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요약

유산균(LAB) 배양액의 품질관리 평가는 발효 절차를 위한 LAB 균주의 생존력과 기능성을 향상시키는 효과적인 방법으로 확인되었습니다. 이 주장을 뒷받침하기 위해 우리는 발효 및 바이오 프로세싱 절차를 위해 LAB 배양이 어떻게 활성화되고 배양되는지 설명하는 프로토콜을 개발했습니다.

초록

유산균(LAB)은 요구르트 및 치즈와 같은 발효 유제품 제조에 크게 사용되는 필수 유제품 스타터 배양입니다. LAB는 주로 발효의 주요 최종 생성물인 젖산을 생산하며, 발효식품의 관능적 특성을 부여하는 중요한 대사산물을 합성합니다. LAB는 적절한 영양 요구 사항이 충족되면 많은 환경에서 번성하는 까다로운 박테리아입니다. 식품 및 유제품 산업의 발효 응용 분야를 위한 우수한 LAB 유제품 스타터 배양에 대한 수요로 인해 모든 바이오프로세싱 작업에 실행 가능하고 활동적인 배양을 제공해야 할 필요성이 대두되었습니다. 따라서 실험실 및 유제품 가공 환경에서 LAB 배양의 실행 가능성과 향상된 기능을 보장하기 위한 표준 프로토콜의 개발은 매우 중요합니다. 약하고 스트레스를 받고 손상된 LAB 배양 세포의 소생과 관련된 문제를 해결하기 위해 LAB 균주의 회복, 세포 재생 향상 및 대사 기능 개선을 위한 두드러진 단계를 생생하게 설명하는 프로토콜이 가장 중요합니다. LAB 스타터 배양의 배양 순도, 기능 및 생존력 유지도 마찬가지로 중요합니다. 따라서 고유한 프로토콜 지침을 준수하면 발효 및 생명공학 공정에 전념하는 많은 LAB 균주의 발효 성능이 향상될 것입니다. 그 결과, 노스캐롤라이나 농업 기술 주립 대학의 식품 미생물학 및 생명공학 연구소는 선택된 LAB 균주의 활성화 및 품질 관리를 위한 표준 프로토콜을 개발하여 발효 연구에 사용되는 고기능 및 실행 가능한 LAB 배양 균주를 탄생시켰습니다. 유제품 및 식품 산업에서 사용하기 위해 이와 같은 프로토콜을 조정하고 권장하면 많은 응용 분야에서 LAB 실행 가능성과 기능을 보장하는 데 도움이 될 것입니다.

서문

유산균(LAB)은 산업적 잠재력을 가진 독특하고 다양한 박테리아의 그룹입니다. 락토바실러스 델브루키에 속하는 균주 불가리쿠스와 스트렙토코커스 써모필러스는 주로 요구르트1과 같은 발효 유제품의 유제품 스타터 배양으로 사용됩니다. 선택된 LAB 균주는 복용량이적절하게 투여될 때 인간에게 건강상의 이점을 제공하기 때문에 프로바이오틱스로 분류됩니다2. 유산균은 또한 그람 양성, 포자 형성이 아닌, 호흡이 없지만 일반적으로 주요 발효 생성물로서 젖산의 생산을 특징으로 하는 공기내성 미생물입니다. LAB는 또한 광범위한 식품 매개 병원체4를 억제할 수 있는 유기산, 박테리오신 및 기타 항균 화합물3과 같은 필수 대사산물을 합성합니다. 탄수화물 이화 작용의 주요 최종 생성물이자 LAB 발효의 부산물인 젖산은 항균 특성을 가지고 있으며 식품 생물 보존 응용 분야에 잠재적으로 유용한 유기 대사 산물입니다 3,5,6. 또한 LAB에서 생산 된 유기산은 식품의 풍미, 질감 및 향을 부여하여 결과적으로 전반적인 관능적 특성을 향상시킵니다 5,6. LAB의 뚜렷한 영양 요구 사항과 유비쿼터스 특성이 결합되어 궁극적으로 박테리아가 유제품 기반 식품, 발효 식품, 야채 및 인간의 장7과 같은 다양한 환경에서 쉽게 번성할 수 있도록합니다.

