Caenorhabditis elegans Genomic DNA의 소규모 추출

요약

여기에 제시된 것은 시판되는 조직 키트를 사용하여 하나 또는 몇몇 동물로부터 예 쁜꼬마선충 게놈 DNA의 간단하고 비교적 신속한 분리에 대한 설명이다. 생성된 gDNA 제제는 PCR에 적합한 주형이다.

초록

단일 또는 몇몇 예쁜꼬마선충으로부터의 게놈 DNA 추출 은 유전자형 분석, 클로닝 및 시퀀싱을 위한 PCR을 포함한 많은 다운스트림 응용을 갖는다. C. elegans 에서 게놈 DNA 추출을위한 전통적인 프로테이나제 K 기반 방법은 몇 시간이 걸립니다. C. elegans 표피를 효과적으로 열고 게놈 DNA를 추출하는 상업적 추출 키트는 제한적입니다. 교실 및 연구 응용 분야에 잘 작동하는 C. elegans 게놈 DNA를 추출하는 쉽고 빠르며 비용 효율적인 방법이 여기에보고되었습니다. 이 DNA 추출 방법은 PCR을 수행하기 위해 신뢰할 수있는 주형을 얻기 위한 출발 물질로서 단일 또는 몇 개의 후기 유충 (L4) 또는 성인 선충류를 사용하도록 최적화되어 있습니다. 결과는 DNA 품질이 PCR에 의해 상이한 크기의 유전자 표적을 증폭시키는 데 적합하다는 것을 나타내며, 반응 당 단일 성인으로부터 게놈 DNA의 일-오십분의 일로 희석 된 경우에도 단일 또는 몇 마리의 동물의 유전자형을 허용한다. 보고된 프로토콜은 PCR 기반 응용을 위해 C. elegans 의 단일 또는 작은 샘플로부터 DNA 주형을 신속하게 생산하는데 신뢰성 있게 사용될 수 있다.

서문

여기에서, PCR 기반 응용을 위해 DNA에 접근할 수 있도록 예쁜꼬마선충의 용해를 위한 두 가지 관련 프로토콜이 제시된다. PCR은 클로닝 및 시퀀싱을 위한 DNA 단편의 지노타이핑 및 증폭을 포함한 많은 응용 분야에 일반적으로 사용되는 분자 기술입니다. 작은 (1mm), 자유 살아있는 회충 C. elegans는 생물학적 연구를위한 인기있는 동물 시스템입니다. 단일 동물 또는 몇몇 동물로부터 적합한 게놈 DNA를 수득하는 것은 PCR에 의해 서열을 증폭시키기에 충분하다. 후기 L4 유충과 성인은 utero 1의 ~ 1,000 개의 체세포 (일부 다중 핵, 다발성 세포 포함), 생식 세포 및 (동물이 gravid hermaphrodite인 경우) 자손 만 ^{포함합니다.} 그러나, 이들 동물은 게놈 DNA²를 추출하기 위해 파쇄되어야 하는 표피에 의해 보호된다. PCR을 위해 선충류 게놈 DNA 주형을 준비하는 표준 방법은 여러 단계를 포함하며 몇 시간이 걸립니다. 동물들은 먼저 프로테이나제 K를 함유하는 웜 용해 완충액(-70°C 이하)에서 적어도 15-45분(일부 프로토콜에 의해 더 긴 것이 권장됨)^3,4,5,6 동안 동결된다. 이 단계는 동물을 열어줍니다.

