JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يظهر هنا وصف للعزل المباشر والسريع نسبيا للحمض النووي الجينومي Caenorhabditis elegans من واحد أو عدد قليل من الحيوانات باستخدام مجموعة أنسجة متاحة تجاريا. إعداد gDNA الناتج هو قالب مناسب ل PCR.

Abstract

استخراج الحمض النووي الجينومي من واحد أو عدد قليل من Caenorhabditis elegans له العديد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك PCR لخطوط التنميط الجيني والاستنساخ والتسلسل. تستغرق الطرق التقليدية القائمة على البروتين K لاستخراج الحمض النووي الجيني من C. elegans عدة ساعات. مجموعات الاستخراج التجارية التي تكسر بشكل فعال بشرة C. elegans واستخراج الحمض النووي الجينومي محدودة. يتم الإبلاغ هنا عن طريقة سهلة وأسرع (~ 15 دقيقة) وفعالة من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي الجينومي C. elegans الذي يعمل بشكل جيد لتطبيقات الفصول الدراسية والبحوث. تم تحسين طريقة استخراج الحمض النووي هذه لاستخدام اليرقات المتأخرة (L4) أو الديدان الخيطية البالغة كمادة أولية للحصول على قالب موثوق به لأداء PCR. تشير النتائج إلى أن جودة الحمض النووي مناسبة لتضخيم الأهداف الجينية ذات الأحجام المختلفة بواسطة PCR ، مما يسمح بالتنميط الجيني لحيوان واحد أو عدد قليل حتى عند التخفيف إلى واحد من خمسين من الحمض النووي الجيني من شخص بالغ واحد لكل تفاعل. يمكن استخدام البروتوكولات المبلغ عنها بشكل موثوق لإنتاج قالب الحمض النووي بسرعة من عينة واحدة أو صغيرة من C. elegans للتطبيقات القائمة على PCR.

Introduction

هنا ، يتم تقديم بروتوكولين مرتبطين بتحلل Caenorhabditis elegans لجعل الحمض النووي متاحا للتطبيقات القائمة على PCR. PCR هي تقنية جزيئية شائعة الاستخدام تستخدم للعديد من التطبيقات ، بما في ذلك التنميط الجيني وتضخيم شظايا الحمض النووي للاستنساخ والتسلسل ، من بين أمور أخرى. الدودة المستديرة الصغيرة (1 مم) التي تعيش بحرية C. elegans هي نظام حيواني شائع للبحوث البيولوجية. الحصول على الحمض النووي الجينومي المناسب من واحد أو عدد قليل من الحيوانات يكفي لتضخيم التسلسل بواسطة PCR. تحتوي يرقات L4 المتأخرة والبالغين على حوالي 1000 خلية جسدية فقط (بما في ذلك بعض الخلايا متعددة النواة ومتعددة الصبغيات) ، والخلايا الجرثومية ، و (إذا كان الحيوان خنثى محبوذا) ذرية في الرحم1. ومع ذلك ، فإن هذه الحيوانات محمية بواسطة بشرة يجب تعطيلها لاستخراج الحمض النووي الجينومي2. تتضمن الطرق القياسية لإعداد قالب الحمض النووي الجيني الخيطي ل PCR خطوات متعددة وتستغرق عدة ساعات. يتم تجميد الحيوانات أولا في مخزن تحلل الدودة الذي يحتوي على بروتين K (-70 درجة مئوية أو أقل) لمدة 15-45 دقيقة على الأقل (يوصى ببعض البروتوكولات بفترة أطول) 3،4،5،6. هذه الخطوة الشقوق فتح الحيوانات.

بعد التجميد ، يتم تحضين الحيوانات لمدة 1 ساعة عند 60-65 درجة مئوية حتى يعمل البروتين K ، ثم يتم تعطيل الإنزيم لمدة 15-30 دقيقة عند 95 درجة مئوية. البروتيناز K يدمر النوكليز الذي يتحلل الحمض النووي. يعد تعطيل البروتين K قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل أمرا مهما لمنع البروتين K من تدهور بوليميراز الحمض النووي. البروتوكولان القائمان على المجموعة الموصوفان هنا هما طريقتان سريعتان وموثوقتان وفعالتان من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي الجيني من واحد أو عدد قليل من الديدان الخيطية للبحث اليومي وتدريس التطبيقات المختبرية. تم تحسين المجموعة المستخدمة في الأصل من قبل الشركة المصنعة لاستخراج الحمض النووي من الأنسجة الحيوانية واللعاب والشعر7. ويستخدم حل إعداد الأنسجة الملكية وحل استخراج لتحليل الخلايا وجعل الحمض النووي الجينومي في متناول اليد. ثم يقوم حل تحييد الملكية بتحييد المكونات التي قد تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل (على سبيل المثال ، الأملاح والأيونات والجزيئات المرتبطة ب Mg2+).

