O cultivo, crescimento e viabilidade de bactérias do ácido lático: uma perspectiva de controle de qualidade

Resumo

A avaliação do controle de qualidade de culturas de bactérias do ácido lático (LAB) foi confirmada como uma maneira eficaz de melhorar a viabilidade e a funcionalidade das cepas LAB para procedimentos de fermentação. Para reforçar essa afirmação, desenvolvemos um protocolo que elucida como as culturas LAB são ativadas e cultivadas para procedimentos de fermentação e bioprocessamento.

Resumo

As bactérias do ácido láctico (LAB) são culturas iniciais de laticínios essenciais que são significativamente empregadas para a fabricação de produtos lácteos fermentados, como iogurte e queijo. Os LAB produzem predominantemente ácido láctico como um dos principais produtos finais da fermentação e sintetizam metabolitos importantes que transmitem as características organolépticas dos produtos alimentares fermentados. LAB são bactérias fastidiosas que prosperam em muitos ambientes quando os requisitos nutricionais adequados são atendidos. A demanda por culturas iniciais de laticínios LAB superiores para aplicações de fermentação na indústria de alimentos e laticínios resultou na necessidade de fornecer culturas viáveis e ativas para todas as operações de bioprocessamento. O desenvolvimento de um protocolo padrão para garantir a viabilidade e a funcionalidade aprimorada das culturas LAB no laboratório, bem como nos ambientes de processamento de laticínios, é, portanto, muito crítico. Ao abordar as preocupações ligadas à ressuscitação de células de cultura LAB fracas, estressadas e lesadas, um protocolo que descreve vividamente os passos salientes para se recuperar, melhorar a regeneração celular e melhorar a funcionalidade metabólica das cepas LAB é de extrema importância. A manutenção da pureza, funcionalidade e viabilidade da cultura para culturas iniciais do LAB também é fundamental. Portanto, a adesão a uma diretriz de protocolo única resultará na promoção do desempenho de fermentação para muitas cepas LAB dedicadas a processos de fermentação e biotecnologia. Como resultado, o Laboratório de Microbiologia e Biotecnologia de Alimentos da Universidade Estadual Técnica e Agrícola da Carolina do Norte desenvolveu um protocolo padrão para a ativação e controle de qualidade de cepas LAB selecionadas que resultou em cepas de cultura LAB altamente funcionais e viáveis empregadas para pesquisa de fermentação. A adaptação e recomendação de um protocolo como este para uso na indústria de laticínios e alimentos ajudará a garantir a viabilidade e a funcionalidade do LAB para muitas aplicações.

Introdução

As bactérias do ácido láctico (LAB) são um grupo de bactérias excepcionalmente diversas que têm potencial industrial. Cepas pertencentes a Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus e Streptococcus thermophilus são usadas principalmente como culturas iniciais de laticínios para produtos alimentícios lácteos fermentados, como iogurte¹. Cepas LAB selecionadas também são classificadas como probióticos, pois conferem benefícios à saúde dos seres humanos quando as dosagens são adequadamente administradas². As bactérias do ácido láctico também são microrganismos gram-positivos, não formadores de esporos, não respiratórios, mas aerotolerantes, que geralmente são caracterizados pela produção de ácido láctico como um produto chave de fermentação. O LAB também sintetiza metabólitos essenciais, por exemplo, ácidos orgânicos, bacteriocinas e outros compostos antimicrobianos³ que podem inibir um amplo espectro de patógenos de origem alimentar⁴. O ácido lático, um dos principais produtos finais do catabolismo de carboidratos e um subproduto da fermentação LAB, é um metabólito orgânico que possui propriedades antimicrobianas e é potencialmente útil para aplicações de biopreservação de alimentos ^3,5,6. Além disso, os ácidos orgânicos produzidos pelo LAB conferem o sabor, a textura e o aroma dos alimentos, aumentando assim suas propriedades organolépticas gerais ^5,6. Os requisitos nutricionais distintos do LAB, juntamente com sua natureza onipresente, permitem que as bactérias prosperem facilmente em diferentes ambientes, como alimentos à base de laticínios, alimentos fermentados, vegetais, bem como no intestino humano⁷.

