カエノラブディティス・エレガンスゲノムDNAの小規模抽出

要約

ここで提示されるのは、市販の組織キットを用いた1匹または数匹の動物からの Caenorhabditisエレガンス ゲノムDNAの単純かつ比較的迅速な単離の説明である。得られたgDNA調製物は、PCRに好適な鋳型である。

要約

単一または少数の Caenorhabditis elegans からのゲノムDNA抽出は、ジェノタイピングライン用のPCR、クローニング、シーケンシングなど、多くの下流アプリケーションを持っています。 C. elegans からのゲノムDNA抽出のための伝統的なプロテイナーゼKベースの方法は数時間かかる。 C. elegans キューティクルを効果的に開封し、ゲノム DNA を抽出する市販の抽出キットは限られています。 C. elegans のゲノムDNAを抽出する簡単で高速(約15分)、費用対効果の高い方法が、教室や研究用途によく適していることがここで報告されています。このDNA抽出方法は、PCRを実行するための信頼性の高い鋳型を得るための出発物質として、単一または少数の後期幼虫(L4)または成虫線虫を使用するように最適化されています。この結果は、DNA品質がPCRによって異なるサイズの遺伝子標的を増幅するのに適しており、1反応あたり成人1人のゲノムDNAの50分の1に希釈しても、単一または数匹の動物のジェノタイピングを可能にすることを示している。報告されたプロトコルは、PCRベースのアプリケーション向けに、単一または少量の C. elegans サンプルからDNAテンプレートを迅速に製造するために確実に使用できます。

概要

ここでは、PCRベースのアプリケーションのためにDNAをアクセス可能にするために、Caenorhabditis elegansの溶解のための2つの関連するプロトコルが提示されています。PCRは、クローニングやシーケンシングのためのDNA断片のジェノタイピングや増幅など、多くの用途で使用される一般的に使用される分子技術です。小型(1mm)の自由生活型回虫C. elegansは、生物学的研究に人気のある動物システムです。単一の動物または数匹の動物から適切なゲノムDNAを得ることは、PCRによって配列を増幅するのに十分である。後期L4幼虫および成虫は、子宮内に〜1,000個の体細胞(いくつかの多核、倍数体細胞を含む)、生殖細胞、および(動物が雌雄同体である場合)子孫のみ^{を含む1。}しかしながら、これらの動物は、ゲノム^DNA2を抽出するために破壊されなければならないキューティクルによって保護されている。PCR用の線虫ゲノムDNAテンプレートを調製するための標準的な方法は、複数のステップを伴い、数時間かかる。動物を最初にプロテイナーゼKを含むワーム溶解緩衝液(−70°C以下)中で少なくとも15〜45分間凍結する(いくつかのプロトコルではより長いことが推奨される)³、^4、5、6。このステップは動物をひび割れさせます。

凍結後、動物をプロテイナーゼKが機能するために60〜65°Cで1時間インキュベートし、次いで酵素を95°Cで15〜30分間失活させる。 プロテイナーゼKは、DNAを分解するヌクレアーゼを破壊する。PCR前のプロテイナーゼKの不活性化は、プロテイナーゼKがDNAポリメラーゼを分解するのを防ぐために重要である。ここで説明する2つのキットベースのプロトコルは、日常の研究および教育ラボアプリケーションのために、単一の動物または少数の線虫のいずれかからゲノムDNAを抽出するための迅速で信頼性が高く、費用対効果の高い方法です。使用されたキットは、もともと動物組織、唾液、および毛髪からDNAを抽出するために製造業者によって最適化されました⁷。独自の組織調製溶液と抽出溶液を使用して細胞を溶解し、ゲノムDNAをアクセス可能にします。その後、独自の中和溶液がPCRを阻害する可能性のある成分(塩、イオン、^Mg2+結合分子など)を中和します。

ジェノタイピングの際、1匹の動物を試験することができる。株がホモ接合性かどうかを判断する場合、1匹の動物から6匹以上の子孫を試験すると、系統がホモ接合性であるかどうかの高い信頼性が得られます(ヘテロ接合性の親から6つのホモ接合型変異体子孫をランダムに摘み取る確率は0.02%です[(1/4)⁶ × 100% = 0.02%])。この方法は1)簡単で、プロテイナーゼK法よりも少ないステップで、および2)鋳型調製時間を15分に短縮する。この研究の結果は、開発されたプロトコルが単一または少数のワームからゲノムDNAを抽出する際に堅牢に機能し、PCRを含む高度に精製されたDNAを必要としない下流アプリケーションに確実に使用できることを示しています。

プロトコル

1. C.エレガンスの メンテナンス

注:N2(野生型)および blmp-1(tm548)C.エレガン ス株を、標準線虫増殖培地(NGM)プレート上で20°Cで維持した。

1. 2Lフラスコ内の973 mLの水に23.005 gのNGM粉末を溶解してNGMプレートを調製する。フラスコの開口部をアルミホイル(または通気可能なオートクレーブ可能なキャップ)で覆い、オートクレーブテープでカバーを固定します。オートクレーブは、粉末を溶解し、少なくとも30分の滅菌サイクルで内容物を滅菌する。
2. 水浴中で培地を60°Cに冷却する。
3. 冷却した培地に、25mLの滅菌1Mリン酸(KH2PO4)緩衝液、pH6.0;1mLの1M塩化カルシウム溶液;1mLの1M硫酸マグネシウム溶液を含む。
4. マグネチックスタープレート上で媒体を攪拌して均一な混合物を得、不均一な冷却および固化を防止する(〜5分)。攪拌子が渦を作るのに十分な速さで回転するが、気泡が導入されるほど速くないことを確認してください(〜250-300rpm)。
5. 各10cmのペトリプレート(合計で約40枚のプレート)に約25mLの培地を注ぎます。プレートを室温で一晩乾燥させます(通常16〜25°C)。
6. エシェリヒア・コリOP50のコロニーを30-50 mLのLBブロス中で37°Cで一晩成長させる。
7. 各プレートに500 μLの 大腸菌 OP50培養物を種まきし、使用前に室温(典型的には16〜25°^C)で乾燥させる8。プレートを4°Cで最大3週間保管してください。
8. C. elegansをワイヤーピックまたは他の方法を用いて播種プレートに移し、株に必要な温度でL4または成体段階まで成長させる(典型的には16〜25°C、ダウアーとして飢えた動物を播種した場合は1〜2日、動物を胚として播種した場合は3〜4日)⁸。

2. シングルワームDNA抽出

注:この方法は、単一のワーム(総容量1.8μL中に1つのワーム)からDNAを抽出するのに有用である。一度に複数のワームが溶解する場合は、マスターミックスを作成できます。

1. サーモサイクラーを55°Cで10分間、続いて95°Cで3分間1サイクルプログラムします(溶解プログラム)。
2. キットから抽出溶液0.8 μLを氷上の0.2 mL PCRチューブの内壁にアリコートします。キットから0.2 μLの組織調製溶液を抽出溶液の液滴に加える。ピペッティングで混ぜる。
3. 解剖顕微鏡⁹でL4または成体動物を同定する。L4雌雄同体を特定するには、動物の真ん中に淡い半円として見える特徴的な外陰部を探します。成体の雌雄同体を特定するには、プレート上で最大の動物を探し、子宮内に楕円形の胚が見える可能性があります。
4. 白金ワイヤーピックを用いて、選択された動物を溶液¹⁰に移す。
5. チューブを室温で短時間(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)遠心分離し、チューブの底にある内容物を回収する。
6. チューブをサーモサイクラーに置き、ステップ2.1で設定した溶解プログラムを実行します。
7. プログラムが完了したら、チューブを短時間遠心分離し、氷の上に置きます。キットから0.8 μLの中和溶液を混合物に加える。ピペッティングで混ぜる。
8. チューブを室温(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)で短時間遠心分離する。
9. 溶解液をPCRに直接使用するか、将来の使用のために4°Cまたは-20°Cで保存してください。
   注:抽出されたDNAは、少なくとも6ヶ月間、4°Cまたは−20°Cで安定である⁷。