عند التنميط الجيني ، يمكن اختبار واحد. عند تحديد ما إذا كانت السلالة متماثلة الزيجوت ، فإن اختبار ستة أو أكثر من النسل من واحد يعطي ثقة عالية بأن الخط متماثل الزيجوت أم لا (هناك فرصة بنسبة 0.02٪ لاختيار ستة ذرية متحولة متماثلة الزيجوت عشوائيا من أحد الوالدين غير المتجانسين [(1/4)6 × 100٪ = 0.02٪]). هذه الطريقة 1) مباشرة ، مع خطوات أقل من طريقة proteinase K ، و 2) تقلل من وقت إعداد القالب إلى 15 دقيقة. تظهر النتائج في هذا العمل أن البروتوكول المطور يعمل بقوة في استخراج الحمض النووي الجيني من ديدان مفردة أو قليلة ، والتي يمكن استخدامها بشكل موثوق في التطبيقات النهائية التي لا تتطلب الحمض النووي عالي النقاء ، بما في ذلك PCR.

Protocol

1. C. صيانة elegans

ملاحظة: تم الحفاظ على سلالات N2 (النوع البري) و blmp-1 (tm548) C. elegans على لوحات وسائط نمو الديدان الخيطية القياسية (NGM) عند 20 درجة مئوية.

  1. تحضير لوحات NGM عن طريق إذابة 23.005 غرام من مسحوق NGM في 973 مل من الماء في قارورة 2 لتر. قم بتغطية فتحة القارورة بورق الألومنيوم (أو غطاء قابل للتعقيم يسمح بالتهوية) وقم بتأمين الغطاء بشريط الأوتوكلاف. الأوتوكلاف لإذابة المسحوق وتعقيم المحتويات بدورة تعقيم لا تقل عن 30 دقيقة.
  2. تبريد المتوسطة إلى 60 درجة مئوية في حمام مائي.
  3. إلى الوسط المبرد ، أضف 25 مل من الفوسفات المعقم 1 م (KH2PO4) المخزن المؤقت ، الرقم الهيدروجيني 6.0 ؛ 1 مل من محلول كلوريد الكالسيوم 1 م ؛ و 1 مل من محلول كبريتات المغنيسيوم 1 م.
  4. حرك الوسط على صفيحة تحريك مغناطيسية للحصول على خليط متجانس ولمنع التبريد والتصلب غير المتكافئين (~ 5 دقائق). تأكد من أن شريط التحريك يدور بسرعة كافية لإنشاء دوامة ولكن ليس بسرعة كبيرة بحيث يتم إدخال فقاعات (~ 250-300 دورة في الدقيقة).
  5. صب ~ 25 مل من الوسط في كل لوحة بتري 10 سم (~ 40 لوحة في المجموع). جفف الألواح في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها (عادة 16-25 درجة مئوية).
  6. تنمو مستعمرة من الإشريكية القولونية OP50 في 30-50 مل من مرق LB بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
  7. قم بزرع كل طبق يحتوي على 500 ميكرولتر من ثقافة E. coli OP50 واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام (عادة 16-25 درجة مئوية)8. تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
  8. انقل C. elegans إلى ألواح البذور باستخدام معول سلكي أو طريقة أخرى واتركها تنمو إلى L4 أو مرحلة البالغين عند درجة الحرارة المطلوبة للسلالة (عادة 16-25 درجة مئوية ، 1-2 أيام إذا كانت الحيوانات مطلية جوعا كداور ، 3-4 أيام إذا كانت الحيوانات مطلية كأجنة)8.

