Laktik Asit Bakterilerinin Yetiştirilmesi, Büyümesi ve Yaşayabilirliği: Kalite Kontrol Perspektifi

Özet

Laktik asit bakteri (LAB) kültürlerinin kalite kontrol değerlendirmesi, fermantasyon prosedürleri için LAB suşlarının yaşayabilirliğini ve işlevselliğini arttırmanın etkili bir yolu olarak doğrulanmıştır. Bu iddiayı desteklemek için, LAB kültürlerinin fermantasyon ve biyoişleme prosedürleri için nasıl aktive edildiğini ve yetiştirildiğini açıklayan bir protokol geliştirdik.

Özet

Laktik asit bakterileri (LAB), yoğurt ve peynir gibi fermente süt ürünlerinin üretiminde önemli ölçüde kullanılan temel süt başlangıç kültürleridir. LAB ağırlıklı olarak fermantasyonun önemli bir son ürünü olarak laktik asit üretir ve fermente gıda ürünlerinin organoleptik özelliklerini veren önemli metabolitleri sentezler. LAB, yeterli beslenme gereksinimleri yerine getirildiğinde birçok ortamda gelişen titiz bakterilerdir. Gıda ve süt ürünleri endüstrisindeki fermantasyon uygulamaları için üstün LAB süt ürünleri başlangıç kültürlerine olan talep, tüm biyo-işleme operasyonları için uygulanabilir ve aktif kültürler sağlama ihtiyacını doğurmuştur. Bu nedenle, LAB kültürlerinin laboratuvarda ve süt ürünleri işleme ortamlarında yaşayabilirliğini ve gelişmiş işlevselliğini sağlamak için standart bir protokolün geliştirilmesi çok önemlidir. Zayıf, stresli ve yaralı LAB kültür hücrelerinin canlandırılmasıyla ilgili endişelerin ele alınmasında, iyileşmek, hücre yenilenmesini arttırmak ve LAB suşlarının metabolik işlevselliğini iyileştirmek için göze çarpan adımları canlı bir şekilde özetleyen bir protokol çok önemlidir. LAB başlangıç kültürleri için kültür saflığının, işlevselliğinin ve uygulanabilirliğinin korunması da aynı şekilde kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, benzersiz bir protokol kılavuzuna bağlılık, fermantasyon ve biyoteknoloji proseslerine adanmış birçok LAB suşu için fermantasyon performansının teşvik edilmesine neden olacaktır. Sonuç olarak, Kuzey Carolina Tarım ve Teknik Eyalet Üniversitesi'ndeki Gıda Mikrobiyolojisi ve Biyoteknoloji Laboratuvarı, fermantasyon araştırması için kullanılan son derece işlevsel ve uygulanabilir LAB kültür suşları ile sonuçlanan seçilmiş LAB suşlarının aktivasyonu ve kalite kontrolü için standart bir protokol geliştirmiştir. Bunun gibi bir protokolün süt ürünleri ve gıda endüstrisinde kullanılmak üzere uyarlanması ve önerilmesi, birçok uygulama için LAB'ın uygulanabilirliğini ve işlevselliğini sağlamaya yardımcı olacaktır.