3. 少数の個人のDNA抽出

注:この方法は、いくつかのワームからDNAを抽出するのに便利です。マスターミックスは、複数の株が一度に溶解される場合に調製することができる。

1. サーモサイクラーを55°Cで10分間、続いて95°Cで3分間1サイクルプログラムします(溶解プログラム)。
2. キットから抽出溶液 2.0 μL を氷上の 0.2 mL PCR チューブの内壁にアリコートします。キットから0.5 μLの組織調製溶液を抽出溶液の液滴に加える。ピペッティングで混ぜる。
3. 解剖顕微鏡⁹下でL4または成体動物を同定する。L4雌雄同体は、動物の真ん中に淡い半円として見える特徴的な外陰部を有する。成体の雌雄同体はプレート上で最大の動物であり、子宮内に楕円形の胚が見えることがあります。
4. 白金ワイヤーピックを用いて、数匹の動物を溶液に移す:9匹の動物は0.5 μLの溶解物あたり1匹相当のゲノムDNAを、16匹の動物は0.25 μL(3.5線虫/μL)で約1匹相当のゲノムDNAを収穫^する10。
   注:このボリュームに16匹を超える動物を移すことは困難です。
5. チューブを室温(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)で短時間遠心分離する。
6. チューブをサーモサイクラーに入れ、ステップ3.1で設定した溶解プログラムを実行します。
7. プログラムが完了したら、チューブを短時間遠心分離し、氷の上に置きます。キットから2 μLの中和溶液を混合物に加える。ピペッティングで混ぜる。
8. チューブを室温(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)で短時間遠心分離する。
9. 溶解液をPCRに直接使用するか、将来の使用のために4°Cまたは-20°Cで保存してください。
   注:抽出されたDNAは、少なくとも6ヶ月間、4°Cまたは−20°Cで安定である⁷。

4. PCR反応

注:このワーム溶解技術の1つの下流のアプリケーション、すなわち高速ポリメラーゼを使用して欠失変異を検出することが記載されている。1反応あたりのワームの1/50^までの 希釈でPCRを成功させるためのゲノム鋳型DNAの産生における2つのワーム溶解プロトコルの有効性も実証されています。

1. ステップ2およびステップ3で前述したように、野生型N2および変異株を用いて、単一のワームおよび16個のワームからDNAを抽出する。
2. 野生型N2動物からシングルワームDNAの2倍、10倍、20倍、および50倍希釈液を調製する。
3. 目的の配列に固有のプライマーとホットスタート PCR マスターミックスを使用して、メーカーのプロトコールに従って PCR 反応を設定します (表 1 および 表 2)。各反応では、1 μL の希釈されていない DNA または 2 μL の希釈 DNA を鋳型として使用します。
4. ゲル電気泳動およびイメージング¹¹によりPCR産物を確認する。

結果

単一または少数の野生型成虫からのゲノムDNAを、市販のキットまたは従来の溶解プロトコールを用いて抽出し、これら2つの方法の有効性を比較した。次いで、これらの溶解物をPCRのテンプレートとして使用し、〜2,100 bpのより大きな標的( blmp−1をコードする)または〜500 bpのより小さい標的( sma−10の一部をコードする)のいずれかを増幅した。どちらの方法も、適切なPCR産物を首...

ディスカッション

C. elegansの遺伝子型を決定することは、新しいC. elegans株を作成するための遺伝子交配を行う際の重要なステップです。単一または少数のC.エレガンスを用いたゲノムDNA抽出は、C.エレガンスのジェノタイピングにおける重要なステップである。このプロトコールは、市販のキットを用いたC. elegansからのゲノムDNA抽出を記載する。この方法は高速で、堅牢に機能...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoclave tape	Defend	43237-2
aluminium foil, heavy duty	Reynolds Wrap	2182934
calcium chloride	Millipore Sigma	102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)	Sigma-Aldrich Co. LLC	XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer	Fisher Scientific	11-100-495H
LB media, Lennox, capsules	MP Biomedicals, LLC	3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous	Thermo Scientific	AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge	Labnet International, Inc.	PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs, Inc.	M0515S	"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder	US Biological Life Sciences	N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs, Inc.	M0531S	"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase	Takara Bio Inc.	R050B	"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)	New England Biolabs, Inc.	N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix	Takara Bio Inc.	RR350A	"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix	Sigma-Aldrich Co. LLC	P4600	"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24812
stir bar	Fisher Scientific	14-512-126
vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
worm pick	Genesee Scientific Corporation	59-AWP