JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، يتم تقديم فحص إعادة تشكيل مجهري TIRF قائم على المختبر لتحديد ومقارنة ديناميكيات مجموعتين من الأنابيب الدقيقة في وقت واحد. يتم وصف طريقة لعرض النشاط الجماعي للبروتينات المتعددة المرتبطة بالأنابيب الدقيقة في وقت واحد على حزم الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والأنابيب الدقيقة المفردة.

Abstract

الأنابيب الدقيقة هي بوليمرات من αβ-tubulin heterodimers التي تنظم في هياكل متميزة في الخلايا. غالبا ما تحتوي المعماريات والشبكات القائمة على الأنابيب الدقيقة على مجموعات فرعية من صفائف الأنابيب الدقيقة التي تختلف في خصائصها الديناميكية. على سبيل المثال ، في تقسيم الخلايا ، تتعايش حزم مستقرة من الأنابيب الدقيقة المتقاطعة على مقربة من الأنابيب الدقيقة الديناميكية غير المترابطة. تمكن دراسات إعادة التشكيل في المختبر القائمة على TIRF المجهري من التصور المتزامن لديناميكيات هذه المصفوفات المختلفة من الأنابيب الدقيقة. في هذا الفحص ، يتم تجميع غرفة التصوير باستخدام الأنابيب الدقيقة المجمدة على السطح ، والتي إما موجودة كخيوط مفردة أو منظمة في حزم متقاطعة. يسمح إدخال التوبولين والنيوكليوتيدات ومنظمات البروتين بالتصور المباشر للبروتينات المرتبطة والخصائص الديناميكية للأنابيب الدقيقة المفردة والمتشابكة. علاوة على ذلك ، يمكن مراقبة التغييرات التي تحدث عندما يتم تنظيم الأنابيب الدقيقة المفردة الديناميكية في حزم في الوقت الفعلي. تسمح الطريقة الموصوفة هنا بإجراء تقييم منهجي لنشاط البروتينات الفردية وتوطينها ، بالإضافة إلى التأثيرات التآزرية لمنظمات البروتين على مجموعتين فرعيتين مختلفتين من الأنابيب الدقيقة في ظل ظروف تجريبية متطابقة ، وبالتالي توفير رؤى ميكانيكية لا يمكن الوصول إليها بطرق أخرى.

Introduction

الأنابيب الدقيقة هي بوليمرات حيوية تشكل سقالات هيكلية ضرورية لعمليات خلوية متعددة ، تتراوح من النقل داخل الخلايا وتحديد مواقع العضيات إلى انقسام الخلايا واستطالتها. لتنفيذ هذه الوظائف المتنوعة ، يتم تنظيم الأنابيب الدقيقة الفردية في صفائف بحجم ميكرون ، مثل المغزل الانقسامي ، والمحاور الهدبية ، والحزم العصبية ، والمصفوفات بين الأطوار ، والمصفوفات القشرية النباتية. ومن الزخارف المعمارية المنتشرة في كل مكان الموجودة في هذه الهياكل مجموعة من الأنابيب الدقيقة المتشابكة على طول أطوالها1. ومن السمات المثيرة للاهتمام للعديد من الهياكل القائمة على الأنابيب الدقيقة التعايش بين الأنابيب الدقيقة المجمعة والأنابيب الدقيقة المفردة غير المتقاطعة في مكان قريب. يمكن لهذه المجموعات الفرعية من الأنابيب الدقيقة أن تعرض ديناميكيات بلمرة مختلفة بشكل صارخ عن بعضها البعض ، حسب الحاجة لوظيفتها المناسبة2،3،4،5. على سبيل المثال، داخل المغزل الانقسامي، توجد حزم متقاطعة مستقرة وأنابيب دقيقة مفردة ديناميكية داخل منطقة على نطاق ميكرون في مركز الخلية6. وبالتالي ، فإن دراسة كيفية تحديد الخصائص الديناميكية لمجموعات الأنابيب الدقيقة المتعايشة أمر أساسي لفهم تجميع ووظيفة الهياكل القائمة على الأنابيب الدقيقة.

الأنابيب الدقيقة هي بوليمرات ديناميكية تدور بين مراحل البلمرة وإزالة البلمرة ، وتنتقل بين المرحلتين في الأحداث المعروفة باسم الكارثة والإنقاذ7. يتم تنظيم ديناميكيات الأنابيب الدقيقة الخلوية من خلال عدد لا يحصى من البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة (MAPs) التي تعدل معدلات بلمرة الأنابيب الدقيقة وإزالة البلمرة وترددات أحداث الكوارث والإنقاذ. ومن الصعب التحقيق في نشاط MAPs على المصفوفات القريبة مكانيا في الخلايا، بسبب محدودية الاستبانة المكانية في الفحص المجهري الضوئي، وخاصة في المناطق ذات الكثافة العالية للأنابيب الدقيقة. علاوة على ذلك ، فإن وجود MAPs متعددة في نفس المنطقة الخلوية يعيق تفسيرات الدراسات البيولوجية الخلوية. تعمل فحوصات إعادة التشكيل في المختبر ، التي يتم إجراؤها بالاقتران مع الفحص المجهري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF) ، على التحايل على تحديات فحص الآليات التي تنظم من خلالها مجموعات فرعية محددة من MAPs ديناميكيات صفائف الأنابيب الدقيقة الخلوية القريبة. هنا ، يتم فحص ديناميكيات الأنابيب الدقيقة التي يتم تجميعها في المختبر في وجود واحد أو أكثر من MAPs المؤتلفة في ظل ظروف خاضعة للرقابة8،9،10. ومع ذلك ، يتم إجراء اختبارات إعادة التشكيل التقليدية عادة على الأنابيب الدقيقة المفردة أو على نوع واحد من الصفيفات ، مما يحول دون تصور السكان المتعايشين.