Giriş

Laktik asit bakterileri (LAB), endüstriyel potansiyele sahip benzersiz çeşitlilikte bir bakteri grubudur. Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus ve Streptococcus thermophilus'a ait suşlar çoğunlukla yoğurt¹ gibi fermente süt ürünleri için süt başlangıç kültürleri olarak kullanılır. Seçilen LAB suşları, dozajlar yeterince uygulandığında insanlara sağlık yararları sağladıkları için probiyotikler olarak da sınıflandırılır². Laktik asit bakterileri aynı zamanda gram-pozitif, spor oluşturmayan, solunum yapmayan ancak aerotoleranslı mikroorganizmalardır ve genellikle laktik asidin anahtar fermantasyon ürünü olarak üretilmesi ile karakterize edilir. LAB ayrıca esansiyel metabolitleri, örneğin organik asitleri, bakteriyosinleri ve gıda kaynaklı patojenlerin geniş bir spektrumunu inhibe edebilen diğer antimikrobiyal bileşikleri³ sentezler⁴. Karbonhidrat katabolizmasının önemli bir son ürünü ve LAB fermantasyonunun bir yan ürünü olan laktik asit, antimikrobiyal özelliklere sahip ve gıda biyopkoruma uygulamaları için potansiyel olarak yararlı olan organik bir metabolittir ^3,5,6. Ayrıca, LAB tarafından üretilen organik asitler, gıdaların lezzetini, dokusunu ve aromasını verir, böylece sonuç olarak genel organoleptik özelliklerini arttırır ^5,6. LAB'ın farklı beslenme gereksinimleri, her yerde bulunan doğaları ile birleştiğinde, sonuçta bakterilerin süt bazlı gıdalar, fermente gıdalar, sebzeler ve insan bağırsağında olduğu gibi farklı ortamlarda kolayca gelişmesini sağlar⁷.

Yoğurt üretimi ve çok çeşitli süt ürünleri uygulamaları için LAB'den başlangıç kültürlerine artan bir talep vardır^8,9, bu nedenle LAB suşlarının yetiştirilmesinde ve hem liyofilize hem de izole suşların aktivasyonunda kritik dikkat ve yerleşik bilimsel tekniklere uyulmalıdır^, çünkü bu aktivite gelişmiş fermantasyon performansı için hayati öneme sahiptir. Bu nedenle, Gıda Mikrobiyolojisi ve Biyoteknoloji laboratuvarı, fermente süt ürünlerinden ve yoğurt üretimi için kullanılan endüstriyel başlangıç kültürlerinden izole edilen LAB suşlarının aktivasyonu, üstün büyümesi ve fermantasyon karakteristiğine yönelik uygun teknoloji geliştirmede aktif olarak yer almaktadır. Ayrıca, endüstriyel olarak üretilen LAB kültür suşlarının dondurarak kurutma ve dondurulmuş depolama gibi koruyucu faaliyetlere maruz kalmaları, hücre stresine ve yaralanmasına neden olmaları, maruz kaldıkları soğuk şok işlemi sonucunda¹⁰. İzole gıda ürünlerinden veya dondurularak kurutulmuş ürünlerden elde edilen LAB suşlarının canlılık zorluklarını sınırlamak ve işlevselliğini geliştirmekte, fermentatif karakteristiklerini arttırmak için bu kültürleri bir kalite kontrol biçimi olarak uygun şekilde aktive etmek önemlidir⁸. Bu çalışmada amaç, L. delbrueckii subsp. bulgaricus kültür suşlarının aktivasyonu ve büyümesi için nihayetinde uygulanabilir LAB büyümesini teşvik eden ve aynı zamanda fermantasyon performansını ve LAB suşlarının metabolik işlevselliğini artıran bir kurum içi kalite kontrol protokolü geliştirmekti. Bu protokol nihayetinde fermantasyon araştırması için diğer LAB suşlarının yetiştirilmesinin yanı sıra endüstriyel amaçlar veya biyoişleme operasyonları için (optimum büyüme ortamı ve uygun kültürleme koşulları kullanılarak) uyarlanabilir. Bu nedenle, bu LAB aktivasyonu ve kalite kontrol protokolü, küresel süt ürünleri ve gıda endüstrisindeki çeşitli uygulamalar için üstün uygulanabilir süt ürünleri başlangıç kültürlerinin elde edilmesini ve potansiyel olarak işlevsel olmasını sağlayacaktır.

