הטיפוח, הגדילה והכדאיות של חיידקי חומצה לקטית: נקודת מבט של בקרת איכות

Summary

הערכת בקרת האיכות של תרביות חיידקי חומצה לקטית (LAB) אושרה כדרך יעילה לשפר את הכדאיות והפונקציונליות של זני LAB להליכי תסיסה. כדי לחזק טענה זו, פיתחנו פרוטוקול המבהיר כיצד תרביות LAB מופעלות ומעובדות לצורך תהליכי תסיסה ועיבוד ביולוגי.

Abstract

חיידקי חומצה לקטית (LAB) הם תרביות חלב חיוניות המשמשות באופן משמעותי לייצור מוצרי חלב מותססים כגון יוגורט וגבינה. LAB מייצרים בעיקר חומצה לקטית כתוצר סופי עיקרי של תסיסה, והם מסנתזים מטבוליטים חשובים המקנים את המאפיינים האורגנולפטיים של מוצרי מזון מותססים. LAB הם חיידקים חזקים שמשגשגים בסביבות רבות כאשר דרישות תזונתיות נאותות מתמלאות. הדרישה לתרביות התחלתיות מעולות של LAB ליישומי תסיסה בתעשיית המזון ומוצרי החלב, הביאה לצורך לספק תרביות בנות קיימא ופעילות לכל פעולות העיבוד הביולוגי. לפיכך, פיתוח פרוטוקול סטנדרטי להבטחת הכדאיות והפונקציונליות המשופרת של תרביות LAB במעבדה, כמו גם בסביבות עיבוד חלב, הוא קריטי מאוד. במתן מענה לחששות הקשורים להחייאת תאי תרבית LAB חלשים, לחוצים ופצועים, פרוטוקול המתווה בצורה חיה צעדים בולטים להתאוששות, שיפור התחדשות התאים ושיפור התפקוד המטבולי של זני LAB הוא בעל חשיבות עליונה. גם השמירה על טוהר התרבית, הפונקציונליות והכדאיות של תרביות התחלתיות LAB היא קריטית. לכן, הקפדה על הנחיית פרוטוקול ייחודית תביא לקידום ביצועי התסיסה עבור זני LAB רבים המוקדשים לתהליכי תסיסה וביוטכנולוגיה. כתוצאה מכך, המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון באוניברסיטת צפון קרוליינה לחקלאות וטכנולוגיה פיתחה פרוטוקול סטנדרטי להפעלה ובקרת איכות של זני LAB נבחרים, שהביא לזני תרבית LAB פונקציונליים וברי קיימא ביותר המשמשים למחקר תסיסה. ההתאמה וההמלצה של פרוטוקול כגון זה לשימוש בתעשיית החלב והמזון תסייע להבטיח את הכדאיות והפונקציונליות של LAB עבור יישומים רבים.

Introduction

חיידקי חומצה לקטית (LAB) הם קבוצה של חיידקים מגוונים באופן ייחודי שיש להם פוטנציאל תעשייתי. זנים השייכים ל-Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus ו-Streptococcus thermophilus משמשים בעיקר כתרביות חלב למוצרי חלב מותססים כגון יוגורט¹. זני LAB נבחרים מסווגים גם כפרוביוטיקה מכיוון שהם מעניקים יתרונות בריאותיים לבני אדם כאשר המינונים ניתנים^{כראוי 2}. חיידקי חומצה לקטית הם גם מיקרואורגניזמים גראם חיוביים, לא יוצרי נבגים, לא נושמים אך אירוסובלניים המאופיינים בדרך כלל על ידי ייצור חומצה לקטית כמוצר תסיסה מרכזי. LAB גם מסנתזת מטבוליטים חיוניים, לדוגמה, חומצות אורגניות, בקטריוצינים ותרכובות אנטי-מיקרוביאליות אחרות³ שיכולות לעכב ספקטרום רחב של פתוגנים המועברים במזון⁴. חומצה לקטית, תוצר סופי עיקרי של קטבוליזם פחמימות ותוצר לוואי של תסיסת LAB, היא מטבוליט אורגני בעל תכונות אנטי-מיקרוביאליות והוא עשוי להיות שימושי ליישומי שימור ביולוגי של מזון ^3,5,6. יתר על כן, החומצות האורגניות המיוצרות על ידי LAB מקנות את הטעם, המרקם והארומה של המזונות, ובכך משפרות את התכונות האורגנולפטיות הכלליות שלהם ^5,6. הדרישות התזונתיות הייחודיות של LAB יחד עם האופי שלהן בכל מקום, מאפשרות בסופו של דבר לחיידקים לשגשג בקלות בסביבות שונות כגון מזונות המבוססים על מוצרי חלב, מזונות מותססים, ירקות, כמו גם במעיים האנושיים⁷.

יש ביקוש הולך וגובר לתרביות התחלתיות מ- LAB לייצור יוגורט ויישומי חלב רבים ומגוונים^8,9, ולכן יש לדבוק בתשומת לב קריטית ובטכניקות מדעיות מבוססות, בטיפוח זני LAB, כמו גם בהפעלת זנים ליופיליים ומבודדים כאחד^, שכן פעילות זו חיונית לביצועי תסיסה משופרים. לפיכך, המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון עוסקת באופן פעיל בפיתוח טכנולוגי מתאים המיועד להפעלה, גידול מעולה ותסיסה האופייניים לזני LAB המבודדים ממוצרי חלב מותססים, כמו גם מתרביות התחלתיות תעשייתיות המועסקות בייצור יוגורט. יתר על כן, ראוי לציין כי זני תרביות LAB המיוצרים באופן תעשייתי עוברים פעילויות משמרות כגון ייבוש בהקפאה ואחסון קפוא, הגורמים ללחץ ופגיעה בתאים, כתוצאה מתהליך הלם הקור שהם נתונים לו¹⁰. כדי להגביל, את אתגרי הכדאיות ולשפר את הפונקציונליות של זני LAB המתקבלים ממוצרי מזון מבודדים או ממוצרים מיובשים בהקפאה, חשוב להפעיל כראוי תרביות אלה כצורה של בקרת איכות כדי לשפר את המאפיין התסיסתי שלהם⁸. במחקר זה, המטרה הייתה לפתח פרוטוקול בקרת איכות פנימי להפעלה וצמיחה של זני תרבית L. delbrueckii subsp. bulgaricus שבסופו של דבר קידמו צמיחת LAB בת קיימא, כמו גם שיפרו את ביצועי התסיסה ואת הפונקציונליות המטבולית של זני LAB. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בסופו של דבר (באמצעות מדיית גידול אופטימלית ותנאי גידול מתאימים) לטיפוח זני LAB אחרים למחקר תסיסה, כמו גם למטרות תעשייתיות או לפעולות עיבוד ביולוגי. לפיכך, פרוטוקול הפעלה ובקרת איכות זה של LAB יבטיח קבלת תרביות התחלתיות של מוצרי חלב בני קיימא ומתאימות, בעלות פוטנציאל לתפקד עבור יישומים מגוונים בתעשיית החלב והמזון העולמית.

Protocol

1. חומרים ושיטות כלליים

1. מקור לקטובצילוס דלברוצקי תת-קרקעי בולגריקוס
   1. השג זנים של L. bulgaricus ממקורות אמינים.
      הערה: במחקר זה נעשה שימוש בסך הכל בחמישה (5) זני L. bulgaricus במחקר בקרת האיכות (טבלה 1). שני זנים של L. bulgaricus מיובשים בהקפאה לייצור תעשייתי של מוצרי חלב מותססים סופקו על ידי ד"ר אלברט קרסטנוב, המחלקה לביוטכנולוגיה באוניברסיטה לטכנולוגיות מזון, פלובדיב, בולגריה. שני זנים שבודדו ממוצרי יוגורט מסחריים הזמינים בשוק האמריקאי התקבלו ממלאי של -80 מעלות צלזיוס של המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון באוניברסיטת A&T סטייט בצפון קרוליינה, וזן אחד מיובש בהקפאה סופק על ידי ספק C. כל זני LAB נשמרו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. זן חיידקי נוסף (Limosilactobacillus reuteri) התקבל ממלאי של -80 מעלות צלזיוס של המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון באוניברסיטת צפון קרוליינה A&T סטייט.
2. מדיום מרק תסיסה סטנדרטי L. MRS
   1. הכינו את מדיום דה-מן, רוגוסה שארפ (MRS) על ידי המסה מלאה של 55 גרם MRS, ו-0.5 גרם של L-ציסטאין ב-1 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה (DW).
   2. יש לחלק 7 מ"ל ו-2 מ"ל מתמיסת ה-MRS המוכנה למבחנות, בהתאמה, ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן לקרר בטמפרטורת החדר (RT).
3. MRS אגר בינוני
   1. יש להכין את MRS אגר בינוני על ידי המסה מלאה של 55 גרם MRS ו-0.5 גרם של L-ציסטאין ב-1 ליטר של DW. מוסיפים אבקת אגר (15 גרם), מעקרים את מדיום האגר בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואז מקררים אותו באמבט מים.
   2. מוזגים את כל חומרי הגלם הטריים לתוך צלחות פטרי סטריליות ומאחסנים אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד להמשך הצורך.
4. מולוסטרידיאל בינוני-פירובט מחוזק מותאם (mRCM-PYR)
   1. מטב מדיום קלוסטרידיאלי מחוזק על פי Oyeniran et al.13 ו- Nwamaioha ו- Ibrahim¹⁸, לסלקטיביות וספירה מדויקת של L. bulgaricus על ידי המסת 10 גרם של פפטון #3, ¹⁰ גרם של תמצית בקר, 5 גרם של תמצית שמרים, 5 גרם של נתרן כלורי, 3 גרם של נתרן אצטט, 2 גרם של אשלגן פוספט dibasic_, 0.1 גרם של uracil, 0.25 גרם של סידן כלורי, 5 גרם של דקסטרוז, 5 גרם של פרוקטוז, 10 גרם של מלטוז, 2 גרם של נתרן פירובט, 0.2% טווין 80, ו 0.5 גרם של L- ציסטאין ב 1 ליטר של DW.
   2. התאם את ה- pH הסופי (6.0 ± 0.2) של התמיסה באמצעות 6 N HCl לפני תוספת של 0.008% כחול אנילין ו- 15 גרם אגר. אוטוקלאב את המדיום בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, מצננים באמבט מים ויוצקים לתוך צלחות פטרי סטריליות. אחסנו את כל חומרי הגלם הטריים בצלחות פטרי סטריליות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד הצורך.
5. מלאי גליצרול של תרביות LAB
   1. הכינו מלאי גליצרול (50% גליצרול) על ידי דילול 100% גליצרול באותו נפח של DW ועיקור בטמפרטורה של 100°C למשך 30 דקות באמצעות מחזור עיקור יבש. מקררים את מלאי הגליצרול ל-RT ומאחסנים אותם באופן אספטי לשימוש נוסף.
   2. השתמש בצמיחת חיידקים (מושבה אחת של L. bulgaricus שהושגה באמצעות פרוטוקול QC שפותח) מתרביות לילה.
   3. פיפטה 500 μL של תרביות הלילה לתוך 50% גליצרול בצינור צנטריפוגה 2 מ"ל ומערבבים בעדינות אותם יחד. הקפיאו ואחסנו את מלאי הגליצרול המכיל את תרביות LAB בטמפרטורה נמוכה במיוחד של -80°C עד הצורך.
      הערה: סכימה גרפית של הפרוטוקול לבקרת איכות והפעלה של תרביות LAB מוצגת באיור 1.

לא	קוד מוצר	לדוגמה	מקור	הרכב החיידקים כפי שמסומן1
1	S9	זן תעשייתי טהור	בולגריה	Lb. בולגריקוס
2	ל"ב6	זן תעשייתי טהור	בולגריה	ל"ג בולגריקוס,
3	ATCC 11842	זן תעשייתי טהור	ATCC	Lb. בולגריקוס
4	דאו	יוגורט	ארצות הברית	Lb. בולגריקוס, תרבות חיה אחרת
5	E22	יוגורט	ארצות הברית	Lb. בולגריקוס, תרבות חיה אחרת
6	ראוטרי	יוגורט	ארצות הברית	לימוסילקטובצילוס ראוטרי
1ק"ג =לקטובצילוס

טבלה 1: זנים פרוביוטיים. הטבלה מפרטת את הזנים הפרוביוטיים שבהם נעשה שימוש במחקר זה.

2. פרוטוקול להפעלה ובקרת איכות של תרביות LAB

1. קח את מלאי הגליצרול המוכן של זני LAB (בצינורות צנטריפוגה של 2 מ"ל) מהמקפיא האולטרה-נמוך במיוחד של -80 מעלות צלזיוס, ואל תאפשר להם להפשיר לפני השימוש.
2. נקו וחטאו את פתח צינורות הצנטריפוגה ב-70% אלכוהול, ומערבלים בעדינות לפני השימוש.
3. פיפטה על 250 μL (0.25 מ"ל) של תרבית LAB המניות מצינורות צנטריפוגה לתוך מבחנות MRS טריות 2 מ"ל.
4. מערבלים בעדינות, עושים פרפילם למבחנות, ומדגרים אותם באופן אנאירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
5. קח כ-500 μL (0.5 מ"ל) מהתרביות הגדלות בן לילה ממבחנות MRS של 2 מ"ל למבחנות MRS טריות של 7 מ"ל, מערבולות, ודגירה אנאירובית שלהן למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
6. הערך את הגידול המיקרוביאלי על ידי מדידת הצפיפות האופטית (OD) או הצמיחה של התרביות ב-610 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר הנראה לעין UV ותעד תוצאות מקובלות בין 0.7 ל-0.9.
7. פסו את תרביות הלילה מצינורות MRS של 7 מ"ל על צלחות אגר MRS ו- MRCM-PYR ודגרו אותן באופן אנאירובי למשך 72 שעות ב-42 מעלות צלזיוס.
8. בחרו מושבות מבודדות מצלחות האגר, העבירו אותן למבחנות MRS טריות של 7 מ"ל, מערבולות עדינות, ודגרו אותן באופן אנאירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
9. אחסנו את צלחות האגר המכילות את הזנים המבודדים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר למשך שבוע.
10. למדוד ולאשר את ה-OD (בין 0.7 ל-0.9) ממבחנות MRS של 7 מ"ל של תרביות LAB שבודדו מהלוחות המפוספסים ב-610 ננומטר ולהשתמש בהם כתרביות עבודה לכל הניסויים הקשורים.
11. בצע דילול פי עשרה (מדולל סדרתי) של תרביות LAB שגודלו ממבחנות MRS אחרונות של 7 מ"ל באמצעות 9 מ"ל של מי פפטון (חיץ פיזיולוגי) כדי להשיג יחס של 1:10.
12. לבסוף, קח כ 250 μL (0.25 מ"ל) מדילולים סדרתיים מתאימים עבור כל ניסויי התסיסה.
13. הפעל את המרק המכיל זנים (250 μL) משלב 2.12 על ידי העברתם למרק MRS טרי של 7 מ"ל ודגירתם באופן אנאירובי בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
14. המשך על ידי חזרה על שלבים 2.6-2.12 כדי להבטיח צמיחת תאים בת קיימא ומעולה מתרביות LAB.
    הערה: כל זני L. bulgaricus הופעלו בציר MRS שהוכן זה עתה ולאחר מכן דוגרו באופן אנאירובי בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות על מנת להגיע לצפיפות אופטית (OD_{610 ננומטר}) של צמיחת חיידקים בין 0.7 ל-0.9. צמיחת חיידקים נמדדה באמצעות ספקטרופוטומטר הנראה לעין UV ב-610 ננומטר. ערכי ה-pH של תרביות הלילה היו בטווח של 3.5 עד 5.3 כתוצאה מייצור חומצה לקטית, תוצר סופי אורגני של תסיסת LAB. נהלי בטיחות כגון זרימת אוויר תקינה במכסה המנוע ומניעת כוויות במהלך השימוש במבער הבונזן הודבקו ונצפו.

איור 1: סכימה גרפית של הפרוטוקול להפעלת תרביות חיידקי חומצה לקטית (LAB). התוכנית מספקת פרטים ואת המכשירים הבסיסיים הדרושים לטיפול והפעלה של זני תרבית LAB. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

תוצאות

גידול התאים של זני ה-LAB המוערכים שטופחו באמצעות פרוטוקול בקרת האיכות היה שונה באופן משמעותי (P < 0.05) מהזנים שטופחו ללא פרוטוקול סטנדרטי זה. פרוטוקול QC הן עבור L. bulgaricus והן עבור L. reuteri נקט בגישה רב-תרבותית (תת-תרבות שלוש פעמים לפני פסים על לוחות אגר), בעוד שהליך הבקרה נעשה רק פעם אחת כאש?...

Discussion

התוצאות של כל הזנים שהוערכו באמצעות פרוטוקול בקרת האיכות וללא שימוש בפרוטוקול היו זהות, ולכן הוצגו תוצאות המקושרות לזנים בלבד (S9 ו-LB6). זני ה-LAB המופעלים היו בעלי צמיחת תאים מעולה שהתאפיינה בעוצמה גבוהה של ביומסה תאית, ולכן גרמה להופעה עכורה של המרק התסיסתי MRS במבחנה¹¹. צמיחת התא?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline Blue	Thermo Scientific	R21526	25 g
Beef extract	Research Products International	50-197-7509	500 g
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Calcium Chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500	500 g
Dextrose Anhydrous	Fisher Scientific	BP350500	500 g
D-Fructose	ACROS Organics	AC161355000	500 g
Difco agar powder	Difco	DF0812-07-1	2 kg
TPY agar	Difco	211921	500 g
Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Scientific	05-402-12	2 mL
Glycerol	Thermo Scientific	PI17904	500 mL
Infrared CO2 Incubator	Forma Scientific
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	DAW
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	E22
Limosilactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	RD2
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Maltose monohydrate	Fisher Scientific	M75-100	100 g
MRS broth	Neogen	50-201-5691	5 kg
Peptone No. 3	Hach	50-199-6719	500 g
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Research Products International	50-712-761	500 g
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	S220-1	1 kg
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	1 kg
Sodium pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100	100 g
Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps	Fisher Scientific	FB70125150	25 x 150 mm
Tween 80	Fisher Scientific	T164-500	500 mL
Ultra low freezer	So-Low
Uracil	ACROS Organics	AC157301000	100 g
UV- visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Evolution 201
Vortex Genie 2	Fisher Scientific
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Ethanol	Fisher Scientific	T08204K7	4 L
Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical)	Fisher Scientific	SA56-500	500 mL