Extracción a pequeña escala de ADN genómico de Caenorhabditis elegans

Resumen

Aquí se presenta una descripción del aislamiento directo y relativamente rápido del ADN genómico de Caenorhabditis elegans de uno o unos pocos animales utilizando un kit de tejido disponible comercialmente. La preparación de gDNA resultante es una plantilla adecuada para PCR.

Resumen

La extracción de ADN genómico de uno o unos pocos Caenorhabditis elegans tiene muchas aplicaciones posteriores, incluida la PCR para líneas de genotipado, clonación y secuenciación. Los métodos tradicionales basados en la proteinasa K para la extracción de ADN genómico de C. elegans tardan varias horas. Los kits de extracción comerciales que rompen efectivamente la cutícula de C. elegans y extraen ADN genómico son limitados. Aquí se informa un método fácil, más rápido (~ 15 min) y rentable de extracción de ADN genómico de C. elegans que funciona bien para aplicaciones en el aula y la investigación. Este método de extracción de ADN está optimizado para utilizar nematodos monolarvales tardíos (L4) o adultos como material de partida para obtener una plantilla confiable para realizar PCR. Los resultados indican que la calidad del ADN es adecuada para amplificar objetivos genéticos de diferentes tamaños mediante PCR, lo que permite el genotipado de uno o varios animales incluso en diluciones a una quincuagésima parte del ADN genómico de un solo adulto por reacción. Los protocolos informados se pueden utilizar de manera confiable para producir rápidamente una plantilla de ADN a partir de una sola o una pequeña muestra de C. elegans para aplicaciones basadas en PCR.

Introducción

Aquí, se presentan dos protocolos relacionados para la lisis de Caenorhabditis elegans para hacer que el ADN sea accesible para aplicaciones basadas en PCR. La PCR es una técnica molecular de uso común utilizada para muchas aplicaciones, incluyendo el genotipado y la amplificación de fragmentos de ADN para clonación y secuenciación, entre otras. El pequeño (1 mm) gusano redondo de vida libre C. elegans es un sistema animal popular para la investigación biológica. La obtención de ADN genómico adecuado de un solo animal o de unos pocos animales es suficiente para amplificar la secuencia mediante PCR. Las larvas y adultos L4 tardíos contienen solo ~ 1,000 células somáticas (incluidas algunas células poliploides multinucleares), células germinales y (si el animal es un hermafrodita grávido) descendencia en el útero¹. Sin embargo, estos animales están protegidos por una cutícula que debe ser interrumpida para extraer el ADN genómico². Los métodos estándar para preparar la plantilla de ADN genómico de nematodos para PCR implican múltiples pasos y toman varias horas. Los animales se congelan primero en tampón de lisis de lombrices que contiene proteinasa K (-70 °C o menos) durante al menos 15-45 min (algunos protocolos recomiendan más tiempo)3,4,5,6. Este paso abre los animales.

Después de la congelación, los animales se incuban durante 1 h a 60-65 ° C para que la proteinasa K funcione, luego la enzima se inactiva durante 15-30 min a 95 ° C. La proteinasa K destruye las nucleasas que degradan el ADN. La inactivación de la proteinasa K antes de la PCR es importante para evitar que la proteinasa K degrade la ADN polimerasa. Los dos protocolos basados en kits descritos aquí son métodos rápidos, confiables y rentables para extraer ADN genómico de un solo animal o de unos pocos nematodos para aplicaciones diarias de laboratorio de investigación y enseñanza. El kit utilizado fue optimizado originalmente por el fabricante para extraer ADN de tejido animal, saliva y cabello⁷. Utiliza una solución patentada de preparación de tejidos y una solución de extracción para lisar las células y hacer que el ADN genómico sea accesible. Una solución de neutralización patentada neutraliza los componentes que pueden inhibir la PCR (por ejemplo, sales, iones y moléculas de unión a Mg²⁺).

Al genotipar, se puede probar un solo animal. Al determinar si una cepa es homocigota, la prueba de seis o más crías de un solo animal da una gran confianza en que una línea es homocigota o no (hay una probabilidad del 0,02% de elegir al azar seis progenies mutantes homocigotas de un padre heterocigoto [(1/4)⁶ × 100% = 0,02%]). Este método 1) es sencillo, con menos pasos que el método de la proteinasa K, y 2) disminuye el tiempo de preparación de la plantilla a 15 min. Los resultados de este trabajo demuestran que el protocolo desarrollado funciona de manera robusta en la extracción de ADN genómico de uno o varios gusanos, que se pueden usar de manera confiable para aplicaciones posteriores que no requieren ADN altamente purificado, incluida la PCR.