Protokol

1. Genel gereç ve yöntemler

1. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus'un kaynağı
   1. L. bulgaricus suşlarını güvenilir kaynaklardan elde edin.
      NOT: Bu çalışmada kalite kontrol çalışmasında toplam beş (5) L. bulgaricus suşu kullanılmıştır (Tablo 1). Fermente süt ürünlerinin endüstriyel üretimi için iki dondurularak kurutulmuş L. bulgaricus suşu, Bulgaristan'ın Plovdiv kentindeki Gıda Teknolojileri Üniversitesi Biyoteknoloji Bölümü Dr. Albert Krastanov tarafından sağlanmıştır. ABD pazarında bulunan ticari yoğurt ürünlerinden izole edilen iki suş, Kuzey Carolina A & T Eyalet Üniversitesi'ndeki Gıda Mikrobiyolojisi ve Biyoteknoloji laboratuvarının -80 ° C stoğundan elde edildi ve bir dondurularak kurutulmuş suş bir satıcı C tarafından tedarik edildi. Tüm LAB suşları daha fazla kullanıma kadar -80 ° C'de tutuldu. Kuzey Carolina A & T Eyalet Üniversitesi'ndeki Gıda Mikrobiyolojisi ve Biyoteknoloji laboratuvarının -80 °C stokundan elde edilen başka bir bakteri suşu (Limosilactobacillus reuteri) da değerlendirildi.
2. Standart L. MRS fermantasyon suyu ortamı
   1. 55 g MRS ve 0.5 g L-Sistein 1 L deiyonize suda (DW) tamamen çözerek deMan, Rogosa Sharpe (MRS) ortamını hazırlayın.
   2. Hazırlanan MRS çözeltisinin sırasıyla 7 mL ve 2 mL'sini test tüplerine dağıtın, 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav yapın ve ardından oda sıcaklığında (RT) soğutun.
3. MRS agar ortamı
   1. 1 L DW'de 55 g MRS ve 0.5 g L-Sistein tamamen çözerek MRS agar ortamını hazırlayın. Agar tozu (15 g) ekleyin, agar ortamını 15 dakika boyunca 121 ° C'de sterilize edin ve ardından bir su banyosunda soğutun.
   2. Taze hazırlanmış tüm ortamları steril Petri kaplarına dökün ve daha fazla ihtiyaç duyulana kadar 4 ° C'de saklayın.
4. Modifiye güçlendirilmiş klostridiyal orta-piruvat (mRCM-PYR)
   1. Oyeniran ve ark.13 ve Nwamaioha ve İbrahim^{18'e göre, 10} g pepton #3, ¹⁰ g sığır eti özü, 5 g maya özü, 5 g sodyum klorür, 3 g sodyum asetat, 2 g potasyum fosfat dibazik çözerek L. bulgaricus'un seçiciliği ve doğru sayımı için güçlendirilmiş bir klostridiyal ortamı optimize edin_, 0.1 g urasil, 0.25 g kalsiyum klorür, 5 g dekstroz, 5 g fruktoz, 10 g maltoz, 2 g sodyum piruvat,% 0.2 Ara 80 ve 1 L DW'de 0.5 g L- Sistein.
   2. % 0.008 anilin mavisi ve 15 g agar ilavesinden önce 6 N HCl kullanarak çözeltinin nihai pH'ını (6.0 ± 0.2) ayarlayın. Ortamı 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav yapın, bir su banyosunda soğutun ve steril Petri kaplarına dökün. Taze hazırlanmış tüm ortamları steril Petri kaplarında 4 °C'de ihtiyaç duyulana kadar saklayın.
5. LAB kültürlerinin gliserol stoğu
   1. Aynı DW hacminde% 100 gliserol seyrelterek gliserol stoklarını (% 50 gliserol) hazırlayın ve kuru bir sterilizasyon döngüsü kullanarak 30 dakika boyunca 100 ° C'de sterilize edin. Gliserol stoklarını RT'ye soğutun ve daha fazla kullanım için aseptik olarak saklayın.
   2. Gece kültürlerinden bakteri büyümesi (geliştirilen QC protokolü kullanılarak elde edilen tek bir L. bulgaricus kolonisi) kullanın.
   3. Pipet, gece kültürlerinin 500 μL'sini 2 mL'lik bir santrifüj tüpünde %50 gliserol haline getirin ve nazikçe karıştırın. LAB kültürlerini içeren gliserol stoğunu dondurun ve ihtiyaç duyulana kadar -80 ° C'lik ultra düşük bir sıcaklıkta saklayın.
      NOT: LAB kültürlerinin kalite kontrolü ve aktivasyonu için protokolün grafik şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.