요구르트 생산 및 다양한 유제품 응용 분야 8,9를 위한 LAB의 스타터 배양에 대한 수요가 증가하고 있으므로 LAB 균주 배양뿐만 아니라 동결건조 및 분리 균주의 활성화에서 중요한 관심과 확립된 과학 기술을 준수해야 합니다. 따라서 식품 미생물학 및 생명 공학 실험실은 발효 유제품 및 요구르트 생산에 사용되는 산업 스타터 배양에서 분리 된 LAB 균주의 활성화, 우수한 성장 및 발효 특성을 목표로하는 적절한 기술 개발에 적극적으로 참여하고 있습니다. 또한, 산업적으로 생산된 LAB 배양균주는 동결건조 및 냉동보관 등의 보존활성을 거쳐 이들이 겪게 되는 냉 충격 과정의 결과로 세포 스트레스 및 손상을 일으킨다는 점도 주목할 만하다(10). 단리된 식품 또는 동결건조 제품으로부터 수득된 LAB 균주의 제한, 생존성 도전 및 기능성 향상에 있어서, 이들의 발효 특성을 향상시키기 위한 품질 관리의 한 형태로서 이들 배양물을 적절하게 활성화시키는 것이 중요하다8. 이 연구의 목표는 궁극적으로 생존 가능한 LAB 성장을 촉진하고 LAB 균주의 발효 성능과 대사 기능을 향상시키는 L. delbrueckii subsp. bulgaricus 배양 균주의 활성화 및 성장을 위한 사내 품질 관리 프로토콜을 개발하는 것이었습니다. 이 프로토콜은 궁극적으로 발효 연구뿐만 아니라 산업 목적 또는 바이오 프로세싱 작업을위한 다른 LAB 균주의 배양을 위해 (최적의 성장 배지 및 적절한 배양 조건 사용) 적용될 수 있습니다. 따라서 이 LAB 활성화 및 품질 관리 프로토콜은 우수한 실행 가능한 유제품 스타터 배양을 얻고 글로벌 유제품 및 식품 산업의 다양한 응용 분야에서 잠재적으로 기능할 수 있도록 보장합니다.