Há uma demanda crescente por culturas iniciais do LAB para a produção de iogurte e muitas aplicações lácteas diversas^8,9, portanto, a atenção crítica e as técnicas científicas estabelecidas devem ser seguidas, no cultivo de cepas LAB, bem como na ativação de cepas liofilizadas e isoladas^, pois essa atividade é vital para o melhor desempenho da fermentação. O laboratório de Microbiologia e Biotecnologia de Alimentos, portanto, se envolve ativamente no desenvolvimento de tecnologia adequada voltada para a ativação, crescimento superior e fermentação característicos de cepas LAB isoladas de produtos lácteos fermentados, bem como de culturas iniciais industriais empregadas para a produção de iogurte. Além disso, destaca-se que as cepas de cultura LAB produzidas industrialmente passam por atividades conservantes como liofilização e armazenamento congelado, causando estresse e lesão celular, como resultado do processo de choque a frio a que são submetidas¹⁰. Ao limitar, os desafios de viabilidade e melhorar a funcionalidade de cepas LAB obtidas de produtos alimentícios isolados ou produtos liofilizados, é importante ativar adequadamente essas culturas como forma de controle de qualidade para aprimorar sua característica fermentativa⁸. Neste estudo, o objetivo foi desenvolver um protocolo interno de controle de qualidade para a ativação e crescimento de cepas de cultura de L. delbrueckii subsp. bulgaricus que, em última análise, promovessem o crescimento viável do LAB, bem como melhorassem o desempenho de fermentação e a funcionalidade metabólica das cepas LAB. Este protocolo poderia, em última análise, ser adaptado (usando meios de crescimento ideais e condições de cultivo apropriadas) para o cultivo de outras cepas LAB para pesquisa de fermentação, bem como para fins industriais ou operações de bioprocessamento. Este protocolo de ativação e controle de qualidade LAB garantirá, portanto, que culturas iniciais de laticínios viáveis superiores sejam obtidas e potencialmente funcionais para diversas aplicações na indústria global de laticínios e alimentos.

Protocolo

1. Materiais e métodos gerais

1. Fonte de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
   1. Obtenha cepas de L. bulgaricus de fontes confiáveis.
      NOTA: Neste estudo, um total de cinco (5) cepas de L. bulgaricus foram utilizadas no estudo de controle de qualidade (Tabela 1). Duas cepas de L. bulgaricus liofilizados para a produção industrial de produtos lácteos fermentados foram fornecidas pelo Dr. Albert Krastanov, Departamento de Biotecnologia da Universidade de Tecnologias Alimentares, Plovdiv, Bulgária. Duas cepas isoladas de produtos comerciais de iogurte disponíveis no mercado dos EUA foram obtidas do estoque de -80 °C do laboratório de Microbiologia e Biotecnologia de Alimentos da North Carolina A & T State University e uma cepa liofilizada foi fornecida por um fornecedor C. Todas as cepas de LAB foram mantidas a -80 °C até o uso posterior. Outra cepa bacteriana (Limosilactobacillus reuteri) foi obtida do estoque de -80 °C do laboratório de Microbiologia e Biotecnologia de Alimentos da North Carolina A & T State University também foi avaliada.
2. Meio de caldo de fermentação padrão L. MRS
   1. Preparar deMan, meio Rogosa Sharpe (MRS) dissolvendo completamente 55 g de MRS e 0,5 g de L-cisteína em 1 L de água deionizada (DW).
   2. Dispensar 7 mL e 2 mL da solução de MRS preparada em tubos de ensaio, respectivamente, em autoclave a 121 °C por 15 min e, em seguida, esfriar à temperatura ambiente (RT).
3. Meio ágar MRS
   1. Preparar o meio de ágar MRS dissolvendo completamente 55 g de MRS e 0,5 g de L-cisteína em 1 L de DW. Adicionar o pó de ágar (15 g), esterilizar o meio de ágar a 121 °C durante 15 minutos e, em seguida, arrefecê-lo em banho-maria.
   2. Deite todos os meios acabados de preparar em placas de Petri estéreis e guarde-os a 4 °C até que seja necessário.
4. Médio-piruvato clostridial reforçado modificado (mRCM-PYR)
   1. Otimizar um meio clostridial reforçado de acordo com Oyeniran et al.13 e Nwamaioha e Ibrahim¹⁸, para seletividade e enumeração precisa de L. bulgaricus pela dissolução de 10 g de peptona #3, ¹⁰ g de extrato de carne bovina, 5 g de extrato de levedura, 5 g de cloreto de sódio, 3 g de acetato de sódio, 2 g de fosfato de potássio dibásico_, 0,1 g de uracila, 0,25 g de cloreto de cálcio, 5 g de dextrose, 5 g de frutose, 10 g de maltose, 2 g de piruvato de sódio, 0,2% Tween 80 e 0,5 g de L-cisteína em 1 L de DW.
   2. Ajustar o pH final (6,0 ± 0,2) da solução utilizando 6 N HCl antes da adição de azul de anilina a 0,008% e 15 g de ágar. Autoclave o meio a 121 °C por 15 min, esfrie em banho-maria e despeje em placas de Petri estéreis. Conservar todos os meios preparados na hora em placas de Petri estéreis a 4 °C até que seja necessário.
5. Estoque de glicerol de culturas LAB
   1. Preparar os estoques de glicerol (50% de glicerol) diluindo 100% de glicerol no mesmo volume de DW e esterilizar a 100 °C por 30 min usando um ciclo de esterilização seco. Arrefecer as existências de glicerol para RT e armazená-los assepticamente para uso posterior.
   2. Use o crescimento bacteriano (uma única colônia de L. bulgaricus obtida usando o protocolo QC desenvolvido) a partir de culturas noturnas.
   3. Pipetar 500 μL das culturas noturnas em 50% de glicerol em um tubo de centrífuga de 2 mL e misturá-las suavemente. Congelar e armazenar o stock de glicerol que contém as culturas LAB a uma temperatura ultra-baixa de -80 °C até ser necessário.
      NOTA: Um esquema gráfico do protocolo para o controle de qualidade e ativação de culturas LAB é mostrado na Figura 1.