هنا ، نقدم في المختبر اختبارات إعادة التشكيل التي تمكن من التصور المتزامن لمجموعتين من الأنابيب الدقيقة تحت نفس ظروف الحل 11. نحن نصف طريقة لعرض النشاط الجماعي ل MAPs متعددة في وقت واحد على الأنابيب الدقيقة المفردة وعلى حزم الأنابيب الدقيقة المترابطة بواسطة البروتين المرتبط بالمغزل الانقسامي PRC1. يرتبط البروتين PRC1 بشكل تفضيلي عند التداخل بين الأنابيب الدقيقة المضادة للتوازي ، ويربطها معا9. باختصار ، يتكون هذا البروتوكول من الخطوات التالية: (i) إعداد محاليل المخزون والكواشف ، (ii) تنظيف ومعالجة السطح للأغطية المستخدمة لإنشاء غرفة التصوير لتجارب الفحص المجهري ، (iii) إعداد "بذور" microtubule مستقرة والتي تبدأ منها البلمرة أثناء التجربة ، (iv) مواصفات إعدادات المجهر TIRF لتصور ديناميكيات microtubule ، (v) تجميد بذور microtubule وتوليد حزم microtubule المتشابكة في غرفة التصوير ، و (vi) تصور ديناميكيات الأنابيب الدقيقة في غرفة التصوير من خلال المجهر TIRF ، عند إضافة توبولين قابل للذوبان ، MAPs ، والنيوكليوتيدات. تمكن هذه الفحوصات من التقييم النوعي والفحص الكمي لتوطين MAP وتأثيرها على ديناميكيات مجموعتين من الأنابيب الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تسهل تقييم الآثار التآزرية ل MAPs المتعددة على مجموعات الأنابيب الدقيقة هذه ، عبر مجموعة واسعة من الظروف التجريبية.

Protocol

1. إعداد الكواشف

  1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف على النحو المبين في الجدول 1 والجدول 2. أثناء التجربة ، احتفظ بجميع الحلول على الجليد ، ما لم يذكر خلاف ذلك.
حلمكوناتمدة التخزين الموصى بهاتلاحظ
5X BRB80400 مللي متر K-الأنابيب، 5 ملليمتر MgCl2، 5 ملليمتر EGTA، الرقم الهيدروجيني 6.8 مع KOH، تصفية التعقيمما يصل إلى 2 سنواتيخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية
1X BRB8080 مللي متر K-الأنابيب، 1 ملليمتر MgCl2، 1 ملليمتر EGTA، الرقم الهيدروجيني 6.8ما يصل إلى 2 سنواتيخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية
BRB80-DTT1X BRB80، 1 ملليمتر DTTما يصل إلى 2 أيام
فحص المخزن المؤقت80 مللي متر K-الأنابيب، 3 ملم MgCl2، 1 ملليمتر EGTA، الرقم الهيدروجيني 6.8، 5٪ السكروز (أو 1X BRB80، 5٪ السكروز، 2 ملليمتر MgCl2)ما يصل إلى 1 سنةيخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية
المخزن المؤقت الرئيسي (MB)فحص المخزن المؤقت، 5mM TCEP1 أسبوعالتحضير في يوم التجربة ؛ افصل إلى أنبوبين: MB-warm في درجة حرارة الغرفة و MB-cold على الجليد ؛ تضمين 1 mM DTT إذا كنت تستخدم أصباغ الفلورسنت
المخزن المؤقت الرئيسي مع ميثيل السليلوز (MBMC)1X BRB80 ، 0.8٪ ميثيل سليلوز ، 5 mM TCEP ، 5 mM MgCl2 1 أسبوعالتحضير في يوم التجربة ؛ تضمين 1 mM DTT إذا كنت تستخدم أصباغ الفلورسنت
المخزن المؤقت لتخفيف البروتين (DB)MB, 1 ملغم/مل ألبومين مصل البقر (BSA), 1 ميكرومتر ATP1 يوم، على الجليدالتحضير في يوم التجربة ؛ تضمين 1 mM DTT إذا كنت تستخدم أصباغ الفلورسنت
مزيج كسح الأكسجين (OSM)MB, 389 ميكروغرام/مل كاتالاز، 4.44 ملغم/مل أوكسيديز الجلوكوز، 15.9 مللي متر 2-ميركابتوإيثانول (BME)1 يوم، على الجليدالتحضير في يوم التجربة
نهائي كسح الأكسجين (OSF)MB، 350 ميكروغرام/مل كاتالاز، 4 ملغم/مل أوكسيديز الجلوكوز، 14.3 مللي مل BME، 15 ملغم/مل جلوكوزيستخدم في غضون 30 دقيقةتحضير مباشرة قبل الاستخدام عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من الجلوكوز إلى 9 ميكرولتر من OSM

الجدول 1: قائمة المخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول ومكوناتها. راجع عمود "مدة التخزين الموصى بها" للحصول على إرشادات حول مدى إمكانية إعداد كل مخزن مؤقت مسبقا.