동결 후, 동물을 프로테이나제 K가 작용하도록 60-65°C에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 효소를 95°C에서 15-30분 동안 불활성화시킨다. 프로테이나제 K는 DNA를 분해하는 뉴클레아제를 파괴합니다. PCR 전에 프로테이나제 K의 불활성화는 프로테이나제 K가 DNA 중합효소를 분해하는 것을 방지하는 데 중요하다. 여기에 설명 된 두 가지 키트 기반 프로토콜은 일상적인 연구 및 교육 실험실 응용 프로그램을 위해 단일 동물 또는 몇 마리의 선충류에서 게놈 DNA를 추출하는 빠르고 안정적이며 비용 효율적인 방법입니다. 사용 된 키트는 원래 제조업체가 동물 조직, 타액 및 모발에서 DNA를 추출하도록 최적화되었습니다⁷. 독점적 인 조직 준비 솔루션과 추출 용액을 사용하여 세포를 용해시키고 게놈 DNA에 접근 할 수 있도록합니다. 그런 다음 독점 중화 용액은 PCR을 억제할 수 있는 성분(예: 염, 이온 및^Mg2+ 결합 분자)을 중화시킵니다.

유전자형을 만들 때 단일 동물을 테스트 할 수 있습니다. 균주가 동형접합성인지 판단할 때, 단일 동물로부터 6개 이상의 자손을 시험하는 것은 선이 동형접합성인지 아닌지에 대한 높은 확신을 준다(이형접합성 부모로부터 6개의 동형접합성 돌연변이 자손을 무작위로 선별할 확률은 0.02%이다[(1/4)⁶ × 100% = 0.02%]). 이 방법은 1) 프로테이나제 K 방법보다 적은 단계로, 간단하고, 2) 주형 준비 시간을 15분으로 감소시킨다. 이 연구의 결과는 개발 된 프로토콜이 단일 또는 몇 개의 웜에서 게놈 DNA를 추출하는 데 강력하게 작동한다는 것을 보여 주며, 이는 PCR을 포함하여 고도로 정제 된 DNA를 필요로하지 않는 하류 응용 분야에 안정적으로 사용될 수 있습니다.

프로토콜

1. C. 엘레간 유지 보수

주: N2(야생형) 및 blmp-1(tm548) C. 엘레간 균주는 20°C에서 표준 선충류 성장 배지(NGM) 플레이트 상에서 유지되었다.

1. 23.005 g의 NGM 분말을 973 mL의 물에 용해시켜 NGM 플레이트를 2 L 플라스크에 제조하였다. 플라스크 개구부를 알루미늄 호일(또는 통풍이 가능한 오토클레이브 캡)으로 덮고 오토클레이브 테이프로 덮개를 고정합니다. 오토클레이브는 분말을 용해시키고 적어도 30분의 멸균 주기로 내용물을 멸균한다.
2. 배지를 수조에서 60°C로 냉각시킨다.
3. 냉각된 매질에, 멸균 1 M 포스페이트 (KH2PO4) 완충액₂₅mL를 첨가하여, pH 6.0; 1 mL의 1 M 염화칼슘 용액; 및 1 mL의 1 M 황산마그네슘 용액.
4. 마그네틱 교반 플레이트 상에서 배지를 교반하여 균질한 혼합물을 수득하고 고르지 않은 냉각 및 응고를 방지한다(∼5분). 교반 막대가 소용돌이를 만들 수있을만큼 빠르게 회전하지만 거품이 유입 될 정도로 빠르지는 않은지 확인하십시오 (~ 250-300 rpm).
5. 배지 25 mL를 각 10 cm 페트리 플레이트 (총 40 플레이트)에 붓는다. 플레이트를 실온에서 밤새 건조시킨다(전형적으로 16-25°C).
6. 에스케리치아 콜리 OP50의 콜로니를 37°C에서 하룻밤 동안 LB 브로스 30-50 mL에 성장시킨다.
7. 각 플레이트를 500 μL의 대장균 OP50 배양액으로 시드하고 사용 전에 실온 (전형적으로 16-25°C)에서 건조시킨다⁸. 플레이트를 최대 3주 동안 4°C에서 보관한다.
8. C. 엘레간을 와이어 픽 또는 다른 방법을 사용하여 시딩된 플레이트에 옮기고 균주에 필요한 온도에서 L4 또는 성인 단계로 성장시키게 하였다(전형적으로 16-25°C, 동물을 도어로서 굶주린 채로 플레이팅한 경우 1-2일, 동물을 배아로 플레이팅한 경우 3-4일)⁸.