Não	Código do produto	Amostra	Fonte	Composição bacteriana como rotulado1
1	S9	Cepa Industrial Pura	Bulgária	Lb. bulgaricus
2	LB6	Cepa Industrial Pura	Bulgária	Lb. bulgaricus,
3	ATCC 11842	Cepa Industrial Pura	ATCC	Lb. bulgaricus
4	DAW	Iogurte	EUA	Lb. bulgaricus, outra cultura viva
5	E22	Iogurte	EUA	Lb. bulgaricus, outra cultura viva
6	Reuteri •	Iogurte	EUA	Limosilactobacillus reuteri
1lb. = lactobacilos

Tabela 1: Cepas probióticas. A tabela lista as cepas probióticas utilizadas neste estudo.

2. Protocolo para a ativação e controle de qualidade de culturas LAB

1. Pegue o estoque de glicerol preparado de cepas LAB (em tubos de centrífuga de 2 mL) do congelador ultrabaixo de -80 °C e não permita que elas descongelem antes do uso.
2. Limpe e desinfete a abertura dos tubos de centrífuga com álcool a 70% e desinfete suavemente antes do uso.
3. Pipetar cerca de 250 μL (0,25 mL) da cultura LAB de estoque dos tubos de centrífuga para tubos de ensaio MRS frescos de 2 mL.
4. Vórtice suave, parafilme os tubos de ensaio e incubá-los anaerobicamente durante a noite a 42 °C durante 12-16 h.
5. Tome cerca de 500 μL (0,5 mL) das culturas cultivadas durante a noite dos tubos de ensaio MRS de 2 mL em tubos de ensaio MRS frescos de 7 mL, vórtice, e incube-os anaerobicamente durante a noite a 42 °C por 12-16 h.
6. Avaliar o crescimento microbiano medindo a densidade óptica (OD) ou o crescimento das culturas a 610 nm com um espectrofotômetro UV-visível e registrar resultados aceitáveis entre 0,7 e 0,9.
7. Estenda as culturas noturnas dos tubos MRS de 7 mL para as placas de ágar MRS e MRCM-PYR e incube-as anaerobicamente por 72 h a 42 °C.
8. Colher colónias isoladas das placas de ágar, transferi-las para tubos de ensaio MRS frescos de 7 ml, vórtice suave e incubá-las anaerobicamente durante a noite a 42 °C durante 12-16 h.
9. Conservar as placas de ágar que contenham as estirpes isoladas a 4 °C no frigorífico durante uma semana.
10. Medir e confirmar a DO (entre 0,7 e 0,9) dos tubos de ensaio MRS de 7 mL das culturas LAB isoladas das placas estriadas a 610 nm e usá-las como culturas de trabalho para todos os experimentos relacionados.
11. Realizar diluições de dez vezes (diluídas em série) das culturas LAB cultivadas a partir dos tubos de ensaio MRS finais de 7 mL usando 9 mL de água peptona (um tampão fisiológico) para obter uma proporção de 1:10.
12. Finalmente, tomar cerca de 250 μL (0,25 mL) de diluições seriadas apropriadas para todos os experimentos de fermentação.
13. Activar o caldo contendo estirpes (250 μL) a partir do passo 2.12, transferindo-as para caldo MRS fresco de 7 ml e incubando-as anaerobicamente a 42 °C durante 16 h.
14. Continue repetindo as etapas 2.6-2.12 para garantir o crescimento celular viável e superior a partir de culturas LAB.
    NOTA: Todas as cepas de L. bulgaricus foram ativadas no caldo MRS recém-preparado e incubadas anaerobicamente a 42 °C por 16 h, a fim de atingir uma densidade óptica (OD_{610 nm}) de crescimento bacteriano entre 0,7 e 0,9. O crescimento bacteriano foi medido com espectrofotômetro UV-visível a 610 nm. Os valores de pH das culturas noturnas estavam na faixa de 3,5 a 5,3 como resultado da produção de ácido lático, um produto final orgânico da fermentação LAB. Procedimentos de segurança, como a circulação adequada do fluxo de ar no exaustor de biossegurança e evitar queimaduras durante o uso do queimador de bunsen, foram aderidos e observados.