프로토콜

1. 일반 재료 및 방법

  1. 락토바실러스 델브루에키 아종의 출처 불가리쿠스
    1. 신뢰할 수있는 출처에서 L. 불가리쿠스 균주를 얻으십시오.
      참고: 이 연구에서는 총 5개의 L. 불가리쿠스 균주가 품질 관리 연구에 사용되었습니다(표 1). 발효유 제품의 산업 생산을위한 동결 건조 L. bulgaricus 의 두 가지 균주는 불가리아 플 로브 디프에있는 식품 기술 대학의 생명 공학과 인 Albert Krastanov 박사에 의해 제공되었습니다. 미국 시장에서 이용 가능한 상업용 요구르트 제품에서 분리 된 2 개의 균주는 노스 캐롤라이나 A & T 주립 대학의 식품 미생물학 및 생명 공학 실험실의 -80 ° C 재고에서 얻었으며 동결 건조 된 균주는 공급 업체 C에 의해 공급되었습니다. 모든 LAB 균주는 추가 사용이 될 때까지 -80°C에서 유지하였다. 또 다른 박테리아 균주 (Limosilactobacillus reuteri)는 노스 캐롤라이나 A & T 주립 대학의 식품 미생물학 및 생명 공학 실험실의 -80 ° C 재고로부터 얻어졌으며 또한 평가되었다.
  2. 표준 L. MRS 발효액 배지
    1. 1 L의 탈이온수(DW)에 55 g의 MRS 및 0.5 g의 L-시스테인을 완전히 용해시켜 드만, 로고사 샤프(MRS) 배지를 제조한다.
    2. 준비된 MRS 용액 7mL와 2mL를 각각 시험관에 분주하고 121°C에서 15분 동안 오토클레이브한 후 실온(RT)에서 냉각합니다.
  3. MRS 한천 배지
    1. 1L의 DW에 55g의 MRS 및 0.5g의 L- 시스테인을 완전히 용해시켜 MRS 한천 배지를 제조합니다. 한천 분말(15g)을 넣고 한천 배지를 121°C에서 15분 동안 멸균한 다음 수조에서 식힌다.
    2. 새로 준비된 모든 배지를 멸균 페트리 접시에 붓고 더 필요할 때까지 4 ° C에서 보관하십시오.
  4. 변형 강화 클로스트리듐 중간-피루브산(mRCM-PYR)
    1. Oyeniran et al.13 및 Nwamaioha 및 Ibrahim 18에 따라 강화 클로스트리듐 배지를 최적화하여 L. 불가리쿠스의 선택성 및 정확한 열거를 위해 펩톤 #3 10g, 쇠고기 추출물 10g, 효모 추출물 5g, 염화나트륨 5g, 아세트산나트륨 3g, 이염기성 인산칼륨 2g, DW 1L에 우라실 0.1g, 염화칼슘 0.25g, 덱스트로스 5g, 과당 5g, 맥아당 10g, 피루브산나트륨 2g, 트윈 80 0.2%, L-시스테인 0.5g.
    2. 0.008% 아닐린 블루와 15 g의 한천을 첨가하기 전에 6 N HCl을 사용하여 용액의 최종 pH(6.0 ± 0.2)를 조정한다. 배지를 121°C에서 15분 동안 오토클레이브하고, 수조에서 냉각시키고, 멸균된 페트리 접시에 붓는다. 새로 준비된 모든 배지는 필요할 때까지 4 ° C의 멸균 페트리 접시에 보관하십시오.
  5. LAB 배양물의 글리세롤 스톡
    1. 동일한 부피의 DW에 100% 글리세롤을 희석하여 글리세롤 스톡(50% 글리세롤)을 제조하고 건식 멸균 사이클을 사용하여 100°C에서 30분 동안 멸균합니다. 글리세롤 스톡을 RT로 식히고 추가 사용을 위해 무균 상태로 보관하십시오.
    2. 하룻밤 배양에서 박테리아 성장(개발된 QC 프로토콜을 사용하여 얻은 L. 불가리쿠스의 단일 콜로니)을 사용하십시오.
    3. 밤새 배양된 500μL를 2mL 원심분리 튜브에 50% 글리세롤로 피펫팅하고 부드럽게 혼합합니다. LAB 배양물을 함유하는 글리세롤 스톡을 동결시키고 필요할 때까지 -80°C의 초저온에서 보관한다.
      참고: LAB 배양의 품질 관리 및 활성화를 위한 프로토콜의 그래픽 체계가 그림 1에 나와 있습니다.
아니요제품 코드견본근원1로 표시된 박테리아 조성
1시즌 9순수 산업용 변형불가리아Lb. 불가리쿠스
2LB6순수 산업용 변형불가리아파운드 불가리쿠스,
3ATCC 11842순수 산업용 변형증권 시세 표시기Lb. 불가리쿠스
4갈까마귀요구르트미국Lb. 불가리쿠스, 다른 라이브 문화
5E22요구르트미국Lb. 불가리쿠스, 다른 라이브 문화
6로이테리요구르트미국리모실락토바실러스 루테리
1파운드 =락토바실러스

표 1: 프로바이오틱스 균주. 이 표에는 이 연구에 사용된 프로바이오틱스 균주가 나열되어 있습니다.