2. 단일 웜 DNA 추출

참고: 이 방법은 단일 웜(총 부피의 1.8μL에 있는 하나의 웜)에서 DNA를 추출하는 데 유용합니다. 한 번에 여러 웜이 용해되는 경우 마스터 믹스를 만들 수 있습니다.

1. 55°C에서 10분 동안 1 사이클 동안 열사이클러를 프로그램하고, 이어서 95°C에서 3분 동안 프로그램한다(용해 프로그램).
2. 키트로부터 추출 용액 0.8 μL를 얼음 위에 0.2 mL PCR 튜브의 내벽 상에 분취한다. 0.2 μL의 조직 준비 용액을 키트로부터 추출 용액의 액적에 첨가한다. 피펫팅으로 혼합하십시오.
3. 해부 현미경으로 L4 또는 성인 동물을 확인하십시오⁹. L4 hermaphrodites를 식별하려면 동물 한가운데에 창백한 반원으로 보이는 특징적인 외음부를 찾으십시오. 자궁에 타원형 배아가 보일 수있는 판에서 가장 큰 동물을 찾아 성인 hermaphrodite를 확인하십시오.
4. 백금 와이어 픽을 사용하여, 선택된 동물을 용액 10 내로^옮긴다.
5. 튜브를 실온에서 간단히 (2-3 s, ≤6,000 rpm/2,000 × g) 원심분리하여 튜브 바닥에서 내용물을 수집한다.
6. 튜브를 열순환기에 넣고 단계 2.1에서 설정된 용해 프로그램을 실행합니다.
7. 프로그램이 완료되면 튜브를 간단히 원심 분리하여 얼음 위에 놓습니다. 0.8 μL의 중화 용액을 키트로부터 혼합물에 첨가한다. 피펫팅으로 혼합하십시오.
8. 튜브를 실온에서 간단히 원심분리한다(2-3초, ≤6,000rpm/2,000 × g).
9. 용해물을 PCR을 위해 직접 사용하거나 향후 사용을 위해 4 °C 또는 -20 °C에 보관하십시오.
   참고: 추출된 DNA는 4°C 또는 -20°C에서 적어도 6개월 동안 안정^하다7.

3. 소수의 개인의 DNA 추출

참고 :이 방법은 몇 가지 웜에서 DNA를 추출하는 데 유용합니다. 한 번에 여러 균주가 용해되는 경우 마스터 믹스를 준비 할 수 있습니다.

1. 열순환기를 55°C에서 10분 동안 한 사이클 동안 프로그램하고, 이어서 95°C에서 3분 동안 프로그램한다(용해 프로그램).
2. 키트로부터 추출 용액 2.0 μL를 얼음 위에 0.2 mL PCR 튜브의 내벽 상에 분취한다. 0.5 μL의 조직 준비 용액을 키트로부터 추출 용액의 액적에 첨가한다. 피펫팅으로 혼합하십시오.
3. 해부 현미경으로 L4 또는 성인 동물을 확인⁹. L4 hermaphrodite는 동물의 중앙에 창백한 반원으로 보이는 특징적인 외음부를 가지고 있습니다. 성인 hermaphrodite는 판에서 가장 큰 동물이며 자궁에서 타원형 배아가 보일 수 있습니다.
4. 백금 와이어 픽을 사용하여 몇 마리의 동물을 용액으로 옮깁니다: 9마리의 동물은 용해물 0.5μL당 게놈 DNA 1마리를 산출하고, 16마리는 0.25μL(3.5마리의 선충류/μL)의 게놈 DNA에 해당하는 동물 1마리를 산출합니다¹⁰.
   참고 : 16 마리 이상의 동물을이 볼륨으로 옮기는 것은 어렵습니다.
5. 튜브를 실온에서 간단히 원심분리한다(2-3초, ≤6,000rpm/2,000× g).
6. 튜브를 열순환기에 넣고 단계 3.1에서 설정된 용해 프로그램을 실행합니다.
7. 프로그램이 완료되면 튜브를 간단히 원심 분리하여 얼음 위에 놓습니다. 2 μL의 중화 용액을 키트로부터 혼합물에 첨가한다. 피펫팅으로 혼합하십시오.
8. 튜브를 실온에서 간단히 원심분리한다(2-3초, ≤6,000rpm/2,000 × g).
9. PCR을 위해 용해물을 직접 사용하거나 향후 사용을 위해 4 °C 또는 -20 °C에 보관하십시오.
   참고: 추출된 DNA는 4°C 또는 -20°C에서 적어도 6개월 동안 안정^하다7.

