Культивирование, рост и жизнеспособность молочнокислых бактерий: перспектива контроля качества

Резюме

Оценка качества культур молочнокислых бактерий (LAB) была подтверждена как эффективный способ повышения жизнеспособности и функциональности штаммов LAB для процедур ферментации. Чтобы подкрепить это утверждение, мы разработали протокол, который разъясняет, как LAB-культуры активируются и культивируются для ферментации и биообработки.

Аннотация

Молочнокислые бактерии (LAB) являются важными молочными заквасочными культурами, которые в значительной степени используются для производства ферментированных молочных продуктов, таких как йогурт и сыр. LAB преимущественно производят молочную кислоту в качестве основного конечного продукта ферментации, и они синтезируют важные метаболиты, которые придают органолептические характеристики ферментированных пищевых продуктов. LAB - это привередливые бактерии, которые процветают во многих средах, когда удовлетворяются адекватные потребности в питании. Спрос на превосходные молочные заквасочные культуры LAB для ферментации в пищевой и молочной промышленности привел к необходимости обеспечения жизнеспособных и активных культур для всех операций по биообработке. Таким образом, разработка стандартного протокола для обеспечения жизнеспособности и расширенной функциональности лабораторных культур в лабораторных условиях, а также в средах переработки молочных продуктов имеет очень важное значение. При решении проблем, связанных с реанимационными слабыми, напряженными и травмированными клетками культуры LAB, протокол, который ярко описывает основные шаги по восстановлению, усилению регенерации клеток и улучшению метаболической функциональности штаммов LAB, имеет первостепенное значение. Поддержание чистоты, функциональности и жизнеспособности культур для заквасок LAB также имеет решающее значение. Таким образом, соблюдение уникального руководства по протоколу приведет к повышению производительности ферментации для многих штаммов LAB, предназначенных для процессов ферментации и биотехнологии. В результате Лаборатория пищевой микробиологии и биотехнологии в Сельскохозяйственном и техническом государственном университете Северной Каролины разработала стандартный протокол для активации и контроля качества отдельных штаммов LAB, что привело к созданию высокофункциональных и жизнеспособных штаммов культуры LAB, используемых для исследований ферментации. Адаптация и рекомендация такого протокола для использования в молочной и пищевой промышленности поможет обеспечить жизнеспособность и функциональность LAB для многих применений.

Введение

Молочнокислые бактерии (LAB) представляют собой группу уникально разнообразных бактерий, обладающих промышленным потенциалом. Штаммы, принадлежащие Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus, в основном используются в качестве молочных заквасок для ферментированных молочных пищевых продуктов, таких как йогурт¹. Выбранные штаммы LAB также классифицируются как пробиотики, поскольку они приносят пользу для здоровья людей при адекватном введении доз². Молочнокислые бактерии также являются грамположительными, неспорообразующими, недыхающимися, но аэротолерантными микроорганизмами, которые обычно характеризуются производством молочной кислоты в качестве ключевого продукта ферментации. LAB также синтезирует эссенциальные метаболиты, например, органические кислоты, бактериоцины и другие антимикробные соединения³, которые могут ингибировать широкий спектр патогенов пищевого происхождения⁴. Молочная кислота, основной конечный продукт углеводного катаболизма и побочный продукт ферментации LAB, является органическим метаболитом, который обладает антимикробными свойствами и потенциально полезен для применения в биоконсервации пищевых продуктов ^3,5,6. Кроме того, органические кислоты, производимые LAB, придают вкус, текстуру и аромат пищевых продуктов, тем самым усиливая их общие органолептические свойства ^5,6. Различные потребности в питании LAB в сочетании с их вездесущей природой в конечном итоге позволяют бактериям легко процветать в различных средах, таких как молочные продукты, ферментированные продукты, овощи, а также в кишечнике человека⁷.