2. LAB 배양의 활성화 및 품질 관리를 위한 프로토콜

  1. -80°C 초저온 냉동고에서 준비된 LAB 균주(2mL 원심분리 튜브에 담겨 있음)의 글리세롤 재고를 꺼내 사용하기 전에 해동하지 마십시오.
  2. 원심 분리기 튜브의 입구를 70 % 알코올로 청소 및 소독하고 사용하기 전에 부드럽게 와동하십시오.
  3. 원심분리 튜브에서 약 250 μL (0.25 mL)의 스톡 LAB 배양물을 새로운 2 mL MRS 테스트 튜브로 피펫팅합니다.
  4. 부드럽게 소용돌이치고, 시험관을 파라 필름하고, 42 ° C에서 12-16 시간 동안 밤새 혐기성 배양합니다.
  5. 2mL MRS 시험관에서 하룻밤 동안 성장한 배양물에서 약 500μL(0.5mL)를 새로운 7mL MRS 시험관, 와류로 가져와 42°C에서 12-16시간 동안 밤새 혐기성 배양합니다.
  6. UV-가시광선 분광광도계로 610nm에서 배양물의 광학 밀도 (OD) 또는 성장을 측정하여 미생물 성장을 평가하고 0.7과 0.9 사이의 허용가능한 결과를 기록합니다.
  7. 7mL MRS 튜브에서 밤새 배양한 것을 MRS 및 MRCM-PYR 한천 플레이트에 걸고 42°C에서 72시간 동안 혐기성 배양합니다.
  8. 한천 플레이트에서 분리된 콜로니를 선택하여 신선한 7mL MRS 시험관으로 옮기고 부드럽게 소용돌이치고 42°C에서 12-16시간 동안 밤새 혐기성 배양합니다.
  9. 분리된 균주가 포함된 한천 플레이트를 4°C에서 일주일 동안 냉장고에 보관한다.
  10. 610nm에서 줄무늬 플레이트에서 분리된 LAB 배양물의 7mL MRS 시험관에서 OD(0.7에서 0.9 사이)를 측정 및 확인하고 이를 모든 관련 실험을 위한 작업 배양으로 사용합니다.
  11. 성장한 LAB 배양물을 최종 7mL MRS 시험관에서 펩톤수(생리학적 완충액) 9mL를 사용하여 10배 희석(연속 희석)하여 1:10 비율을 얻습니다.
  12. 마지막으로, 모든 발효 실험에 적합한 연속 희석액으로부터 약 250 μL (0.25 mL)를 취한다.
  13. 2.12단계의 균주(250μL)가 포함된 액체를 신선한 7mL MRS 브로스에 옮기고 42°C에서 16시간 동안 혐기배양하여 활성화합니다.
  14. LAB 배양에서 생존 가능하고 우수한 세포 성장을 보장하기 위해 2.6-2.12단계를 계속 반복합니다.
    참고: 모든 L. 불가리쿠스 균주를 새로 준비된 MRS 배지에서 활성화시킨 다음, 0.7과 0.9 사이의 박테리아 성장의 광학 밀도(OD610 nm)에 도달하기 위해 42°C에서 16시간 동안 혐기배양하였다. 박테리아 성장은 610 nm에서 UV-가시광선 분광광도계로 측정하였다. 하룻밤 배양의 pH 값은 LAB 발효의 유기 최종 생성물인 젖산의 생산의 결과로 3.5 내지 5.3의 범위였다. 생물 안전 후드의 적절한 공기 흐름 순환 및 분젠 버너 사용 중 화상 방지와 같은 안전 절차를 준수하고 준수했습니다.

figure-protocol-4926
그림 1: 유산균(LAB) 배양 활성화를 위한 프로토콜의 그래픽 체계. 이 계획은 LAB 배양 균주의 취급 및 활성화에 필요한 세부 정보와 기본 도구를 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

품질 관리 프로토콜로 배양된 평가된 LAB 균주의 세포 성장은 이 표준 프로토콜 없이 배양된 균주와 유의하게 달랐습니다(P < 0.05). L. bulgaricus와 L. reuteri 모두에 대한 QC 프로토콜은 다중 계류 배양 접근법 (한천 플레이트에 줄무늬를 짓기 전에 3 번 계대 배양)을 사용하는 반면, 제어 절차는 다른 모든 조건이 일정하게 유지되는 상태에서 한 번만 계대 배양을 수행했습니다. 콜로니 성장?...