4. PCR 반응

참고: 빠른 중합효소를 사용하여 결실 돌연변이를 검출하는 이 웜 용해 기술의 한 다운스트림 적용이 설명됩니다. 반응 당 웜의 1/50^th 까지 희석에서 성공적인 PCR을 위해 게놈 주형 DNA를 생산하는 두 개의 웜 용해 프로토콜의 효과도 입증됩니다.

1. 단계 2 및 단계 3에서 상기 기재된 바와 같이 야생형 N2 및 돌연변이 균주를 사용하여 단일 웜 및 16개의 웜으로부터 DNA를 추출한다.
2. 야생형 N2 동물로부터 단일 웜 DNA의 2배, 10배, 20배 및 50배 희석액을 준비한다.
3. 관심 서열과 핫스타트 PCR 마스터 믹스에 특이적인 프라이머를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 반응을 설정한다(표 1 및 표 2). 희석되지 않은 DNA 1 μL 또는 희석된 DNA 2 μL를 각 반응에서 주형으로 사용하십시오.
4. PCR 산물을 겔 전기영동 및 이미징¹¹로 확인하였다.

결과

단일 또는 몇몇 야생형 성인으로부터의 게놈 DNA를 이들 두 방법의 효능을 비교하기 위해 상용 키트 또는 전통적인 용해 프로토콜을 사용하여 추출하였다. 이 용해물은 ∼2,100 bp ( blmp-1 인코딩)의 더 큰 표적 또는 ∼500 bp의 더 작은 표적 ( sma-10의 일부를 인코딩하는) 중 하나를 증폭하기 위한 PCR용 주형으로 사용되었다. 두 방법 모두 적절한 PCR 산물을 성공적으로 산출했습니다 (

토론

C. elegans의 유전자형을 결정하는 것은 새로운 C. elegans 균주를 만들기 위해 유전 적 교차를 수행하는 동안 중요한 단계입니다. 단일 또는 몇 개의 C. elegans를 이용한 게놈 DNA 추출은 C. elegans를 지노타이핑하는 데 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 상용 키트를 사용하여 C. elegans로부터의 게놈 DNA 추출을 기술한다. 이 방법은 빠르며 강력하게 작동합니다. 이 방법을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoclave tape	Defend	43237-2
aluminium foil, heavy duty	Reynolds Wrap	2182934
calcium chloride	Millipore Sigma	102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)	Sigma-Aldrich Co. LLC	XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer	Fisher Scientific	11-100-495H
LB media, Lennox, capsules	MP Biomedicals, LLC	3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous	Thermo Scientific	AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge	Labnet International, Inc.	PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs, Inc.	M0515S	"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder	US Biological Life Sciences	N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs, Inc.	M0531S	"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase	Takara Bio Inc.	R050B	"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)	New England Biolabs, Inc.	N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix	Takara Bio Inc.	RR350A	"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix	Sigma-Aldrich Co. LLC	P4600	"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24812
stir bar	Fisher Scientific	14-512-126
vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
worm pick	Genesee Scientific Corporation	59-AWP