Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF

Resumen

Aquí, se presenta un ensayo de reconstitución in vitro basado en microscopía TIRF para cuantificar y comparar simultáneamente la dinámica de dos poblaciones de microtúbulos. Se describe un método para ver simultáneamente la actividad colectiva de múltiples proteínas asociadas a microtúbulos en haces de microtúbulos reticulados y microtúbulos individuales.

Resumen

Los microtúbulos son polímeros de heterodímeros de αβ-tubulina que se organizan en estructuras distintas en las células. Las arquitecturas y redes basadas en microtúbulos a menudo contienen subconjuntos de matrices de microtúbulos que difieren en sus propiedades dinámicas. Por ejemplo, en las células en división, los haces estables de microtúbulos reticulados coexisten muy cerca de los microtúbulos dinámicos no reticulados. Los estudios de reconstitución in vitro basados en microscopía TIRF permiten la visualización simultánea de la dinámica de estas diferentes matrices de microtúbulos. En este ensayo, se ensambla una cámara de imágenes con microtúbulos inmovilizados en la superficie, que están presentes como filamentos individuales u organizados en haces reticulados. La introducción de tubulina, nucleótidos y reguladores de proteínas permite la visualización directa de proteínas asociadas y de las propiedades dinámicas de microtúbulos simples y reticulados. Además, los cambios que ocurren a medida que los microtúbulos individuales dinámicos se organizan en haces se pueden monitorear en tiempo real. El método descrito aquí permite una evaluación sistemática de la actividad y localización de proteínas individuales, así como los efectos sinérgicos de los reguladores de proteínas en dos subconjuntos de microtúbulos diferentes en condiciones experimentales idénticas, proporcionando así información mecanicista que es inaccesible por otros métodos.

Introducción

Los microtúbulos son biopolímeros que forman andamios estructurales esenciales para múltiples procesos celulares, que van desde el transporte intracelular y el posicionamiento de orgánulos hasta la división celular y el alargamiento. Para ejecutar estas diversas funciones, los microtúbulos individuales se organizan en matrices del tamaño de micras, como husos mitóticos, axonemas ciliares, haces neuronales, matrices interfase y matrices corticales de plantas. Un motivo arquitectónico omnipresente que se encuentra en estas estructuras es un haz de microtúbulos reticulados a lo largo de sus ^longitudes1. Una característica intrigante de varias estr....

Protocolo

1. Preparar reactivos

1. Prepare tampones y reactivos como se describe en la Tabla 1 y la Tabla 2. Durante el experimento, mantenga todas las soluciones en hielo, a menos que se indique lo contrario.

Solución	Componentes		Duración de almacenamiento recomendada	Notas
5X BRB80	400 mM K-PIPES, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, pH....

Resultados

El experimento descrito anteriormente se realizó utilizando microtúbulos biotinilados marcados con fluoróforos de 647 nm, microtúbulos no biotinilados marcados con fluoróforos de 560 nm y mezcla de tubulina soluble marcada con fluoróforos de 560 nm. Los microtúbulos fueron reticulados por la proteína reticulante PRC1 (marcada con GFP). Después de generar haces inmovilizados en la superficie y microtúbulos individuales (paso 5.11), la cámara de imágenes se montó en un objetivo de aceite TIRF 100X 1.49 NA y se.......

Discusión

El experimento descrito aquí amplía significativamente el alcance y la complejidad de los ensayos convencionales de reconstitución de microtúbulos, que tradicionalmente se realizan en microtúbulos individuales o en un tipo de matriz. El ensayo actual proporciona un método para cuantificar y comparar simultáneamente la actividad reguladora de MAP en dos poblaciones, a saber, microtúbulos individuales y haces reticulados. Además, este ensayo permite el examen de dos tipos de haces: los que están preformados a par.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)	Sigma Aldrich	238813
1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)	Sigma Aldrich	P6757
18x18 mm #1.5 coverslips	Electron Microscopy Sciences	63787
2-Mercaptoethanol (BME)	Sigma Aldrich	M-6250
24x60 mm #1.5 coverslips	Electron Microscopy Sciences	63793
405/488/560/647 nm Laser Quad Band	Chroma	TRF89901-NK
Acetone	Sigma Aldrich	320110
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)	Sigma Aldrich	A7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®)	Thermo Fischer Scientific	A2666
Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner	Branson	CPX2800H
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm	Beckman-Coulter	343778
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm	Beckman-Coulter	343776
Biotin-PEG-SVA, MW 5,000	Laysan Bio	#Biotin-PEG-SVA-5000
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	2905
Catalase	Sigma Aldrich	C40
Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V	Corning	6670
Delicate Task Wipes	Kimtech	34120
Dithiothreitol (DTT)	GoldBio	DTT10
Emission filter	Chroma	ET610/75m
Ethanol (200-proof)	Decon Labs	2705
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	3777
Glucose Oxidase	Sigma Aldrich	G2133
GMPCPP	Jena Bioscience	NU-405
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)	Sigma Aldrich	G8877
Hellmanex III detergent	Sigma Aldrich	Z805939
Immersion oil, Type A	Fisher Scientific	77010
Kappa-casein	Sigma Aldrich	C0406
Lanolin	Fisher Scientific	S25376
Lens Cleaning Tissue	ThorLabs	MC-5
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma Aldrich	M9272
Methylcellulose	Sigma Aldrich	M0512
Microfuge 16 Benchtop Centrifuge	Beckman-Coulter	A46474
Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted	Globe Scientific	1380-50W
mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000	Laysan Bio	#NH2-PEG-VA-5K
Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge	Beckman-Coulter	393315
Paraffin	Fisher Scientific	P31-500
PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers	Ted Pella	5377-NM
Petrolatum, White	Fisher Scientific	18-605-050
Plasma Cleaner, 115V	Harrick Plasma	PDC-001
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma Aldrich	221473
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath	USA Scientific	2510-1101
Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes	USA Scientific	2520-0000
Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM	Thermo Fischer Scientific	PI-77720
TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective	Nikon	CFI Apochromat TIRF 100XC Oil
TIRF microscope	Nikon	Eclipse Ti
TLA 120.1 rotor	Beckman-Coulter	362224
TLA 120.2 rotor	Beckman-Coulter	357656
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain	Cytoskeleton	T240
Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain	Cytoskeleton	T333P
Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain	Cytoskeleton	TL670M
Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain	Cytoskeleton	TL620M
VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion	Vector Biolabs	SP-1800-7
VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A	VWR	97025-630