Visualisation simultanée de la dynamique des microtubules réticulés et simples in vitro par microscopie TIRF

Résumé

Ici, un essai de reconstitution in vitro basé sur la microscopie TIRF est présenté pour quantifier et comparer simultanément la dynamique de deux populations de microtubules. Une méthode est décrite pour visualiser simultanément l’activité collective de plusieurs protéines associées aux microtubules sur des faisceaux de microtubules réticulés et des microtubules simples.

Résumé

Les microtubules sont des polymères d’hétérodimères d’αβ-tubuline qui s’organisent en structures distinctes dans les cellules. Les architectures et les réseaux basés sur des microtubules contiennent souvent des sous-ensembles de réseaux de microtubules qui diffèrent par leurs propriétés dynamiques. Par exemple, dans les cellules en division, des faisceaux stables de microtubules réticulés coexistent à proximité de microtubules dynamiques non réticulés. Les études de reconstitution in vitro basées sur la microscopie TIRF permettent la visualisation simultanée de la dynamique de ces différents réseaux de microtubules. Dans ce test, une chambre d’imagerie est assemblée avec des microtubules immobilisés en surface, qui sont soit présents sous forme de filaments simples, soit organisés en faisceaux réticulés. L’introduction de la tubuline, des nucléotides et des régulateurs de protéines permet une visualisation directe des protéines associées et des propriétés dynamiques des microtubules simples et réticulés. De plus, les changements qui se produisent lorsque des microtubules uniques dynamiques s’organisent en faisceaux peuvent être surveillés en temps réel. La méthode décrite ici permet une évaluation systématique de l’activité et de la localisation de protéines individuelles, ainsi que des effets synergiques des régulateurs de protéines sur deux sous-ensembles de microtubules différents dans des conditions expérimentales identiques, fournissant ainsi des informations mécanistes inaccessibles par d’autres méthodes.

Introduction

Les microtubules sont des biopolymères qui forment des échafaudages structurels essentiels à de multiples processus cellulaires, allant du transport intracellulaire et du positionnement des organites à la division cellulaire et à l’allongement. Pour exécuter ces diverses fonctions, les microtubules individuels sont organisés en réseaux de la taille d’un micron, tels que les fuseaux mitotiques, les axonèmes ciliaires, les faisceaux neuronaux, les réseaux interphasiques et les réseaux corticaux végétaux. Un motif architectural omniprésent que l’on retrouve dans ces structures est un faisceau de microtubules réticulés sur toute leur ^longueur1. Une....

Protocole

1. Préparez les réactifs

1. Préparer les tampons et les réactifs comme indiqué dans les tableaux 1 et 2. Pendant l’expérience, conservez toutes les solutions sur la glace, sauf indication contraire.

Solution	Composants		Durée de stockage recommandée	Notes
5X BRB80	400 mM K-PIPES, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, pH 6,8 avec K....

Résultats

L’expérience décrite ci-dessus a été réalisée à l’aide de microtubules biotinylés marqués au fluorophore de 647 nm, de microtubules non biotinylés marqués au fluorophore de 560 nm et d’un mélange de tubuline soluble marqué au fluorophore de 560 nm. Les microtubules ont été réticulés par la protéine réticulée PRC1 (marquée GFP). Après la génération de faisceaux immobilisés en surface et de microtubules simples (étape 5.11), la chambre d’imagerie a été montée sur un objectif d’huile T.......

Discussion

L’expérience décrite ici élargit considérablement la portée et la complexité des essais conventionnels de reconstitution de microtubules, qui sont traditionnellement effectués sur des microtubules simples ou sur un type de réseau. Le test actuel fournit une méthode pour quantifier et comparer simultanément l’activité map régulatrice sur deux populations, à savoir les microtubules simples et les faisceaux réticulés. De plus, ce test permet d’examiner deux types de faisceaux : ceux qui sont préformés.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)	Sigma Aldrich	238813
1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)	Sigma Aldrich	P6757
18x18 mm #1.5 coverslips	Electron Microscopy Sciences	63787
2-Mercaptoethanol (BME)	Sigma Aldrich	M-6250
24x60 mm #1.5 coverslips	Electron Microscopy Sciences	63793
405/488/560/647 nm Laser Quad Band	Chroma	TRF89901-NK
Acetone	Sigma Aldrich	320110
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)	Sigma Aldrich	A7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®)	Thermo Fischer Scientific	A2666
Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner	Branson	CPX2800H
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm	Beckman-Coulter	343778
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm	Beckman-Coulter	343776
Biotin-PEG-SVA, MW 5,000	Laysan Bio	#Biotin-PEG-SVA-5000
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	2905
Catalase	Sigma Aldrich	C40
Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V	Corning	6670
Delicate Task Wipes	Kimtech	34120
Dithiothreitol (DTT)	GoldBio	DTT10
Emission filter	Chroma	ET610/75m
Ethanol (200-proof)	Decon Labs	2705
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	3777
Glucose Oxidase	Sigma Aldrich	G2133
GMPCPP	Jena Bioscience	NU-405
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)	Sigma Aldrich	G8877
Hellmanex III detergent	Sigma Aldrich	Z805939
Immersion oil, Type A	Fisher Scientific	77010
Kappa-casein	Sigma Aldrich	C0406
Lanolin	Fisher Scientific	S25376
Lens Cleaning Tissue	ThorLabs	MC-5
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma Aldrich	M9272
Methylcellulose	Sigma Aldrich	M0512
Microfuge 16 Benchtop Centrifuge	Beckman-Coulter	A46474
Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted	Globe Scientific	1380-50W
mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000	Laysan Bio	#NH2-PEG-VA-5K
Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge	Beckman-Coulter	393315
Paraffin	Fisher Scientific	P31-500
PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers	Ted Pella	5377-NM
Petrolatum, White	Fisher Scientific	18-605-050
Plasma Cleaner, 115V	Harrick Plasma	PDC-001
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma Aldrich	221473
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath	USA Scientific	2510-1101
Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes	USA Scientific	2520-0000
Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM	Thermo Fischer Scientific	PI-77720
TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective	Nikon	CFI Apochromat TIRF 100XC Oil
TIRF microscope	Nikon	Eclipse Ti
TLA 120.1 rotor	Beckman-Coulter	362224
TLA 120.2 rotor	Beckman-Coulter	357656
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain	Cytoskeleton	T240
Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain	Cytoskeleton	T333P
Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain	Cytoskeleton	TL670M
Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain	Cytoskeleton	TL620M
VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion	Vector Biolabs	SP-1800-7
VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A	VWR	97025-630