Figura 1: Esquema gráfico do protocolo para ativação de culturas de bactérias do ácido lático (LAB). O esquema fornece detalhes e os instrumentos básicos necessários para o manuseio e ativação de cepas de cultura LAB. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

O crescimento celular das cepas LAB avaliadas cultivadas com o protocolo de controle de qualidade foi significativamente diferente (P < 0,05) do que as cepas cultivadas sem esse protocolo padrão. O protocolo de CQ para L. bulgaricus e L. reuteri empregou uma abordagem multi-subcultura (subculturação três vezes antes de estrias em placas de ágar), enquanto o procedimento de controle teve a subcultura feita apenas uma vez com todas as outras condições mantidas constantes. O crescimento da colônia ...

Discussão

Os resultados de todas as cepas avaliadas com o protocolo de controle de qualidade e sem a utilização do protocolo foram os mesmos e, como tal, foram apresentados resultados vinculados apenas às cepas (S9 e LB6). As cepas LAB ativadas apresentaram crescimento celular superior que se caracterizou por uma alta intensidade de biomassa celular, ocasionando, portanto, uma aparência turva do caldo fermentativo MRS no tubo de ensaio¹¹. O crescimento celular observado após a ativação da cultura foi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline Blue	Thermo Scientific	R21526	25 g
Beef extract	Research Products International	50-197-7509	500 g
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Calcium Chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500	500 g
Dextrose Anhydrous	Fisher Scientific	BP350500	500 g
D-Fructose	ACROS Organics	AC161355000	500 g
Difco agar powder	Difco	DF0812-07-1	2 kg
TPY agar	Difco	211921	500 g
Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Scientific	05-402-12	2 mL
Glycerol	Thermo Scientific	PI17904	500 mL
Infrared CO2 Incubator	Forma Scientific
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	DAW
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	E22
Lactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	RD2
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Maltose monohydrate	Fisher Scientific	M75-100	100 g
MRS broth	Neogen	50-201-5691	5 kg
Peptone No. 3	Hach	50-199-6719	500 g
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Research Products International	50-712-761	500 g
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	S220-1	1 kg
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	1 kg
Sodium pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100	100 g
Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps	Fisher Scientific	FB70125150	25 x 150 mm
Tween 80	Fisher Scientific	T164-500	500 mL
Ultra low freezer	So-Low
Uracil	ACROS Organics	AC157301000	100 g
UV- visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Evolution 201
Vortex Genie 2	Fisher Scientific
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Ethanol	Fisher Scientific	T08204K7	4 L
Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical)	Fisher Scientific	SA56-500	500 mL