Существует растущий спрос на заквасочные культуры из LAB для производства йогурта и многих разнообразных молочных применений ^8,9, поэтому следует придерживаться критического внимания и установленных научных методов при выращивании штаммов LAB, а также при активации как лиофилизированных, так и изолированных штаммов, поскольку эта активность жизненно важна для повышения производительности ферментации. Поэтому лаборатория пищевой микробиологии и биотехнологии активно участвует в разработке подходящей технологии, ориентированной на активацию, превосходный рост и ферментацию, характерные для штаммов LAB, выделенных из ферментированных молочных продуктов, а также из промышленных заквасок, используемых для производства йогурта. Кроме того, следует отметить, что промышленно произведенные штаммы культуры LAB подвергаются консервирующим действиям, таким как сублимационная сушка и замороженное хранение, вызывая клеточный стресс и травмы, в результате процесса холодного шока они подвергаются¹⁰. При ограничении проблем жизнеспособности и улучшении функциональности штаммов LAB, полученных либо из изолированных пищевых продуктов, либо из сублимированных продуктов, важно правильно активировать эти культуры в качестве формы контроля качества для улучшения их ферментативной характеристики⁸. В этом исследовании цель состояла в том, чтобы разработать собственный протокол контроля качества для активации и роста штаммов культуры L. delbrueckii subsp. bulgaricus, который в конечном итоге способствовал жизнеспособному росту LAB, а также улучшал эффективность ферментации и метаболическую функциональность штаммов LAB. Этот протокол в конечном итоге может быть адаптирован (с использованием оптимальных питательных сред и соответствующих условий культивирования) для выращивания других штаммов LAB для исследований ферментации, а также для промышленных целей или операций биообработки. Таким образом, этот протокол активации LAB и контроля качества обеспечит получение и потенциальное функционирование высококачественных молочных заквасочных культур для различных применений в мировой молочной и пищевой промышленности.

протокол

1. Общие материалы и методы

1. Источник Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
   1. Получить штаммы L. bulgaricus из надежных источников.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании в исследовании контроля качества было использовано в общей сложности пять (5) штаммов L. bulgaricus (таблица 1). Два штамма сублимированного L. bulgaricus для промышленного производства кисломолочных продуктов были предоставлены доктором Альбертом Крастановым, кафедрой биотехнологии Университета пищевых технологий, Пловдив, Болгария. Два штамма, выделенные из коммерческих йогуртовых продуктов, доступных на рынке США, были получены из запаса -80 ° C лаборатории пищевой микробиологии и биотехнологии в Университете штата Северная Каролина A & T, а один лиофилизированный штамм был поставлен поставщиком C. Все штаммы LAB выдерживали при -80 °C до дальнейшего использования. Другой бактериальный штамм (Limosilactobacillus reuteri) был получен из запаса -80 ° C лаборатории пищевой микробиологии и биотехнологии в Государственном университете Северной Каролины A & T.
2. Стандарт L. MRS среда ферментационного бульона
   1. Готовят среду deMan, Rogosa Sharpe (MRS), полностью растворив 55 г MRS и 0,5 г L-цистеина в 1 л деионизированной воды (DW).
   2. Дозировать 7 мл и 2 мл приготовленного раствора МРС в пробирки соответственно автоклав при 121 °С в течение 15 мин, а затем охладить при комнатной температуре (РТ).
3. MRS агар средний
   1. Готовят МРС агаровую среду, полностью растворив 55 г МРС и 0,5 г L-цистеина в 1 л DW. Добавить порошок агара (15 г), стерилизовать агаровую среду при 121 °C в течение 15 мин, а затем охладить на водяной бане.
   2. Вылейте все свежеприготовленные среды в стерильные чашки Петри и храните их при 4 °C до дальнейшей необходимости.
4. Модифицированный армированный клостридиальный средо-пируват (mRCM-PYR)
   1. Оптимизировать усиленную клостридиальную среду согласно Oyeniran et ^al.13 и Nwamaioha и Ibrahim¹⁸, для селективности и точного перечисления L. bulgaricus путем растворения 10 г пептона No3, 10 г экстракта говядины, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлорида натрия, 3 г ацетата натрия, 2 г двухосновного фосфата калия_, 0,1 г урацила, 0,25 г хлорида кальция, 5 г декстрозы, 5 г фруктозы, 10 г мальтозы, 2 г пирувата натрия, 0,2% Tween 80 и 0,5 г L-цистеина в 1 л DW.
   2. Отрегулируйте конечный рН (6,0 ± 0,2) раствора, используя 6 N HCl перед добавлением 0,008% анилинового синего и 15 г агара. Автоклав среды при 121 °C в течение 15 мин, остудить на водяной бане и вылить в стерильные чашки Петри. Храните все свежеприготовленные среды в стерильных чашках Петри при температуре 4 °C до тех пор, пока это не понадобится.
5. Глицериновый запас LAB культур
   1. Готовят глицериновые запасы (50% глицерина) путем разбавления 100% глицерина в том же объеме DW и стерилизуют при 100 °C в течение 30 мин с использованием сухого цикла стерилизации. Охладите запасы глицерина до RT и асептически храните их для дальнейшего использования.
   2. Используют бактериальный рост (единичную колонию L. bulgaricus , полученную с помощью разработанного протокола КК) из ночных культур.
   3. Пипетка 500 мкл ночных культур в 50% глицерин в 2 мл центрифужной трубки и осторожно смешивают их вместе. Заморозьте и храните глицериновый запас, содержащий культуры LAB, при сверхнизкой температуре -80 °C до тех пор, пока это не понадобится.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Графическая схема протокола контроля качества и активации LAB культур показана на рисунке 1.