2. استخراج الحمض النووي للدودة الواحدة

ملاحظة: هذه الطريقة مفيدة لاستخراج الحمض النووي من دودة واحدة (دودة واحدة في 1.8 ميكرولتر من الحجم الكلي). يمكن عمل مزيج رئيسي إذا تم تحليل ديدان متعددة في وقت واحد.

  1. قم ببرمجة دورة حرارية لدورة واحدة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (برنامج التحلل).
  2. Aliquot 0.8 ميكرولتر من محلول الاستخراج من المجموعة على الجدار الداخلي لأنبوب PCR 0.2 مل على الجليد. أضف 0.2 ميكرولتر من محلول تحضير الأنسجة من المجموعة إلى قطرة محلول الاستخراج. اخلط عن طريق السحب.
  3. تحديد L4 أو بالغ تحت المجهر تشريح9. لتحديد خنثى L4 ، ابحث عن فرج مميز مرئي كنصف دائرة شاحبة في منتصف الحيوان. تحديد الخنثى البالغ من خلال البحث عن أكبر الحيوانات على اللوحة التي قد تحتوي على أجنة بيضاوية مرئية في رحمها.
  4. باستخدام اختيار سلك بلاتيني ، انقل الحيوان المحدد إلى الحل10.
  5. قم بالطرد المركزي للأنبوب لفترة وجيزة (2-3 ثوان ، ≤6000 دورة في الدقيقة / 2000 × جم) في درجة حرارة الغرفة لجمع المحتويات في أسفل الأنبوب.
  6. ضع الأنبوب في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل برنامج التحلل المعين في الخطوة 2.1.
  7. عند اكتمال البرنامج ، قم بطرد مركزي الأنبوب لفترة وجيزة ووضعه على الجليد. أضف 0.8 ميكرولتر من محلول التحييد من المجموعة إلى الخليط. اخلط عن طريق السحب.
  8. قم بطرد الأنبوب لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة (2-3 ثوان ، ≤6000 دورة في الدقيقة / 2000 × جم).
  9. استخدم الليزات مباشرة لتفاعل البوليميراز المتسلسل أو قم بتخزينه عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
    ملاحظة: الحمض النووي المستخرج مستقر عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل7.

3. استخراج الحمض النووي لعدد قليل من الأفراد

ملاحظة: هذه الطريقة مفيدة لاستخراج الحمض النووي من عدد قليل من الديدان. يمكن تحضير مزيج رئيسي إذا تم تحليل سلالات متعددة في وقت واحد.

  1. قم ببرمجة جهاز التدوير الحراري لدورة واحدة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق متبوعا ب 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (برنامج التحلل).
  2. Aliquot 2.0 ميكرولتر من محلول الاستخراج من المجموعة على الجدار الداخلي لأنبوب PCR 0.2 مل على الجليد. أضف 0.5 ميكرولتر من محلول تحضير الأنسجة من المجموعة إلى قطرة محلول الاستخراج. اخلط عن طريق السحب.
  3. تحديد L4 أو الحيوانات البالغة تحت المجهر تشريح9. يحتوي الخنثى L4 على فرج مميز مرئي كنصف دائرة شاحبة في منتصف الحيوان. الخنثى البالغ هو أكبر الحيوانات على الصفيحة وقد يكون لديه أجنة بيضاوية مرئية في رحمه.
  4. باستخدام اختيار سلك بلاتيني ، انقل بعض الحيوانات إلى المحلول: 9 تنتج ما يعادل حيوانا واحدا من الحمض النووي الجينومي لكل 0.5 ميكرولتر من الليزات ، و 16 حيوانا ينتج ~ 1 مكافئ حيواني من الحمض النووي الجينومي في 0.25 ميكرولتر (3.5 نيماتودا / ميكرولتر) 10.
    ملاحظة: من الصعب نقل أكثر من 16 حيوانا إلى هذا المجلد.
  5. قم بطرد الأنبوب لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة (2-3 ثوان ، ≤6000 دورة في الدقيقة / 2000 × جم).
  6. ضع الأنبوب في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل برنامج التحلل المعين في الخطوة 3.1.
  7. عند اكتمال البرنامج ، قم بطرد مركزي الأنبوب لفترة وجيزة ووضعه على الجليد. أضف 2 ميكرولتر من محلول التحييد من المجموعة إلى الخليط. اخلط عن طريق السحب.
  8. قم بطرد الأنبوب لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة (2-3 ثوان ، ≤6000 دورة في الدقيقة / 2000 × جم).
  9. استخدم التحلل مباشرة لتفاعل البوليميراز المتسلسل أو قم بتخزينه عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
    ملاحظة: الحمض النووي المستخرج مستقر عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل7.