Protocolo

1. Mantenimiento de C. elegans

NOTA: Las cepas N2 (tipo salvaje) y blmp-1(tm548) C. elegans se mantuvieron en placas estándar de medios de crecimiento de nematodos (NGM) a 20 °C.

1. Preparar placas NGM disolviendo 23.005 g de polvo NGM en 973 mL de agua en un matraz de 2 L. Cubra la abertura del matraz con papel de aluminio (o tapa autoclavable que permite la ventilación) y asegure la cubierta con cinta de autoclave. Autoclave para disolver el polvo y esterilizar el contenido con un ciclo de esterilización de al menos 30 min.
2. Enfríe el medio a 60 °C en un baño de agua.
3. Al medio enfriado, agregue 25 ml de tampón estéril de fosfato de 1 M (KH₂PO₄), pH 6.0; 1 ml de solución de cloruro de calcio de 1 M; y 1 ml de solución de sulfato de magnesio de 1 M.
4. Revuelva el medio en una placa de agitación magnética para obtener una mezcla homogénea y evitar el enfriamiento y la solidificación desiguales (~ 5 min). Asegúrese de que la barra de agitación gire lo suficientemente rápido como para crear un vórtice, pero no tan rápido como para que se introduzcan burbujas (~ 250-300 rpm).
5. Vierta ~ 25 ml del medio en cada placa de Petri de 10 cm (~ 40 placas en total). Seque las placas a temperatura ambiente durante la noche (típicamente 16-25 ° C).
6. Cultive una colonia de Escherichia coli OP50 en 30-50 ml de caldo LB durante la noche a 37 ° C.
7. Sembrar cada placa con 500 μL de cultivo de E. coli OP50 y dejar secar a temperatura ambiente antes de su uso (típicamente 16-25 °C)⁸. Guarde las placas a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.
8. Transfiera C. elegans a placas sembradas utilizando un pico de alambre u otro método y déjelos crecer a L4 o etapa adulta a la temperatura requerida para la cepa (típicamente 16-25 ° C, 1-2 días si los animales fueron chapados hambrientos como dauers, 3-4 días si los animales fueron chapados como embriones)⁸.

2. Extracción de ADN de un solo gusano

NOTA: Este método es útil para extraer ADN de un solo gusano (un gusano en 1,8 μL de volumen total). Se puede hacer una mezcla maestra si se lisan varios gusanos a la vez.

1. Programe un termociclador para un ciclo a 55 °C durante 10 min seguido de 95 °C durante 3 min (programa de lisis).
2. Alícuota 0,8 μL de la solución de extracción del kit en la pared interior de un tubo pcr de 0,2 ml sobre hielo. Agregue 0,2 μL de la solución de preparación de tejidos del kit a la gota de la solución de extracción. Mezclar por pipeteo.
3. Identificar un animal L4 o adulto bajo un microscopio de disección⁹. Para identificar hermafroditas L4, busque una vulva característica que sea visible como un semicírculo pálido en el medio del animal. Identifique hermafroditas adultos buscando los animales más grandes en la placa que puedan tener embriones ovalados visibles en su útero.
4. Usando una selección de alambre de platino, transfiera el animal seleccionado a la solución¹⁰.
5. Centrifugar el tubo brevemente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g) a temperatura ambiente para recoger el contenido en la parte inferior del tubo.
6. Coloque el tubo en el termociclador y ejecute el programa de lisis establecido en el paso 2.1.
7. Cuando se complete el programa, centrífique brevemente el tubo y colóquelo sobre hielo. Agregue 0.8 μL de la solución de neutralización del kit a la mezcla. Mezclar por pipeteo.
8. Centrifugar el tubo brevemente a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
9. Utilice directamente el lisado para PCR o guárdelo a 4 °C o -20 °C para su uso futuro.
   NOTA: El ADN extraído es estable a 4 °C o -20 °C durante al menos 6 meses⁷.

3. Extracción de ADN de unos pocos individuos

NOTA: Este método es útil para extraer ADN de algunos gusanos. Se puede preparar una mezcla maestra si se lisan varias cepas a la vez.