الكاشفتركيز التخزينمذيب التخزيندرجة حرارة التخزينتركيز العملالتركيز النهائيمدة التخزين الموصى بهاتلاحظ
نيوترافيدين (NA)5 ملغم/مل1X BRB80-80 درجة مئوية0.2 ملغم/مل0.2 ملغم/ملما يصل إلى 1 سنةتستخدم لشل حركة الأنابيب الدقيقة عن طريق ربط البيوتين-نيوترافيدين-البيوتين؛ تخزين في أليكوتس صغيرة
كابا كازين (KC)5 ملغم/مل1X BRB80-80 درجة مئوية0.5 ملغم/مل0.5 ملغم/ملما يصل إلى 2 سنواتتستخدم لمنع سطح غرفة التصوير. تخزينها في أليكوتس صغيرة. في يوم التجربة، ضع حجرا صغيرا جانبا في درجة حرارة الغرفة
ألبومين مصل البقر (BSA)50 ملغم/مل1X BRB80-20 درجة مئوية1 ملغم/مل (بالديسيبل)غير متوفرما يصل إلى 2 سنواتتخزين في أليكوتس صغيرة
كاتالاز3.5 ملغم/مل1X BRB80-80 درجة مئوية350 ميكروغرام/مل (في OSF)35 ميكروغرام/ملما يصل إلى 2 سنواتمكون من مزيج كسح الأكسجين. تخزين في أليكوتس صغيرة
أوكسيديز الجلوكوز40 ملغم/مل1X BRB80-80 درجة مئوية4 ملغم/مل (في OSF)0.4 ملغم/ملما يصل إلى 2 سنواتمكون من مزيج كسح الأكسجين. تخزين في أليكوتس صغيرة
توبولينمجفف بالتجميدغير متوفر4 درجات مئوية10 ملغم/مل2.12 ملغم/مل (في مزيج توبولين)ما يصل إلى 1 سنةبمجرد أن يصبح التوبولين في المحلول ، اجعله باردا لتجنب البلمرة.
أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)100 مللي مترمياه فائقة النقاء-20 درجة مئوية10 مللي متر1 مللي متر6 أشهرتحضير محلول في الماء المعقم بالترشيح ، وضبط درجة الحموضة إلى ~ 7.0 ، وتجميد في aliquots الصغيرة.
جوانوزين ثلاثي الفوسفات (GTP)100 مللي مترمياه فائقة النقاء-20 درجة مئوية10 مللي متر1.29 مللي متر (في مزيج توبولين)6 أشهرتحضير محلول في الماء المعقم بالترشيح ، وضبط درجة الحموضة إلى ~ 7.0 ، وتجميد في aliquots الصغيرة.
غوانوزين-5'-[(α,β)-ميثيلينو] ثلاثي الفوسفات (GMPCPP)10 مللي مترمياه فائقة النقاء-20 درجة مئوية10 ميكرومتر0.5 ميكرومتر6 أشهر
ديثيوثريتول (DTT)1 ممياه معقمة-20 درجة مئوية1 مللي مترغير متوفرما يصل إلى 2 سنوات
تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP)0.5 مالمياه المعقمة بالفلتردرجة حرارة الغرفة5 مللي مترغير متوفرما يصل إلى 2 سنوات
ميثيل سليلوز1%مياه معقمةدرجة حرارة الغرفة0.8٪ (بالميجابايت إم إم سي)0.21٪ (في مزيج توبولين)ما يصل إلى 1 سنةيذوب ميثيل سليلوز عن طريق إضافته ببطء إلى الماء شبه المغلي. اتركيه ليبرد مع التحريك المستمر.
بيتا ميركابتوإيثانول (BME)143 مللي مترمياه معقمةدرجة حرارة الغرفة14.3 ملليمتر (في OSF)1.43 ملليمترحتى 5 سنوات143 mM هو تخفيف 1:100 من BME الأسهم
الجلوكوز150 ملغم/مل1X BRB80-80 درجة مئوية15 ملغم/مل (في OSF)1.5 ملغم/ملما يصل إلى 2 سنواتأضف إلى OSM مباشرة قبل الاستخدام
(±)-6-هيدروكسي-2،5،7،8-رباعي ميثيل كرومان-2-حمض الكربوكسيل (ترولوكس)10 مللي متر1X BRB80-80 درجة مئوية10 مللي متر1 مللي مترما يصل إلى 1 سنةلا يذوب تماما. أضف بعض NaOH ، وحرك لمدة 4 ساعات تقريبا ، وقم بتصفية التعقيم قبل الاستخدام
mPEG-Succinimidyl فاليرات، MW 5,000ذرورغير متوفر-20 درجة مئوية333 ملغم/مل
(في 0.1 مليون بيكربونات الصوديوم)		324 ملغم/مل
(في 0.1 مليون بيكربونات الصوديوم)		6 أشهرإعداد ~ 34 ملغ aliquots ، ووضع علامة على كل أنبوب مع الوزن الدقيق للمسحوق. مرر غاز النيتروجين فوق الأنابيب الصلبة المغلقة باستخدام البارافيلم ، وخزنه عند -20 درجة مئوية في حاوية مع مجفف.
البيوتين-PEG-SVA, MW 5,000ذرورغير متوفر-20 درجة مئوية111 ملغم/مل
(في 0.1 مليون بيكربونات الصوديوم)		3.24 ملغم/مل (في 0.1 مليون بيكربونات الصوديوم)6 أشهرإعداد ~ 3 ملغ aliquots ، ووضع علامة على كل أنبوب مع الوزن الدقيق للمسحوق. مرر غاز النيتروجين فوق الأنابيب الصلبة المغلقة باستخدام البارافيلم ، وخزنه عند -20 درجة مئوية في حاوية مع مجفف.

الجدول 2: قائمة الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول. وتشمل ظروف التخزين والتركيزات الموصى بها، وتركيزات العمل من المحاليل المخزون المستخدمة أثناء التجربة، والتركيز النهائي في غرفة التصوير. وترد ملاحظات إضافية في العمود اليميني المتطرف.

2. إعداد شرائح البيوتين-PEG

ملاحظة: قم بإعداد غرف التصوير في أقرب وقت ممكن من بداية التجربة ، وليس أكثر من 2 أسابيع مقدما.

  1. أغطية نظيفة
    1. ضع عددا مساويا من 24 × 60 مم و 18 × 18 مم # 1.5 غطاء (الشكل 1F) في أوعية تلطيخ الشرائح ورفوف غسل الشرائح ، على التوالي (الشكل 1A ، B). ضع رفوف الغسيل المنزلق التي تحتوي على أغطية مقاس 18 × 18 مم في كوب سعة 100 مل.
    2. شطف جميع أغطية 5-6 مرات في ماء فائق النقاء (مقاومة 18.2 MΩ-cm) وإزالة السائل الزائد بعد كل شطف بطرف ماصة متصل بأنبوب فراغ (الشكل 1C).
    3. املأ الأكواب والجرار الملطخة بالشرائح التي تحتوي على الأغطية بالماء فائق النقاء ، وختم بالبارافيلم ، وسونيكات لمدة 10 دقائق.
    4. املأ دورقين سعة 150 مل بالإيثانول المقاوم ل 200 متر. باستخدام ملاقط ، اغمس كل غطاء في كوب واحد مملوء بالإيثانول ، ثم الآخر.
    5. باستخدام الملقط ، انقل الأغطية إلى رف تجفيف الشرائح (الشكل 1D) ، وجففها تحت تيار غاز النيتروجين واحتضنها عند 37 درجة مئوية حتى تجف تماما (~ 15 دقيقة).
    6. ضع الأغطية المجففة في طبقة واحدة داخل منظف البلازما. قم بتشكيل ختم فراغ ، ثم اضبط مستوى التردد اللاسلكي (RF) لمنظف البلازما على ~ 8 ميجاهرتز.
    7. بمجرد إنشاء البلازما ، اترك أغطية في منظف البلازما لمدة 5 دقائق. أطفئ منظف البلازما وحرر المكنسة الكهربائية ببطء.
    8. بمجرد تحرير ختم التفريغ ، اقلب الغطاء وكرر تنظيف البلازما لمدة 5 دقائق للجانب الآخر من الأغطية .
    9. بديل لتنظيف البلازما: بدلا من الخطوات 2.1.2-2.1.3 ، تنزلق أغطية السونيكات في محلول دافئ من منظف 2٪ (في ماء فائق النقاء) لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اغسل الأغطية جيدا بالماء فائق النقاء وصوتنة في ماء فائق النقاء 2-3 مرات (10 دقائق لكل منهما). بعد ذلك ، اغسل الإيثانول وجففه كما في الخطوات 2.1.4-2.1.5. تخطي الخطوات 2.1.6-2.1.8.
  2. علاج البيوتين-PEG
    1. مباشرة قبل الاستخدام ، قم بإذابة 400 ميكرولتر من 3-Aminopropyltriethoxysilane في 40 مل من الأسيتون. باستخدام الملقط، حرك الأغطية النظيفة بالبلازما إلى رف غسل الشرائح والجرار الملطخة بالشرائح. يغمر الغطاء في محلول 3-Aminopropyltriethoxysilane ويحضن لمدة 5 دقائق 12,13.
    2. اغسل جميع الأغطية 5-6 مرات بالماء فائق النقاء.
    3. انقل الأغطية إلى رف تجفيف الشرائح ، وجففها تحت تيار غاز النيتروجين واحتضنها عند 37 درجة مئوية حتى تجف تماما (~ 20 دقيقة).
    4. ضع الأغطية المجففة على مناديل المهام الحساسة وقم بتسمية كل غطاء على زاوية واحدة، على سبيل المثال، "p" على كل شريحة غطاء مقاس 18 × 18 مم و"b" على كل شريحة غطاء مقاس 24 × 60 مم (انظر الشكل 2).
    5. في يوم التجربة ، قم بإعداد محلول بيكربونات الصوديوم الطازج 0.1 M عن طريق إذابة 0.84 ملغ من NaHCO3 في 10 مل من الماء فائق النقاء.
    6. أحضر أليكوتات من mPEG-Succinimidyl Valerate (PEG-SVA) و Biotin-PEG-SVA إلى درجة حرارة الغرفة ، مباشرة قبل الاستخدام. انظر الملاحظات المتعلقة بإعداد أليكوت البولي إيثيلين غليكول (PEG) في الجدول 2.
      ملاحظة: اعمل بسرعة لأن عمر النصف للتحلل المائي ل Succinimidyl Valerate (SVA) moiety هو ~ 30 دقيقة.
    7. أضف 102 ميكرولتر من 0.1 M NaHCO3 إلى 34 ملغ من PEG-SVA ، وقم بالدوران في جهاز طرد مركزي دقيق على الطاولة عند 2,656 × g لمدة 20 ثانية ، ثم اخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. قم بإذابة 3 ملغ من البيوتين-PEG-SVA في 27 ميكرولتر من 0.1 M NaHCO3 عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. اضبط أحجام التخفيف وفقا للوزن الدقيق ل PEG الملاحظ على الأنابيب (انظر الجدول 2).
    8. تحضير 100: 1 ث / ث PEG: خليط البيوتين-PEG عن طريق الجمع بين 75 ميكرولتر من محلول PEG-SVA و 2.25 ميكرولتر من محلول Biotin-PEG-SVA ل 20 غطاء ، 100 ميكرولتر و 3 ميكرولتر ل 30 غطاء ، أو 125 ميكرولتر و 3.75 ميكرولتر ل 40 غطاء.
    9. قم ببناء غرفة ترطيب عن طريق وضع مناشف ورقية مبللة أسفل رف الطرف في الجزء السفلي من صندوق طرف فارغ سعة 10 ميكرولتر (الشكل 1E). هذا سيمنع تبخر حلول PEG.
    10. ماصة 6 ميكرولتر من 100: 1 PEG-SVA: خليط البيوتين-PEG في وسط غطاء واحد 24 × 60 مم على الجانب الملصق. ضع غطاء آخر مقاس 24 × 60 مم فوق الغطاء الأول بحيث يشكل الزوج شكل X ، مع مواجهة الجانبين "b" لبعضهما البعض. ضعي الزوج على رف فارغ في غرفة الترطيب وكرريه للأغطية المتبقية مقاس 24 × 60 مم.
    11. ماصة 6 ميكرولتر من PEG-SVA في وسط غطاء واحد 18 × 18 مم على الجانب الملصق. ضع غطاء آخر مقاس 18 × 18 مم فوق الغطاء الأول ، مع وضع الجوانب المعلمة "p" في مواجهة بعضها البعض. ضعي الزوج على رف فارغ في غرفة الترطيب وكرريه مع الأغطية المتبقية مقاس 18 × 18 مم.
    12. أغلق غرفة الترطيب واحتضنها لمدة 3 ساعات أو طوال الليل.
    13. افصل أزواج الأغطية وشطفها بالماء فائق النقاء.
    14. يجفف الغطاء مع تيار النيتروجين ويوضع في حاضنة 37 درجة مئوية لتجف تماما.
    15. لبناء غرفة التصوير، قم بلصق ثلاثة شرائط من الشريط على الوجهين على غطاء مقاس 24 × 60 مم على الجانب المسمى "b". على الجانب الآخر من شرائط الشرائط، قم بتركيب غطاء 18 × 18 مم مع جانبه المسمى "p" في مواجهة الغطاء الأكبر. وهذا يشكل غرفتي تدفق لتجارب الفحص المجهري، حيث تواجه الأسطح المعالجة بعضها البعض (الشكل 2 والشكل 1G).