Нет	Код продукта	Образец	Источник	Бактериальная композиция с маркировкой1
1	С9	Чистый промышленный штамм	Болгария	Lb. bulgaricus
2	ЛБ6	Чистый промышленный штамм	Болгария	Lb. bulgaricus,
3	АТХК 11842	Чистый промышленный штамм	АТХК	Lb. bulgaricus
4	ГАЛКА	Йогурт	США	Lb. bulgaricus, другая живая культура
5	Е22	Йогурт	США	Lb. bulgaricus, другая живая культура
6	Реутери	Йогурт	США	Limosilactobacillus reuteri
1фунт = Лактобациллы

Таблица 1: Пробиотические штаммы. В таблице перечислены пробиотические штаммы, используемые в этом исследовании.

2. Протокол активации и контроля качества LAB культур

1. Возьмите подготовленный глицериновый запас штаммов LAB (в 2 мл центрифужных пробирок) из морозильной камеры со сверхнизким содержанием -80 °C и не дайте им оттаять перед использованием.
2. Очистите и продезинфицируйте отверстие трубок центрифуги 70% спиртом и осторожно вихрь перед использованием.
3. Пипетка около 250 мкл (0,25 мл) запасной культуры LAB из центрифужных пробирок в свежие пробирки MRS объемом 2 мл.
4. Осторожно вихрь, парафильмируют пробирки и анаэробно инкубируют их в течение ночи при 42 °C в течение 12-16 ч.
5. Возьмите около 500 мкл (0,5 мл) из выращенных на ночь культур из пробирок 2 мл MRS в свежие пробирки 7 мл MRS, вихрь и анаэробно инкубируйте их в течение ночи при 42 °C в течение 12-16 ч.
6. Оцените рост микробов путем измерения оптической плотности (OD) или роста культур при 610 нм с помощью УФ-видимого спектрофотометра и запишите приемлемые результаты между 0,7 и 0,9.
7. Проведите ночные культуры из 7 мл пробирок MRS на агаровые пластины MRS и MRCM-PYR и инкубируйте их анаэробно в течение 72 ч при 42 °C.
8. Соберите изолированные колонии из агаровых пластин, переложите их в свежие пробирки MRS объемом 7 мл, осторожно вихрь и анаэробно инкубируйте их в течение ночи при 42 °C в течение 12-16 ч.
9. Храните агаровые пластины, содержащие изолированные штаммы при 4 °C, в холодильнике в течение недели.
10. Измерьте и подтвердите OD (от 0,7 до 0,9) из 7 мл пробирок MRS культур LAB, выделенных из полосатых пластин при 610 нм, и используйте их в качестве рабочих культур для всех связанных экспериментов.
11. Выполняют десятикратное разведение (последовательное разбавление) выращенных культур LAB из конечных 7 мл пробирок MRS с использованием 9 мл пептонной воды (физиологический буфер) для получения соотношения 1:10.
12. Наконец, возьмите около 250 мкл (0,25 мл) из соответствующих последовательных разведений для всех экспериментов по ферментации.
13. Активируют бульон, содержащий штаммы (250 мкл) со стадии 2.12 путем переноса их в свежий бульон МРС 7 мл и инкубации их анаэробно при 42 °С в течение 16 ч.