1. Programe el termociclador para un ciclo a 55 °C durante 10 min seguido de 95 °C durante 3 min (programa de lisis).
2. Alícuota 2,0 μL de la solución de extracción del kit en la pared interior de un tubo PCR de 0,2 ml sobre hielo. Agregue 0,5 μL de la solución de preparación de tejidos del kit a la gota de la solución de extracción. Mezclar por pipeteo.
3. Identificar L4 o animales adultos bajo un microscopio de disección⁹. Los hermafroditas L4 tienen una vulva característica que es visible como un semicírculo pálido en el medio del animal. Los hermafroditas adultos son los animales más grandes en la placa y pueden tener embriones ovalados visibles en su útero.
4. Usando una selección de alambre de platino, transfiera algunos animales a la solución: 9 animales producen 1 equivalente animal de ADN genómico por 0.5 μL de lisado, y 16 animales producen ~ 1 equivalente animal de ADN genómico en 0.25 μL (3.5 nematodos / μL)¹⁰.
   NOTA: Es difícil transferir más de 16 animales a este volumen.
5. Centrifugar el tubo brevemente a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
6. Coloque el tubo en el termociclador y ejecute el programa de lisis establecido en el paso 3.1.
7. Cuando se complete el programa, centrífique brevemente el tubo y colóquelo sobre hielo. Agregue 2 μL de la solución de neutralización del kit a la mezcla. Mezclar por pipeteo.
8. Centrifugar el tubo brevemente a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
9. Utilice directamente la lisis para PCR o guárdela a 4 °C o -20 °C para su uso futuro.
   NOTA: El ADN extraído es estable a 4 °C o -20 °C durante al menos 6 meses⁷.

4. Reacción de PCR

NOTA: Se describe una aplicación posterior de esta técnica de lisis de gusanos, detectando una mutación de deleción utilizando una polimerasa rápida. También se demuestra la efectividad de los dos protocolos de lisis de gusanos en la producción de ADN de plantilla genómica para PCR exitosa en diluciones a 1/^{50 de} un gusano por reacción.

1. Extraiga ADN de un solo gusano y 16 gusanos utilizando cepas mutantes y N2 de tipo salvaje, como se describe anteriormente en los Pasos 2 y 3.
2. Prepare diluciones de 2, 10, 20 y 50 veces de ADN de un solo gusano de animales N2 de tipo salvaje.
3. Configure las reacciones de PCR siguiendo el protocolo del fabricante utilizando cebadores específicos para la secuencia de interés y la mezcla maestra de PCR de arranque en caliente (Tabla 1 y Tabla 2). Utilice 1 μL de ADN sin diluir o 2 μL de ADN diluido como plantilla en cada reacción.
4. Confirme los productos de PCR mediante electroforesis en gel e imágenes¹¹.

Resultados

El ADN genómico de uno o varios adultos de tipo salvaje se extrajo utilizando el kit comercial o el protocolo de lisis tradicional para comparar la eficacia de estos dos métodos. Estos lisados se utilizaron como plantillas para PCR para amplificar un objetivo más grande de ~ 2,100 bp (codificación blmp-1) o un objetivo más pequeño de ~ 500 bp (codificando una parte de sma-10). Ambos métodos produjeron con éxito productos de PCR apropiados (Figura 1A).

Discusión

Determinar los genotipos de C. elegans es un paso importante al realizar cruces genéticos para crear nuevas cepas de C. elegans . La extracción de ADN genómico utilizando uno o pocos C. elegans es un paso crucial en el genotipado de C. elegans. Este protocolo describe la extracción de ADN genómico de C. elegans utilizando un kit comercial. Este método es rápido y funciona de manera robusta. El ADN genómico extraído utilizando este método se puede utilizar para aplica...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoclave tape	Defend	43237-2
aluminium foil, heavy duty	Reynolds Wrap	2182934
calcium chloride	Millipore Sigma	102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)	Sigma-Aldrich Co. LLC	XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer	Fisher Scientific	11-100-495H
LB media, Lennox, capsules	MP Biomedicals, LLC	3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous	Thermo Scientific	AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge	Labnet International, Inc.	PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs, Inc.	M0515S	"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder	US Biological Life Sciences	N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs, Inc.	M0531S	"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase	Takara Bio Inc.	R050B	"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)	New England Biolabs, Inc.	N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix	Takara Bio Inc.	RR350A	"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix	Sigma-Aldrich Co. LLC	P4600	"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24812
stir bar	Fisher Scientific	14-512-126
vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
worm pick	Genesee Scientific Corporation	59-AWP