figure-protocol-15810
الشكل 1: معدات لمعالجة الانزلاق وإعداد غرفة التصوير . (أ) الجرار الملطخة بالشرائح ل 24 × 60 مم ، (ب) رفوف غسل الشرائح لقسائم الأغطية 18 × 18 مم ، (C) إعداد الفراغ ، (D) رف تجفيف الشرائح ، (E) غرفة الترطيب ، (F) أغطية الغطاء ، (G) غرفة التصوير ، (H) حامل الشرائح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-16540
الشكل 2: مخطط لإعداد غرف التصوير باستخدام شريط على الوجهين (رمادي) وأغطية معالجة PEG/Biotin-PEG. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. بلمرة الأنابيب الدقيقة

  1. تحضير بذور GMPCPP
    ملاحظة: قم بإعداد بذور GMPCPP في غرفة باردة ، مع الحفاظ على جميع الكواشف والنصائح والأنابيب عند 4 درجات مئوية. ضع دوار جهاز الطرد المركزي الفائق الزاوية الثابت ، الذي يحتوي على أنابيب طرد مركزي 1 مل ، في جهاز طرد مركزي فائق واضبط درجة الحرارة على 4 درجات مئوية.
    1. أعد تعليق التوبولين المجفف بالتجميد (الجدول 2) إلى ~ 10 ملغم / مل في 1X BRB80 ، مباشرة قبل الاستخدام.
    2. خلط مكونات بذور GMPCPP كما هو موضح في الجدول 3.
      ملاحظة: احتفظ بجميع مكونات التوبولين على الجليد قدر الإمكان لتقليل بلمرة التوبولين القابل للذوبان.
    3. قم بتوضيح المزيج في دوار جهاز طرد مركزي فائق الزاوية ثابت عند 352,700 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. افصل المادة الفائقة إلى 5 ميكرولتر أليكوتس ، ثم قم بتجميدها في النيتروجين السائل ، وخزنها عند -80 درجة مئوية.
  2. بلمرة البذور في يوم التجربة
    1. دافئ 1-2 مل من BRB80-DTT (الجدول 1) إلى 37 درجة مئوية.
    2. ضع 5 ميكرولتر من بذور GMPCPP (-80 درجة مئوية) من الخطوة 3.1.4 على الجليد وتذوب على الفور في 20 ميكرولتر من BRB80-DTT الدافئ. تدور بسرعة 2000 × جم لمدة 5 ثوان في درجة حرارة الغرفة وتنقر للخلط.
      ملاحظة: قد يتراوح حجم التخفيف الأولي بين 13 ميكرولتر و 21 ميكرولتر ويتم تحديده تجريبيا لكل دفعة من البذور. إذا فشلت البذور في البلمرة ، فقم باستكشاف الأخطاء وإصلاحها عن طريق استكمال المخزن المؤقت الأولي للتخفيف (الخطوة 3.2.2) ب 0.5 ميكرومتر GMPCPP.
    3. يحفظ بعيدا عن الضوء ويحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة.
      ملاحظة: يعتمد طول الأنابيب الدقيقة على مدة الحضانة. بالنسبة للأنابيب الدقيقة القصيرة ، يمكن أن يكون وقت الحضانة قصيرا يصل إلى 15 دقيقة. بالنسبة للأنابيب الدقيقة الطويلة ، يمكن أن يصل وقت الحضانة إلى 2 ساعة. تميل الأنابيب الدقيقة البيوتينيل إلى أن تتطلب أوقات حضانة أطول من الأنابيب الدقيقة غير البيوتينيلية.
    4. ضع دوار جهاز الطرد المركزي الفائق الزاوية ثابت الزاوية ، الذي يحتوي على أنابيب طرد مركزي سعة 500 ميكرولتر ، في جهاز طرد مركزي فائق السخونة مسبقا إلى 30 درجة مئوية.
    5. بعد الحضانة ، أضف 50 ميكرولتر من BRB80-DTT الدافئ (الخطوة 3.2.1) إلى بذور GMPCPP المبلمرة وانقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي سعة 500 ميكرولتر. اغسل الأنبوب الفارغ الذي يحتوي على بذور GMPCPP ب 50 ميكرولتر أخرى من BRB80-DTT الدافئة ، وقم بماصة لأعلى ولأسفل ، وأضف هذا المخزن المؤقت إلى أنبوب الطرد المركزي 500 ميكرولتر الذي يحتوي على الخليط.
    6. قبل الدوران ، ضع علامة على حافة أنبوب جهاز الطرد المركزي للإشارة إلى مكان وجود الكرية (ستكون الكرية صغيرة جدا بحيث لا يمكن رؤيتها). تدور لمدة 10 دقائق عند 244,900 × g عند 30 درجة مئوية12.
    7. ماصة بعناية من supernatant والتخلص منها. أعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من BRB80-DTT الدافئ. انقر للمزج.
    8. تدور لمدة 10 دقائق عند 244,900 × g عند 30 درجة مئوية ، مع محاذاة العلامة مع الدوار للحبيبات في نفس المكان.
    9. قم بإزالة السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات في 16 ميكرولتر من BRB80-DTT الدافئ. انقل محلول الأنابيب الدقيقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 0.6 مل. يحفظ بعيدا عن الضوء ويحفظ في درجة حرارة الغرفة أو فوقها.
      ملاحظة: بعد البلمرة، احتفظ بالأنابيب الدقيقة في درجة حرارة الغرفة أو فوقها. إذا أصيبوا بالبرد ، فسوف يزيلون البلمرة. احتضان في 28 درجة مئوية لمزيد من الاستقرار.
  3. تحقق من الأنابيب الدقيقة عبر المجهر TIRF
    1. ماصة خليط من 4.5 ميكرولتر من BRB80-DTT و 1 ميكرولتر من محلول الأنابيب الدقيقة (الخطوة 3.2.9) على شريحة المجهر. قم بتغطيتها بغطاء 18 × 18 مم وأغلق الحواف إما بطلاء أظافر شفاف أو بمزيج 1: 1: 1 من الفازلين واللانولين والبارافين (مانع تسرب فالاب) ، وهو صلب في درجة حرارة الغرفة وسائل عند 95 درجة مئوية.
    2. ضع هدف TIRF أسفل الغطاء (انظر الخطوة 4 للاطلاع على إعدادات المجهر الموصى بها) وتصور الأنابيب الدقيقة المبلمرة حديثا بطول موجي مناسب للتوبولين المسمى بالفلورسنت في المزيج الساطع (الجدول 3) ، لتحديد التخفيف من الأنابيب الدقيقة لاستخدامها في التجارب القادمة.
الكاشفمزيج مشرق (ميكرولتر)ترتيب الإضافةمزيج مشرق + البيوتين (ميكرولتر)ترتيب الإضافة
توبولين الفلورسنت، 10 ملغم/مل2627
البيوتين-توبولين، 10 ملغم/مل0غير متوفر26
توبولين غير ملصق، 10 ملغم/مل205185
GMPCPP ، 10 mM304304
DTT، 0.2 م0.730.73
5X BRB8026.4226.42
مياه معقمة52.9152.91
الحجم الكلي (ميكرولتر)132132

