB培养物的甘油原液冷冻并储存在-80°C的超低温下，直到需要为止。
      注意:用于乳酸菌培养物质量控制和活化的实验方案的图形方案如图 1所示。

不	产品代码	样本	源	标记的细菌组成1
1	S9	纯工业菌株	保加利亚	保加利亚磅
2	LB6	纯工业菌株	保加利亚	保加利亚磅，
3	ATCC 11842	纯工业菌株	空管	保加利亚磅
4	穴鸟	酸奶	美国	保加利亚，其他活体文化
5	E22	酸奶	美国	保加利亚，其他活体文化
6	罗伊特里	酸奶	美国	罗伊氏利莫西乳杆菌
1磅=乳酸菌

表1:益生菌菌株。 下表列出了本研究中使用的益生菌菌株。

2. 乳酸菌培养物活化和质量控制方案

1. 从-80°C超低温冰箱中取出LAB菌株（在2mL离心管中）的制备甘油原液，并且在使用前不要让它们解冻。
2. 用70%酒精清洁和消毒离心管的开口，并在使用前轻轻涡旋。
3. 将离心管中约 250 μL （0.25 mL） 的 LAB 原液培养物移液到新鲜的 2 mL MRS 试管中。
4. 轻轻涡旋，封口膜试管，并在42°C下厌氧孵育过夜12-16小时。
5. 从 2 mL MRS 试管中从过夜生长的培养物中取出约 500 μL （0.5 mL） 到新鲜的 7 mL MRS 试管中，涡旋，并在 42 °C 下厌氧孵育过夜 12-16 小时。
6. 通过使用紫外可见分光光度计测量610nm处培养物的光密度（OD）或生长来评估微生物生长，并记录0.7至0.9之间的可接受结果。
7. 将来自7mL MRS管的过夜培养物划线到MRS和MRCM-PYR琼脂平板上，并在42°C下厌氧孵育72小时。
8. 从琼脂平板中挑选分离的菌落，将它们转移到新鲜的7mL MRS试管中，轻轻涡旋，并在42°C下厌氧孵育过夜12-16小时。
9. 将含有分离菌株的琼脂平板在4°C下在冰箱中储存一周。
10. 测量并确认从 610 nm 条纹板中分离的 LAB 培养物的 7 mL MRS 试管中的 OD（0.7 和 0.9 之间），并将其用作所有相关实验的工作培养物。
11. 使用9 mL蛋白胨水（生理缓冲液）对最终7 mL MRS试管中生长的LAB培养物进行10倍稀释（连续稀释），以获得1:10的比例。
12. 最后，从适当的连续稀释液中取出约 250 μL （0.25 mL），用于所有发酵实验。
13. 通过将含有步骤2.12中的菌株（250μL）的肉汤转移到新鲜的7mL MRS肉汤中并在42°C厌氧孵育16小时来激活含有步骤2.12的菌株的肉汤。
14. 继续重复步骤2.6-2.12，以确保乳酸菌培养物的活细胞生长和优越。
    注意:所有 保加利亚乳杆菌 菌株在新鲜制备的MRS肉汤中被激活，然后在42°C下厌氧孵育16小时，以达到细菌生长的光密度（OD_610nm）在0.7和0.9之间。用紫外可见分光光度计在610nm处测量细菌生长。由于乳酸（乳酸是LAB发酵的有机最终产物）的生产，过夜培养物的pH值在3.5至5.3的范围内。遵守并遵守安全程序，例如生物安全罩中的适当气流循环和避免在使用本生燃烧器期间灼伤。

图 1:乳酸菌 （LAB） 培养物活化方案的图形方案。 该方案提供了处理和激活乳酸菌株所需的细节和基本仪器。 请点击此处查看此图的大图。

结果

用质量控制方案培养的评估的LAB菌株的细胞生长与没有该标准方案培养的菌株显着不同（P < 0.05）。保加利亚乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的QC方案采用多传培养方法（在琼脂平板上划线之前传代三次），而对照程序仅进行一次传代培养，所有其他条件保持不变。菌落生长也更高，并且在使用该标准QC方案培养的生长培养基板上定义良好。这证实了该方案通过发酵肉汤中的细胞分裂确保增强?...

讨论

使用质量控制方案和不使用该方案评估的所有菌株的结果是相同的，因此，仅显示与菌株（S9和LB6）相关的结果。活化的LAB菌株具有优异的细胞生长，其特征在于高强度的细胞生物质，因此，导致试管¹¹中的MRS发酵液出现浑浊外观。在42°C的厌氧发酵温度下，培养活化后观察到的细胞生长在12小时至16小时之间很明显。 还证实，基于该协议激活的LAB菌株由于多亚培养程序

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline Blue	Thermo Scientific	R21526	25 g
Beef extract	Research Products International	50-197-7509	500 g
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Calcium Chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500	500 g
Dextrose Anhydrous	Fisher Scientific	BP350500	500 g
D-Fructose	ACROS Organics	AC161355000	500 g
Difco agar powder	Difco	DF0812-07-1	2 kg
TPY agar	Difco	211921	500 g
Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Scientific	05-402-12	2 mL
Glycerol	Thermo Scientific	PI17904	500 mL
Infrared CO2 Incubator	Forma Scientific
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	DAW
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	E22
Lactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	RD2
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Maltose monohydrate	Fisher Scientific	M75-100	100 g
MRS broth	Neogen	50-201-5691	5 kg
Peptone No. 3	Hach	50-199-6719	500 g
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Research Products International	50-712-761	500 g
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	S220-1	1 kg
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	1 kg
Sodium pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100	100 g
Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps	Fisher Scientific	FB70125150	25 x 150 mm
Tween 80	Fisher Scientific	T164-500	500 mL
Ultra low freezer	So-Low
Uracil	ACROS Organics	AC157301000	100 g
UV- visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Evolution 201
Vortex Genie 2	Fisher Scientific
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Ethanol	Fisher Scientific	T08204K7	4 L
Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical)	Fisher Scientific	SA56-500	500 mL