4. تفاعل البوليميراز المتسلسل

ملاحظة: يتم وصف أحد التطبيقات النهائية لتقنية تحلل الدودة هذه ، وهو اكتشاف طفرة حذف باستخدام بوليميراز سريع. كما تم إثبات فعالية بروتوكولي تحلل الدودة في إنتاج الحمض النووي لقالب الجينوم لنجاح تفاعل البوليميراز المتسلسل عند التخفيف إلى 1/50 منالدودة لكل تفاعل.

  1. استخراج الحمض النووي من دودة واحدة و 16 دودة باستخدام النوع البري N2 والسلالات المتحولة ، كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2 والخطوة 3.
  2. قم بإعداد تخفيفات 2 و 10 و 20 و 50 ضعفا من الحمض النووي أحادي الدودة من الحيوانات البرية N2.
  3. قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة باستخدام الاشعال الخاصة بتسلسل الاهتمام والمزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (الجدول 1 والجدول 2). استخدم 1 ميكرولتر من الحمض النووي غير المخفف أو 2 ميكرولتر من الحمض النووي المخفف كقالب في كل تفاعل.
  4. تأكد من منتجات PCR عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي والتصوير11.

النتائج

تم استخراج الحمض النووي الجيني من شخص واحد أو عدد قليل من البالغين من النوع البري باستخدام المجموعة التجارية أو بروتوكول التحلل التقليدي لمقارنة فعالية هاتين الطريقتين. ثم تم استخدام هذه الليزات كقوالب ل PCR لتضخيم إما هدف أكبر من ~ 2,100 bp (ترميز blmp-1) أو هدف أصغر من ~ 500 bp (ترميز جزء من sma-1...

Discussion

يعد تحديد الأنماط الجينية ل C. elegans خطوة مهمة أثناء إجراء الصلبان الجينية لإنشاء سلالات C. elegans جديدة. يعد استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام واحد أو عدد قليل من C. elegans خطوة حاسمة في التنميط الجيني C. elegans. يصف هذا البروتوكول استخراج الحمض النووي الجيني من C. elegans باست?...

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

تم الحصول على سلالة N2 وبكتيريا E. coli OP50 من مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ، الذي يموله مكتب برامج البنية التحتية البحثية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (P40 OD010440). تم الحصول على سلالة blmp-1 (tm548) من المشروع الوطني للموارد الحيوية ، اليابان. يشكر المؤلفون WormBase. تم دعم هذا العمل من قبل NIH R01GM097591 إلى T.L.G. ، والتمويل الداخلي من جامعة تكساس للمرأة إلى T.L.G ، ومركز TWU لأبحاث الطلاب إلى M.F.L.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
autoclave tapeDefend43237-2
aluminium foil, heavy dutyReynolds Wrap2182934
calcium chlorideMillipore Sigma102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)Sigma-Aldrich Co. LLCXNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrerFisher Scientific11-100-495H
LB media, Lennox, capsulesMP Biomedicals, LLC3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrousThermo ScientificAC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifugeLabnet International, Inc.PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymeraseNew England Biolabs, Inc.M0515S"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powderUS Biological Life SciencesN1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNew England Biolabs, Inc.M0531S"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primersIntegrated DNA Technologiescustom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymeraseTakara Bio Inc.R050B"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)New England Biolabs, Inc.N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master MixTakara Bio Inc.RR350A"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mixSigma-Aldrich Co. LLCP4600"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cyclerApplied BiosystemsA24812
stir barFisher Scientific14-512-126
vortex mixerFisher Scientific2215365
worm pickGenesee Scientific Corporation59-AWP

References

  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  2. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
  3. Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
  4. Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
  5. Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-10 (2008).
  6. Biron, D., Haspel, G. . C. elegans: Methods and Applications. , (2015).
  7. . Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013)
  8. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  9. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
  10. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
  11. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
  12. Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
  13. Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
  14. Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
  15. Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
  16. Huang, T. -. F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
  17. Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
  18. Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184 Caenorhabditis elegans PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved