El cultivo, crecimiento y viabilidad de las bacterias del ácido láctico: una perspectiva de control de calidad

Resumen

La evaluación de control de calidad de los cultivos de bacterias del ácido láctico (LAB) se ha confirmado como una forma efectiva de mejorar la viabilidad y funcionalidad de las cepas de LAB para los procedimientos de fermentación. Para reforzar esta afirmación, desarrollamos un protocolo que aclara cómo se activan y cultivan los cultivos LAB para los procedimientos de fermentación y bioprocesamiento.

Resumen

Las bacterias del ácido láctico (LAB) son cultivos iniciadores lácteos esenciales que se emplean significativamente para la fabricación de productos lácteos fermentados como el yogur y el queso. Las BAL producen predominantemente ácido láctico como un producto final importante de la fermentación, y sintetizan metabolitos importantes que imparten las características organolépticas de los productos alimenticios fermentados. Las BAL son bacterias fastidiosas que prosperan en muchos entornos cuando se cumplen los requisitos nutricionales adecuados. La demanda de cultivos iniciadores lácteos LAB superiores para aplicaciones de fermentación en la industria alimentaria y láctea, ha dado lugar a la necesidad de proporcionar cultivos viables y activos para todas las operaciones de bioprocesamiento. El desarrollo de un protocolo estándar para garantizar la viabilidad y la funcionalidad mejorada de los cultivos LAB en el laboratorio, así como en los entornos de procesamiento de productos lácteos, es muy crítico. Al abordar las preocupaciones relacionadas con la reanimación de células de cultivo de LAB débiles, estresadas y lesionadas, un protocolo que describe vívidamente los pasos más destacados para recuperarse, mejorar la regeneración celular y mejorar la funcionalidad metabólica de las cepas de LAB es de suma importancia. El mantenimiento de la pureza del cultivo, la funcionalidad y la viabilidad de los cultivos iniciadores de LAB también es crítico. Por lo tanto, la adherencia a una guía de protocolo única dará como resultado la promoción del rendimiento de fermentación para muchas cepas LAB dedicadas a procesos de fermentación y biotecnología. Como resultado, el Laboratorio de Microbiología y Biotecnología de Alimentos de la Universidad Estatal Técnica y de Agricultura de Carolina del Norte ha desarrollado un protocolo estándar para la activación y el control de calidad de cepas seleccionadas de LAB que ha dado como resultado cepas de cultivo de LAB altamente funcionales y viables empleadas para la investigación de fermentación. La adaptación y recomendación de un protocolo como este para su uso en la industria láctea y alimentaria ayudará a garantizar la viabilidad y funcionalidad de LAB para muchas aplicaciones.

Introducción

Las bacterias del ácido láctico (LAB) son un grupo de bacterias excepcionalmente diversas que tienen potencial industrial. Las cepas pertenecientes a Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus se utilizan principalmente como cultivos iniciadores lácteos para productos lácteos fermentados como el yogur¹. Las cepas seleccionadas de LAB también se clasifican como probióticos, ya que confieren beneficios para la salud de los seres humanos cuando las dosis se administran adecuadamente². Las bacterias del ácido láctico también son microorganismos grampositivos, no formadores de esporas, que no respiran pero aerotolerantes que generalmente se caracterizan por la producción de ácido láctico como un producto clave de fermentación. LAB también sintetiza metabolitos esenciales, por ejemplo, ácidos orgánicos, bacteriocinas y otros compuestos antimicrobianos³ que pueden inhibir un amplio espectro de patógenos transmitidos por los alimentos⁴. El ácido láctico, un producto final importante del catabolismo de carbohidratos y un subproducto de la fermentación de LAB, es un metabolito orgánico que posee propiedades antimicrobianas y es potencialmente útil para aplicaciones de bioconservación de alimentos ^3,5,6. Además, los ácidos orgánicos producidos por LAB imparten el sabor, la textura y el aroma de los alimentos, mejorando así sus propiedades organolépticas generales ^5,6. Los distintos requerimientos nutricionales de LAB junto con su naturaleza ubicua, en última instancia, permiten que las bacterias prosperen fácilmente en diferentes entornos, como alimentos a base de lácteos, alimentos fermentados, verduras y en el intestino humano⁷.

Existe una creciente demanda de cultivos iniciadores de LAB para la producción de yogur y muchas aplicaciones lácteas diversas^8,9, por lo tanto, se debe prestar atención crítica y técnicas científicas establecidas, en el cultivo de cepas LAB, así como en la activación de cepas liofilizadas y aisladas^, ya que esta actividad es vital para mejorar el rendimiento de la fermentación. Por lo tanto, el laboratorio de Microbiología y Biotecnología de Alimentos participa activamente en el desarrollo de tecnología adecuada orientada a la activación, el crecimiento superior y la fermentación característica de las cepas LAB aisladas de productos lácteos fermentados, así como de cultivos iniciadores industriales empleados para la producción de yogur. Además, cabe destacar que las cepas de cultivo de LAB producidas industrialmente se someten a actividades conservantes como la liofilización y el almacenamiento congelado, causando estrés y lesiones celulares, como resultado del proceso de choque frío al que son sometidas¹⁰. Al limitar los desafíos de viabilidad y mejorar la funcionalidad de las cepas de LAB obtenidas a partir de productos alimenticios aislados o productos liofilizados, es importante activar adecuadamente estos cultivos como una forma de control de calidad para mejorar su característica fermentativa⁸. En este estudio, el objetivo fue desarrollar un protocolo interno de control de calidad para la activación y el crecimiento de cepas de cultivo de L. delbrueckii subsp. bulgaricus que finalmente promoviera el crecimiento viable de LAB, así como mejorara el rendimiento de fermentación y la funcionalidad metabólica de las cepas de LAB. En última instancia, este protocolo podría adaptarse (utilizando medios de cultivo óptimos y condiciones de cultivo apropiadas) para el cultivo de otras cepas LAB para la investigación de fermentación, así como para fines industriales u operaciones de bioprocesamiento. Por lo tanto, este protocolo de activación y control de calidad de LAB garantizará que se obtengan cultivos iniciadores lácteos viables superiores y potencialmente funcionales para diversas aplicaciones en la industria láctea y alimentaria mundial.

Protocolo

1. Materiales y métodos generales

1. Fuente de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
   1. Obtenga cepas de L. bulgaricus de fuentes confiables.
      NOTA: En este estudio, se utilizaron un total de cinco (5) cepas de L. bulgaricus en el estudio de control de calidad (Tabla 1). Dos cepas de L. bulgaricus liofilizado para la producción industrial de productos lácteos fermentados fueron proporcionadas por el Dr. Albert Krastanov, Departamento de Biotecnología de la Universidad de Tecnologías de Alimentos, Plovdiv, Bulgaria. Dos cepas aisladas de productos comerciales de yogur disponibles en el mercado estadounidense se obtuvieron de las existencias de -80 °C del laboratorio de Microbiología y Biotecnología de Alimentos de la Universidad Estatal A&T de Carolina del Norte y una cepa liofilizada fue suministrada por un proveedor C. Todas las cepas de LAB se mantuvieron a -80 °C hasta su uso posterior. También se evaluó otra cepa bacteriana (Limosilactobacillus reuteri) del stock de -80 °C del laboratorio de Microbiología y Biotecnología de Alimentos de la Universidad Estatal de Carolina del Norte A&T.
2. Medio de caldo de fermentación estándar L. MRS
   1. Preparar deMan, Rogosa Sharpe (MRS) medio disolviendo completamente 55 g de MRS, y 0,5 g de L-cisteína en 1 L de agua desionizada (DW).
   2. Dispensar 7 ml y 2 ml de la solución MRS preparada en tubos de ensayo, respectivamente, autoclave a 121 °C durante 15 min, y luego enfriar a temperatura ambiente (RT).
3. Medio de agar MRS
   1. Preparar el medio de agar MRS disolviendo completamente 55 g de MRS y 0,5 g de L-cisteína en 1 L de DW. Añadir agar en polvo (15 g), esterilizar el medio de agar a 121 °C durante 15 min y, a continuación, enfriarlo al baño maría.
   2. Vierta todos los medios recién preparados en placas de Petri estériles y guárdelos a 4 °C hasta que se necesiten.
4. Piruvato medio clostridial reforzado modificado (mRCM-PYR)
   1. Optimizar un medio clostridial reforzado de acuerdo con Oyeniran et al.13 y Nwamaioha e Ibrahim¹⁸, para la selectividad y enumeración precisa de L. bulgaricus disolviendo 10 g de peptona #3, ¹⁰ g de extracto de carne de vacuno, 5 g de extracto de levadura, 5 g de cloruro de sodio, 3 g de acetato de sodio, 2 g de fosfato de potasio dibásico_, 0,1 g de uracilo, 0,25 g de cloruro de calcio, 5 g de dextrosa, 5 g de fructosa, 10 g de maltosa, 2 g de piruvato de sodio, 0,2% Tween 80 y 0,5 g de L-cisteína en 1 L de DW.
   2. Ajustar el pH final (6,0 ± 0,2) de la solución utilizando 6 N HCl antes de la adición de azul de anilina al 0,008% y 15 g de agar. Autoclave el medio a 121 °C durante 15 min, enfriar en un baño maría y verter en placas de Petri estériles. Almacene todos los medios recién preparados en placas de Petri estériles a 4 °C hasta que sea necesario.
5. Stock de glicerol de cultivos de laboratorio
   1. Preparar las existencias de glicerol (50% de glicerol) diluyendo el 100% de glicerol en el mismo volumen de DW y esterilizar a 100 °C durante 30 minutos utilizando un ciclo de esterilización en seco. Enfríe las existencias de glicerol a RT y almacénelas asépticamente para su uso posterior.
   2. Utilice el crecimiento bacteriano (una sola colonia de L. bulgaricus obtenida utilizando el protocolo de control de calidad desarrollado) de cultivos nocturnos.
   3. Pipetear 500 μL de los cultivos nocturnos en glicerol al 50% en un tubo de centrífuga de 2 ml y mezclarlos suavemente. Congelar y almacenar el stock de glicerol que contiene los cultivos de laboratorio a una temperatura ultrabaja de -80 °C hasta que sea necesario.
      NOTA: En la Figura 1 se muestra un esquema gráfico del protocolo para el control de calidad y la activación de cultivos LAB.

No	Código de producto	Muestra	Fuente	Composición bacteriana como se indica1
1	S9	Pure Industrial Strain	Bulgaria	Lb. bulgaricus
2	LB6	Pure Industrial Strain	Bulgaria	Lb. bulgaricus,
3	ATCC 11842	Pure Industrial Strain	ATCC	Lb. bulgaricus
4	GRAJILLA	Yogur	Estados Unidos	Lb. bulgaricus, otra cultura viva
5	E22	Yogur	Estados Unidos	Lb. bulgaricus, otra cultura viva
6	Reuteri	Yogur	Estados Unidos	Limosilactobacillus reuteri
1lb. = Lactobacillus

Tabla 1: Cepas probióticas. La tabla enumera las cepas probióticas utilizadas en este estudio.

2. Protocolo para la activación y control de calidad de cultivos LAB

1. Tome el stock de glicerol preparado de cepas LAB (en tubos de centrífuga de 2 ml) del congelador ultra bajo de -80 °C, y no permita que se descongelen antes de su uso.
2. Limpie y desinfecte la abertura de los tubos de la centrífuga con un 70% de alcohol y haga un vórtice suave antes de usarlo.
3. Pipetear aproximadamente 250 μL (0,25 ml) del cultivo LAB madre de los tubos de centrífuga a tubos de ensayo MRS frescos de 2 ml.
4. Realizar suavemente un vórtice, hacer parafilmar los tubos de ensayo e incubarlos anaeróbicamente durante la noche a 42 °C durante 12-16 h.
5. Tomar aproximadamente 500 μL (0,5 ml) de los cultivos cultivados durante la noche de los tubos de ensayo MRS de 2 ml en tubos de ensayo MRS frescos de 7 ml, vórtice e incubarlos anaeróbicamente durante la noche a 42 °C durante 12-16 h.
6. Evaluar el crecimiento microbiano midiendo la densidad óptica (OD) o el crecimiento de los cultivos a 610 nm con un espectrofotómetro UV visible y registrar resultados aceptables entre 0,7 y 0,9.
7. Rayar los cultivos nocturnos de los tubos MRS de 7 ml sobre placas de agar MRS y MRCM-PYR e incubarlos anaeróbicamente durante 72 h a 42 °C.
8. Recoger colonias aisladas de las placas de agar, transferirlas a tubos de ensayo MRS frescos de 7 ml, vórtice suavemente e incubarlas anaeróbicamente durante la noche a 42 °C durante 12-16 h.
9. Conservar en nevera las placas de agar que contienen las cepas aisladas a 4 °C.
10. Medir y confirmar el OD (entre 0,7 y 0,9) a partir de los tubos de ensayo MRS de 7 ml de los cultivos LAB aislados de las placas rayadas a 610 nm y utilizarlos como cultivos de trabajo para todos los experimentos relacionados.
11. Realizar diluciones diez veces (diluidas en serie) de los cultivos de LAB cultivados de los tubos de ensayo MRS finales de 7 ml utilizando 9 ml de agua de peptona (un tampón fisiológico) para obtener una proporción de 1:10.
12. Finalmente, tome aproximadamente 250 μL (0.25 ml) de diluciones seriadas apropiadas para todos los experimentos de fermentación.
13. Activar el caldo que contiene cepas (250 μL) a partir del paso 2.12 transfiriéndolas a un caldo fresco MRS de 7 ml e incubándolas anaeróbicamente a 42 °C durante 16 h.
14. Continúe repitiendo los pasos 2.6-2.12 para asegurar un crecimiento celular viable y superior a partir de cultivos LAB.
    NOTA: Todas las cepas de L. bulgaricus se activaron en el caldo MRS recién preparado y luego se incubaron anaeróbicamente a 42 °C durante 16 h para alcanzar una densidad óptica (OD_{610 nm}) de crecimiento bacteriano entre 0,7 y 0,9. El crecimiento bacteriano se midió con un espectrofotómetro UV-visible a 610 nm. Los valores de pH de los cultivos nocturnos estuvieron en el rango de 3.5 a 5.3 como resultado de la producción de ácido láctico, un producto final orgánico de la fermentación LAB. Se cumplieron y observaron procedimientos de seguridad como la circulación adecuada del flujo de aire en la campana de bioseguridad y evitar quemaduras durante el uso del mechero bunsen.

Figura 1: Un esquema gráfico del protocolo para la activación de cultivos de bacterias del ácido láctico (LAB). El esquema proporciona detalles y los instrumentos básicos necesarios para el manejo y activación de cepas de cultivo LAB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

El crecimiento celular de las cepas LAB evaluadas cultivadas con el protocolo de control de calidad fue significativamente diferente (P < 0,05) que las cepas cultivadas sin este protocolo estándar. El protocolo de control de calidad para L. bulgaricus y L. reuteri empleó un enfoque de subcultivo múltiple (subcultivo tres veces antes de rayar en placas de agar), mientras que el procedimiento de control tuvo subcultivo realizado solo una vez con todas las demás condiciones mantenidas constantes. El cr...

Discusión

Los resultados de todas las cepas evaluadas con el protocolo de control de calidad y sin el uso del protocolo fueron los mismos, y como tal, se presentaron resultados vinculados solo a cepas (S9 y LB6). Las cepas LAB activadas tuvieron un crecimiento celular superior que se caracterizó por una alta intensidad de biomasa celular, por lo tanto, causando una apariencia turbia del caldo fermentativo MRS en el tubo de ensayo¹¹. El crecimiento celular observado después de la activación del cultivo fu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline Blue	Thermo Scientific	R21526	25 g
Beef extract	Research Products International	50-197-7509	500 g
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Calcium Chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500	500 g
Dextrose Anhydrous	Fisher Scientific	BP350500	500 g
D-Fructose	ACROS Organics	AC161355000	500 g
Difco agar powder	Difco	DF0812-07-1	2 kg
TPY agar	Difco	211921	500 g
Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Scientific	05-402-12	2 mL
Glycerol	Thermo Scientific	PI17904	500 mL
Infrared CO2 Incubator	Forma Scientific
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	DAW
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	E22
Limosilactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	RD2
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Maltose monohydrate	Fisher Scientific	M75-100	100 g
MRS broth	Neogen	50-201-5691	5 kg
Peptone No. 3	Hach	50-199-6719	500 g
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Research Products International	50-712-761	500 g
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	S220-1	1 kg
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	1 kg
Sodium pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100	100 g
Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps	Fisher Scientific	FB70125150	25 x 150 mm
Tween 80	Fisher Scientific	T164-500	500 mL
Ultra low freezer	So-Low
Uracil	ACROS Organics	AC157301000	100 g
UV- visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Evolution 201
Vortex Genie 2	Fisher Scientific
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Ethanol	Fisher Scientific	T08204K7	4 L
Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical)	Fisher Scientific	SA56-500	500 mL