Hayır	Ürün Kodu	Örnek	Kaynak	Bakteriyel Bileşim etiketli1
1	S9 Serisi	Saf Endüstriyel Gerinim	Bulgaristan	Lb. bulgaricus
2	LB6 Serisi	Saf Endüstriyel Gerinim	Bulgaristan	Lb. bulgaricus,
3	ATCC 11842 ·	Saf Endüstriyel Gerinim	cesaret	Lb. bulgaricus
4	Küçük karga	Yoğurt	ABD	Lb. bulgaricus, diğer canlı kültür
5	E22 Serisi	Yoğurt	ABD	Lb. bulgaricus, diğer canlı kültür
6	Arjantin	Yoğurt	ABD	Limosilactobacillus reuteri
1lb. = Lactobacillus

Tablo 1: Probiyotik suşlar. Tablo, bu çalışmada kullanılan probiyotik suşları listeler.

2. LAB kültürlerinin aktivasyonu ve kalite kontrolü için protokol

1. LAB suşlarının hazırlanmış gliserol stoğunu (2 mL santrifüj tüplerinde) -80 °C ultra düşük dondurucudan alın ve kullanmadan önce çözülmelerine izin vermeyin.
2. Santrifüj tüplerinin açıklığını% 70 alkolle temizleyin ve dezenfekte edin ve kullanmadan önce hafifçe vorteks.
3. Santrifüj tüplerinden taze 2 mL MRS test tüplerine stok LAB kültürünün yaklaşık 250 μL (0,25 mL) pipeti.
4. Yavaşça vorteks, test tüplerini parafilm haline getirin ve 12-16 saat boyunca 42 ° C'de gece boyunca anaerobik olarak inkübe edin.
5. 2 mL MRS test tüplerinden bir gecede yetiştirilen kültürlerden taze 7 mL MRS test tüplerine, girdaplara yaklaşık 500 μL (0,5 mL) alın ve 12-16 saat boyunca 42 ° C'de gece boyunca anaerobik olarak inkübe edin.
6. UV görünür spektrofotometre ile 610 nm'de kültürlerin optik yoğunluğunu (OD) veya büyümesini ölçerek mikrobiyal büyümeyi değerlendirin ve 0,7 ile 0,9 arasında kabul edilebilir sonuçlar kaydedin.
7. Gece kültürlerini 7 mL MRS tüplerinden MRS ve MRCM-PYR agar plakalarına çizin ve 42 ° C'de 72 saat boyunca anaerobik olarak inkübe edin.
8. Agar plakalarından izole edilmiş kolonileri toplayın, taze 7 mL MRS test tüplerine, hafifçe vortekse aktarın ve 12-16 saat boyunca 42 ° C'de gece boyunca anaerobik olarak inkübe edin.
9. İzole edilmiş suşları içeren agar plakalarını buzdolabında bir hafta boyunca 4 ° C'de saklayın.
10. 610 nm'deki çizgili plakalardan izole edilen LAB kültürlerinin 7 mL MRS test tüplerinden OD'yi (0.7 ila 0.9 arasında) ölçün ve onaylayın ve bunları ilgili tüm deneyler için çalışma kültürleri olarak kullanın.
11. 1:10 oranını elde etmek için 9 mL pepton suyu (fizyolojik bir tampon) kullanarak son 7 mL MRS test tüplerinden yetiştirilen LAB kültürlerinin on kat seyreltilmesini (seri olarak seyreltilmiş) gerçekleştirin.
12. Son olarak, tüm fermantasyon deneyleri için uygun seri seyreltmelerden yaklaşık 250 μL (0.25 mL) alın.
13. 2.12. adımdan itibaren suşlar (250 μL) içeren suyu taze 7 mL MRS suyuna aktararak ve 16 saat boyunca 42 ° C'de anaerobik olarak inkübe ederek aktive edin.
14. LAB kültürlerinden canlı ve üstün hücre büyümesini sağlamak için 2.6-2.12 adımlarını tekrarlayarak devam edin.
    NOT: Tüm L. bulgaricus suşları taze hazırlanmış MRS suyunda aktive edildi ve daha sonra 0.7 ila 0.9 arasında bir optik bakteri büyümesi yoğunluğuna (OD_{610 nm}) ulaşmak için 16 saat boyunca 42 ° C'de anaerobik olarak inkübe edildi. Bakteriyel büyüme, 610 nm'de UV tarafından görülebilen bir spektrofotometre ile ölçüldü. Gece kültürlerinin pH değerleri, LAB fermantasyonunun organik bir son ürünü olan laktik asit üretiminin bir sonucu olarak 3.5 ila 5.3 aralığındaydı. Biyogüvenlik başlığında uygun hava akımı sirkülasyonu ve bunsen brülörün kullanımı sırasında yanıkların önlenmesi gibi güvenlik prosedürlerine uyulmuş ve gözlemlenmiştir.

Şekil 1: Laktik asit bakteri (LAB) kültürlerinin aktivasyonu için protokolün grafiksel şeması. Şema, LAB kültür suşlarının taşınması ve etkinleştirilmesi için gerekli ayrıntıları ve temel araçları sağlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Kalite kontrol protokolü ile yetiştirilen değerlendirilen LAB suşlarının hücre büyümesi, bu standart protokol olmadan yetiştirilen suşlardan anlamlı derecede farklıydı (P < 0.05). Hem L. bulgaricus hem de L. reuteri için QC protokolü çok alt kültürleme yaklaşımı kullandı (agar plakalarına çizgi çizmeden önce üç kez alt kültürleme), kontrol prosedürü ise diğer tüm koşullar sabit tutularak sadece bir kez alt kültürleme yapıldı. Koloni büyümesi de daha yüksekti ve...

Tartışmalar

Kalite kontrol protokolü ile ve protokol kullanılmadan değerlendirilen tüm suşların sonuçları aynıydı ve bu nedenle sadece suşlarla (S9 ve LB6) bağlantılı sonuçlar sunuldu. Aktif LAB suşları, yüksek yoğunluklu hücre biyokütlesi ile karakterize edilen üstün hücre büyümesine sahipti, bu nedenle test tüpü^11'de MRS fermentatif suyunun bulanık bir görünümüne neden oldu. Kültür aktivasyonundan sonra gözlenen hücre büyümesi, 42 ° C'lik bir anaerobik fermentatif sı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline Blue	Thermo Scientific	R21526	25 g
Beef extract	Research Products International	50-197-7509	500 g
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Calcium Chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500	500 g
Dextrose Anhydrous	Fisher Scientific	BP350500	500 g
D-Fructose	ACROS Organics	AC161355000	500 g
Difco agar powder	Difco	DF0812-07-1	2 kg
TPY agar	Difco	211921	500 g
Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Scientific	05-402-12	2 mL
Glycerol	Thermo Scientific	PI17904	500 mL
Infrared CO2 Incubator	Forma Scientific
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	DAW
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	E22
Lactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	RD2
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Maltose monohydrate	Fisher Scientific	M75-100	100 g
MRS broth	Neogen	50-201-5691	5 kg
Peptone No. 3	Hach	50-199-6719	500 g
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Research Products International	50-712-761	500 g
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	S220-1	1 kg
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	1 kg
Sodium pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100	100 g
Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps	Fisher Scientific	FB70125150	25 x 150 mm
Tween 80	Fisher Scientific	T164-500	500 mL
Ultra low freezer	So-Low
Uracil	ACROS Organics	AC157301000	100 g
UV- visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Evolution 201
Vortex Genie 2	Fisher Scientific
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Ethanol	Fisher Scientific	T08204K7	4 L
Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical)	Fisher Scientific	SA56-500	500 mL