الجدول 3: مزيج بذور GMPCPP. مكونات بذور الأنابيب الدقيقة GMPCPP ، بما في ذلك حجم وترتيب الإضافة. تحضير 5 ميكرولتر aliquots وتخزينها لمدة تصل إلى 1 سنة في -80 درجة مئوية.

4. إعدادات المجهر

  1. درجة الحرارة: اضبط درجة حرارة المجهر على 28 درجة مئوية لعرض الأنابيب الدقيقة الديناميكية.
  2. المرشحات: استخدم أفضل مزيج من مكعبات المرشحات ومرشحات الانبعاثات، اعتمادا على قنوات الفلورسنت المراد تصويرها. لتصور أطوال موجية 488 نانومتر و560 نانومتر و647 نانومتر في نفس التجربة، استخدم مجموعة 405/488/560/647 نانومتر رباعية النطاق، إلى جانب مرشحات الانبعاثات للأطوال الموجية المحددة.
  3. محاذاة الليزر: تأكد من محاذاة أشعة الليزر المستخدمة في التجربة. حدد كثافة الليزر للتجربة تجريبيا ، بحيث يمكن تصوير جميع البروتينات الفلورية بأعلى نسبة ممكنة من الإشارة إلى الضوضاء ، ولكنها لا تخضع لتبييض ضوئي كبير على مدار فترة التجربة.
  4. الهدف: استخدم ورق العدسة لتنظيف هدف 100x باستخدام 70٪ من الإيثانول. قبل التصوير ، أضف قطرة من زيت غمر المجهر إلى الهدف.
  5. إعداد تسلسل تصوير
    1. لإجراء تجربة مع 647 نانومتر من الأنابيب الدقيقة البيوتينيل الموسومة بالفلوروفور، والأنابيب الدقيقة غير البيوتينيل المسماة بالفلوروفور 560 نانومتر، والتوبولين القابل للذوبان، والبروتين الذي يحمل علامة GFP، صورة لمدة 20 دقيقة. صور قنوات 560 نانومتر و 488 نانومتر كل 10 ثوان ، وقناة 647 نانومتر كل 30 ثانية.
    2. لالتقاط صورة مرجعية للحزم قبل إضافة التوبولين القابل للذوبان و MAPs ، قم بإعداد تسلسل مع صورة واحدة لكل منها في أطوال موجية 560 نانومتر و 647 نانومتر.

5. توليد حزم الأنابيب الدقيقة المثبتة على السطح

ملاحظة: بالنسبة للخطوات التالية، قم بتدفق جميع المحاليل إلى غرفة تدفق عن طريق السحب إلى جانب واحد مفتوح، مع وضع ورقة ترشيح على الجانب الآخر. حماية غرفة التصوير من الضوء لتقليل التبييض الضوئي للبروتينات ذات العلامات الفلورية. قم بلصق غرفة التصوير المعدة بحامل شريحة (الشكل 1G ، H). اتبع الخطوات الواردة في الجدول 4، والتي تتوافق مع بروتوكولات steps 5.2-6.4.

  1. تحضير مزيج توبولين قابل للذوبان وفقا للجدول 5 والاحتفاظ به على الجليد.
    ملاحظة: يجب دائما وضع توبولين قابل للذوبان على الجليد لمنع البلمرة. قم بإعداد مزيج توبولين طازج قابل للذوبان كل 2 ساعة تقريبا ، أو عندما تتوقف الأنابيب الدقيقة عن البلمرة.
  2. لشل حركة الأنابيب الدقيقة عبر وصلة البيوتين-نيوترافيدين-البيوتين، التدفق الأول في محلول نيوترافيدين (NA) حتى تمتلئ الغرفة (~ 7.5 ميكرولتر) وتحضن لمدة 5 دقائق.
  3. يغسل مع 10 ميكرولتر من MB-الباردة.
  4. تدفق في 7.5 ميكرولتر من البروتين المانع κ-الكازين (KC) وحضانت لمدة 2 دقيقة.
  5. يغسل مع 10 ميكرولتر من MB-warm لإعداد الغرفة لإدخال microtubules.
  6. قم بتخفيف مخزون الأنابيب الدقيقة البيوتينيل (وفقا للملاحظات الواردة في الخطوة 3.3.2) في 1X BRB80-DTT وأضف 1 ميكرولتر من هذا التخفيف إلى 9 ميكرولتر من MB-warm. تدفق الخليط إلى الغرفة وحضانته لمدة 10 دقائق. استخدم تركيزا أعلى من الأنابيب الدقيقة لمزيد من الحزم.
  7. اغسل الأنابيب الدقيقة غير المثبتة بسعة 10 ميكرولتر من MB-warm.
  8. تدفق 7.5 ميكرولتر من KC الدافئ إلى الغرفة واحتضان لمدة 2 دقيقة.
  9. أثناء الحضانة ، قم بإعداد محلول 2 نانومتر من بروتين الوصلة المتقاطعة PRC1 في KC. تدفق 10 ميكرولتر من هذا المحلول إلى غرفة التدفق واحتضانه لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يتم التعبير عن PRC1 المؤتلف وتنقيته من الخلايا البكتيرية كما هو موضح سابقا13.
  10. لصنع الحزم ، قم بتدفق 10 ميكرولتر من الأنابيب الدقيقة غير البيوتينيل إلى الغرفة واحتضنها لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: راجع الخطوة 6.1 لإعداد مزيج الفحص أثناء وقت الحضانة.
  11. اغسل الغرفة مرتين ب 10 ميكرولتر من MB-warm. الأنابيب الدقيقة المرفقة مستقرة لمدة 20 دقيقة تقريبا من هذه النقطة.
درجالكاشفالحجم (ميكرولتر)وقت الحضانة (بالدقائق)
1نيوترافيدين7.55
2ميجابايت-بارد10-
3κ-الكازين7.52
4MB-دافئ10-
5الأنابيب الدقيقة البيوتينيل (المخففة في MB-warm)1010
6MB-دافئ10-
7دافئ κ-الكازين7.52
82 نانومتر PRC1 مخفف في الكازين κ105
9الأنابيب الدقيقة غير البيوتينيل1010
10ميجابايت دافئة × 210-
11مزيج الفحص10-
البذور المرفقة مستقرة لمدة 20 دقيقة تقريبا في هذه المرحلة

الجدول 4: خطوات الفحص. قائمة الكواشف المضافة إلى غرفة التصوير ، مع الإشارة إلى وقت الغسيل (-) أو الحضانة.

الكاشفالحجم (ميكرولتر)
توبولين معاد تدويره، 10 ملغم/مل10
ميجابايت-بارد10.3
إم بي إم سي13.7
BRB80-DTT3.4
GTP ، 10 mM6.7
ATP، 10 مللي متر
(في حالة استخدام كينيسين)		6.7
توبولين المسمى بالفلورسنت ،
10 ملغم/مل		1

(إعادة تعليق التوبولين المجفف بالتجميد في BRB80-DTT البارد)

الجدول 5: مكونات مزيج التوبولين القابلة للذوبان. اخلطي في بداية التجربة وحافظي على الثلج.

figure-protocol-28477
الشكل 3: مخطط لإضافة مكونات الفحص لصنع وتصوير الحزم ذات العلامات الفلورية والأنابيب الدقيقة المفردة. تظهر البذور البيوتينيل باللون الأزرق والبذور غير البيوتينيل والتوبولين القابل للذوبان باللون الأحمر و PRC1 باللون الأسود والبروتين ذي الأهمية في السماوي. وتتطابق أرقام الخطوات في الشكل مع الأرقام الواردة في الجدول 4. تعرض اللوحة المقابلة للخطوة 9 حزمة مشكلة مسبقا (أسفل اليسار) ؛ تظهر الخطوة 11 حزمة تم تشكيلها حديثا (أعلى اليسار). تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. ديناميات الأنابيب الدقيقة للصور

  1. خلال فترة الحضانة التي تبلغ 10 دقائق في الخطوة 5.10 ، قم بإعداد 10 ميكرولتر من مزيج الفحص الذي يحتوي على بروتينات ذات أهمية ، توبولين قابل للذوبان ، نيوكليوتيدات ، زبالين الأكسجين 14 ، ومضادات الأكسدة وفقا للجدول 6. حافظ على المزيج على الجليد.
  2. قم بتحميل غرفة التصوير المعدة ، المسجلة على حامل الشريحة ، على هدف TIRF 100x. استخدم قناتي 560 نانومتر و647 نانومتر للعثور على مجال رؤية يحتوي على العدد الأمثل وكثافة الأنابيب الدقيقة المفردة والحزم.
    ملاحظة: إذا تم تصنيف كل من الأنابيب الدقيقة البيوتينيل وغير البيوتينيل بنفس الفلوروفور، فإن تحليلات المسح الضوئي للخطوط لشدة التألق يمكن أن تميز بين الأنابيب الدقيقة المفردة والحزم.
  3. بمجرد تحديد مجال الرؤية، التقط صورة مرجعية.
  4. تدفق بعناية في مزيج الفحص دون إزعاج غرفة التصوير.
  5. ختم الأطراف المفتوحة للغرفة مع تسرب فالاب.
  6. بدء تشغيل تسلسل التصوير كما هو موضح في الخطوة 4.5.1.
الكاشفالحجم (ميكرولتر)
مزيج توبولين قابل للذوبان4
OSF1
Trolox (إذا كنت تستخدم الأنابيب الدقيقة الموسومة بفلوروفور التبييض الضوئي بسهولة)1
ATP، 10 مللي متر
(في حالة استخدام كينيسين)		1
PRC1 (أو رابط متقاطع من اختيارك)1
البروتينات ذات الأهميةX
ميجابايت-بارد2-X