14. Продолжайте повторять шаги 2.6-2.12, чтобы обеспечить жизнеспособный и превосходный рост клеток из культур LAB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все штаммы L. bulgaricus активировали в свежеприготовленном бульоне MRS и затем инкубировали анаэробно при 42 °C в течение 16 ч, чтобы достичь оптической плотности (OD_{610 нм}) роста бактерий между 0,7 и 0,9. Рост бактерий измеряли с помощью УФ-видимого спектрофотометра при 610 нм. Значения рН ночных культур находились в диапазоне от 3,5 до 5,3 в результате производства молочной кислоты, органического конечного продукта ферментации LAB. Соблюдались и соблюдались процедуры безопасности, такие как правильная циркуляция воздушного потока в вытяжке биобезопасности и предотвращение ожогов во время использования горелки Бунзена.

Рисунок 1: Графическая схема протокола активации культур молочнокислых бактерий (LAB). Схема содержит подробную информацию и основные инструменты, необходимые для обработки и активации штаммов культуры LAB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

Рост клеток оцениваемых штаммов LAB, культивируемых с помощью протокола контроля качества, значительно отличался (P < 0,05), чем у штаммов, культивируемых без этого стандартного протокола. Протокол QC как для L. bulgaricus , так и для L. reuteri использовал многосубкультурный подход (субкульту...

Обсуждение

Результаты всех штаммов, оцененных с помощью протокола контроля качества и без использования протокола, были одинаковыми, и поэтому были представлены результаты, связанные только с штаммами (S9 и LB6). Активированные штаммы LAB имели превосходный рост клеток, который характеризовался высо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline Blue	Thermo Scientific	R21526	25 g
Beef extract	Research Products International	50-197-7509	500 g
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Calcium Chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500	500 g
Dextrose Anhydrous	Fisher Scientific	BP350500	500 g
D-Fructose	ACROS Organics	AC161355000	500 g
Difco agar powder	Difco	DF0812-07-1	2 kg
TPY agar	Difco	211921	500 g
Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Scientific	05-402-12	2 mL
Glycerol	Thermo Scientific	PI17904	500 mL
Infrared CO2 Incubator	Forma Scientific
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	DAW
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	E22
Limosilactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	RD2
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Maltose monohydrate	Fisher Scientific	M75-100	100 g
MRS broth	Neogen	50-201-5691	5 kg
Peptone No. 3	Hach	50-199-6719	500 g
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Research Products International	50-712-761	500 g
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	S220-1	1 kg
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	1 kg
Sodium pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100	100 g
Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps	Fisher Scientific	FB70125150	25 x 150 mm
Tween 80	Fisher Scientific	T164-500	500 mL
Ultra low freezer	So-Low
Uracil	ACROS Organics	AC157301000	100 g
UV- visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Evolution 201
Vortex Genie 2	Fisher Scientific
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Ethanol	Fisher Scientific	T08204K7	4 L
Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical)	Fisher Scientific	SA56-500	500 mL