토론

품질 관리 프로토콜로 평가 된 모든 균주의 결과와 프로토콜을 사용하지 않은 결과는 동일했기 때문에 균주 (S9 및 LB6)에만 연결된 결과가 제시되었습니다. 활성화된 LAB 균주는 높은 강도의 세포 바이오매스를 특징으로 하는 우수한 세포 성장을 가졌고, 따라서, 시험관(11)에서 MRS 발효액의 혼탁한 외관을 야기하였다. 배양 활성화 후 관찰된 세포 성장은 42°C의 혐기성 발효 온도에...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 출판물은 보조금 번호 NC에 의해 가능해졌습니다. X-267-5-12-170-1 국립 식량 농업 연구소 (NIFA) 및 NIZO 식품 연구 BV, 네덜란드, Jarrow Formulas, 미국, 노스 캐롤라이나 농업 및 기술 주립 대학의 가족 및 소비자 과학부 및 농업 연구소 (Greensboro, NC, USA 27411). 이 작업은 1890 년 역량 강화 프로그램 보조금 번호 (2020-38821-31113 / 프로젝트 등록 번호 021765)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 이 연구는 또한 DCM # 577 / 17.08.2018에 의해 승인 된 국가 연구 프로그램 '강력한 바이오 경제와 삶의 질을위한 건강 식품'에 따라 불가리아 교육 과학부에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Aniline BlueThermo ScientificR2152625 g
Beef extractResearch Products International50-197-7509500 g
Yeast extractFisher ScientificBP1422-500500 g
Calcium Chloride dihydrateFisher ScientificC79-500500 g
Dextrose AnhydrousFisher ScientificBP350500500 g
D-FructoseACROS OrganicsAC161355000500 g
Difco agar powderDifcoDF0812-07-12 kg
TPY agarDifco211921500 g
Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)Fisher Scientific05-402-122 mL
GlycerolThermo ScientificPI17904500 mL
Infrared CO2 IncubatorForma Scientific
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusBulgariaS9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusBulgariaLB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusFood Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)DAW
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusFood Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)E22
Lactobacillus reuteriBiogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)RD2
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-AldrichC6852-25G25 g
Maltose monohydrateFisher ScientificM75-100100 g
MRS brothNeogen50-201-56915 kg
Peptone No. 3Hach50-199-6719500 g
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)Research Products International50-712-761500 g
Sodium acetate trihydrateFisher ScientificS220-11 kg
Sodium chlorideFisher ScientificBP358-11 kg
Sodium pyruvateFisher ScientificBP356-100100 g
Test Tubes with Rubber-Lined Screw CapsFisher ScientificFB7012515025 x 150 mm
Tween 80Fisher ScientificT164-500500 mL
Ultra low freezerSo-Low
UracilACROS OrganicsAC157301000100 g
UV- visible spectrophotometerThermo Fisher ScientificEvolution 201
Vortex Genie 2Fisher Scientific
Yeast extractFisher ScientificBP1422-500500 g
EthanolFisher ScientificT08204K74 L
Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical)Fisher Scientific SA56-500500 mL

참고문헌

  1. Karakas-Sen, A., Karakas, E. Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk. Bioscience Journal. 34 (2), 385-399 (2018).
  2. Martin, R., Langella, P. Emerging health concepts in the probiotics field: Streamlining the definitions. Frontiers in Microbiology. 10, 1047 (2019).
  3. Sadishkumar, V., Jeevaratnam, K. In vitro probiotic evaluation of potential antioxidant lactic acid bacteria isolated from idli batter fermented with Piper betle leaves. International Journal of Food Science & Technology. 52 (2), 329-340 (2017).
  4. Ayivi, R. D., et al. Lactic acid bacteria: Food safety and human health applications. Dairy. 1 (3), 202-232 (2020).
  5. Quinto, E. J., et al. Probiotic lactic acid bacteria: A review. Food and Nutrition Sciences. 5 (18), 1765-1775 (2014).
  6. Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., Ibrahim, S. A. Cultivation media for lactic acid bacteria used in dairy products. Journal of Dairy Research. 86 (4), 490-502 (2019).
  7. Bintsis, T. Lactic acid bacteria as starter cultures: An update in their metabolism and genetics. Aims Microbiology. 4, 665-684 (2018).
  8. Shao, Y., Gao, S., Guo, H., Zhang, H. Influence of culture conditions and preconditioning on survival of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus ND02 during lyophilization. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1270-1280 (2014).
  9. Aryana, K. J., Olson, D. W. A 100-year review: Yogurt and other cultured dairy products. Journal of Dairy Science. 100 (12), 9987-10013 (2017).
  10. Kandil, S., El Soda, M. Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains. Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).
  11. Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC). Processes. 8 (10), 1321 (2020).
  12. Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment. Frontiers in Microbiology. 6, 1284 (2015).
  13. Oyeniran, A., et al. A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture. Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).
  14. Iguchi, A., et al. Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).
  15. Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review. Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).
  16. Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri. Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , 17-23 (2009).
  17. Gyawali, R., et al. A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).
  18. Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).

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