الجدول 6: فحص مكونات المزيج. امزج، واتدفق، واتدفق، وصور ديناميكيات الأنابيب الدقيقة، في غضون 30 دقيقة.

النتائج

تم إجراء التجربة الموصوفة أعلاه باستخدام أنابيب دقيقة بيوتينيل تحمل علامة الفلوروفور 647 نانومتر ، وأنابيب دقيقة غير بيوتينيل تحمل علامة الفلوروفور 560 نانومتر ، ومزيج توبولين قابل للذوبان يحمل علامة الفلوروفور 560 نانومتر. تم ربط الأنابيب الدقيقة بواسطة بروتين الربط المتقاطع PRC1 (المسمى GFP)....

Discussion

توسع التجربة الموصوفة هنا بشكل كبير نطاق وتعقيد اختبارات إعادة تشكيل الأنابيب الدقيقة التقليدية ، والتي يتم إجراؤها تقليديا على الأنابيب الدقيقة المفردة أو على نوع واحد من الصفيف. يوفر الفحص الحالي طريقة لتحديد ومقارنة نشاط MAP التنظيمي في وقت واحد على مجموعتين سكانيتين ، وهما الأنابيب ا?...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة (رقم 1DP2GM126894-01) ، وبأموال من صناديق بيو الخيرية ومؤسسة عائلة سميث إلى R.S. يشكر المؤلفون الدكتور شو جيانغ على مساهمته في تطوير وتحسين البروتوكولات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)Sigma Aldrich238813
1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)Sigma AldrichP6757
18x18 mm #1.5 coverslips Electron Microscopy Sciences63787
2-Mercaptoethanol (BME)Sigma AldrichM-6250
24x60 mm #1.5 coverslipsElectron Microscopy Sciences63793
405/488/560/647 nm Laser Quad Band ChromaTRF89901-NK
AcetoneSigma Aldrich320110
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)Sigma AldrichA7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®)Thermo Fischer ScientificA2666
Bath sonicator: Branson 2800 CleanerBransonCPX2800H
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mmBeckman-Coulter 343778
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mmBeckman-Coulter 343776
Biotin-PEG-SVA, MW 5,000Laysan Bio#Biotin-PEG-SVA-5000
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma Aldrich2905
CatalaseSigma AldrichC40
Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240VCorning6670
Delicate Task WipesKimtech34120
Dithiothreitol (DTT)GoldBioDTT10
Emission filterChromaET610/75m
Ethanol (200-proof)Decon Labs2705
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)Sigma Aldrich3777
Glucose OxidaseSigma AldrichG2133
GMPCPPJena Bioscience NU-405
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)Sigma AldrichG8877
Hellmanex III detergent Sigma AldrichZ805939
Immersion oil, Type AFisher Scientific77010
Kappa-caseinSigma AldrichC0406
LanolinFisher ScientificS25376
Lens Cleaning TissueThorLabsMC-5
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma AldrichM9272
MethylcelluloseSigma AldrichM0512
Microfuge 16 Benchtop CentrifugeBeckman-Coulter A46474
Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE FrostedGlobe Scientific1380-50W
mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 Laysan Bio#NH2-PEG-VA-5K
Optima™ Max-XP Tabletop UltracentrifugeBeckman-Coulter 393315
ParaffinFisher ScientificP31-500
PELCO Reverse (self-closing), Fine TweezersTed Pella5377-NM
Petrolatum, WhiteFisher Scientific18-605-050
Plasma Cleaner, 115VHarrick PlasmaPDC-001
Potassium Hydroxide (KOH)Sigma Aldrich221473
Sodium bicarbonateSigma AldrichS6014
SucroseSigma AldrichS7903
Thermal-Lok 1-Position Dry Heat BathUSA Scientific2510-1101
Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL TubesUSA Scientific2520-0000
Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mMThermo Fischer ScientificPI-77720
TIRF 100X NA 1.49 Oil ObjectiveNikonCFI Apochromat TIRF 100XC Oil
TIRF microscopeNikonEclipse Ti
TLA 120.1 rotorBeckman-Coulter 362224
TLA 120.2 rotorBeckman-Coulter 357656
Tubulin protein (>99% pure): porcine brainCytoskeletonT240
Tubulin Protein (Biotin): Porcine BrainCytoskeletonT333P
Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brainCytoskeletonTL670M
Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brainCytoskeletonTL620M
VECTABOND® Reagent, Tissue Section AdhesionVector BiolabsSP-1800-7
VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6AVWR97025-630

References

  1. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  2. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
  3. Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape. Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).
  4. Foe, V. E., von Dassow, G. Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation. The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).
  5. Pous, C., et al. Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells. The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).
  6. Uehara, R., Goshima, G. Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase. The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).
  7. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  8. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  9. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  10. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  11. Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module. Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).
  12. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  13. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  14. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  15. Wijeratne, S., Subramanian, R. Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A. eLife. 7, 32595 (2018).
  16. Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization. eLife. 10, 63880 (2021).
  17. Freal, A., et al. Feedback-driven assembly of the axon initial segment. Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).
  18. Ledbetter, M., Porter, K. A "microtubule" in plant cell fine structure. The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).
  19. Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved