מיצוי בקנה מידה קטן של Caenorhabditis elegans דנ"א גנומי

Summary

מוצג כאן תיאור של הבידוד הישיר והמהיר יחסית של דנ"א גנומי של Caenorhabditis elegans מבעל חיים אחד או כמה בעלי חיים באמצעות ערכת רקמה זמינה מסחרית. הכנת ה-gDNA המתקבלת היא תבנית מתאימה ל-PCR.

Abstract

למיצוי דנ"א גנומי מ-Caenorhabditis elegans יחידים או מכמה סוגים של Caenorhabditis יש יישומים רבים במורד הזרם, כולל PCR עבור קווי גנוטיפ, שיבוט וריצוף. השיטות המסורתיות המבוססות על פרוטאינאז K למיצוי דנ"א גנומי מ- C. elegans אורכות מספר שעות. ערכות מיצוי מסחריות שפותחות ביעילות את הקוטיקולה C. elegans ומוציאות דנ"א גנומי מוגבלות. שיטה קלה, מהירה יותר (כ-15 דקות) וחסכונית לחילוץ דנ"א גנומי של C. elegans שעובדת היטב עבור יישומי כיתה ומחקר מדווחת כאן. שיטת מיצוי דנ"א זו ממוטבת לשימוש בזחל יחיד או בכמה נמטודות מאוחרות (L4) או נמטודות בוגרות כחומר התחלתי לקבלת תבנית אמינה לביצוע PCR. התוצאות מצביעות על כך שאיכות הדנ"א מתאימה להגברת מטרות גנים בגדלים שונים על ידי PCR, ומאפשרת גנוטיפ של בעלי חיים בודדים או כמה גם בדילולים עד חמישים מהדנ"א הגנומי ממבוגר יחיד לכל תגובה. ניתן להשתמש בפרוטוקולים המדווחים באופן אמין כדי לייצר במהירות תבנית דנ"א מדגימה אחת או קטנה של C. elegans עבור יישומים מבוססי PCR.

Introduction

כאן, שני פרוטוקולים קשורים מוצגים עבור lysis של Caenorhabditis elegans כדי להפוך את הדנ"א נגיש עבור יישומים מבוססי PCR. PCR היא טכניקה מולקולרית נפוצה המשמשת ליישומים רבים, כולל גנוטיפ והגברת מקטעי דנ"א לשיבוט וריצוף, בין היתר. התולעת העגולה הקטנה (1 מ"מ), החיה בחופשיות C. elegans היא מערכת פופולרית של בעלי חיים למחקר ביולוגי. די בהשגת דנ"א גנומי מתאים מבעל חיים יחיד או מכמה בעלי חיים כדי להגביר את הרצף על ידי PCR. זחלי L4 מאוחרים ובוגרים מכילים רק כ-1,000 תאים סומטיים (כולל כמה תאים רב-גרעיניים, פוליפלואידים), תאי נבט, וצאצאים (אם החיה היא הרמפרודיט גרבידי) ברחם¹. עם זאת, בעלי חיים אלה מוגנים על ידי קוטיקולה שיש לשבש כדי לחלץ את הדנ"א הגנומי². שיטות סטנדרטיות להכנת תבנית דנ"א גנומית נמטודה ל-PCR כרוכות במספר שלבים ונמשכות מספר שעות. בעלי החיים מוקפאים לראשונה במאגר ליזה של תולעים המכיל פרוטאינאז K (−70 מעלות צלזיוס ומטה) למשך 15-45 דקות לפחות (יותר זמן מומלץ על ידי פרוטוקולים מסוימים)3,4,5,6. שלב זה פותח את החיות.

לאחר ההקפאה, בעלי החיים מודגרים במשך שעה אחת ב 60-65 מעלות צלזיוס עבור פרוטאינז K לעבוד, ואז האנזים מומת במשך 15-30 דקות ב 95 °C (65 °F). הפרוטאינאז K הורס את הנוקלאזות שמפרקות את הדנ"א. ההשבתה של פרוטאינאז K לפני PCR חשובה כדי למנוע מהפרוטאינאז K לפרק את ה-DNA פולימראז. שני הפרוטוקולים מבוססי הערכה המתוארים כאן הם שיטות מהירות, אמינות וחסכוניות לחילוץ דנ"א גנומי מבעל חיים יחיד או מכמה נמטודות לצורך מחקר יומיומי וליישומי מעבדה. הערכה שבה נעשה שימוש הותאמה במקור על ידי היצרן כדי לחלץ דנ"א מרקמת בעלי חיים, רוק ושיער⁷. הוא משתמש בתמיסת הכנת רקמות קניינית ובתמיסת מיצוי כדי ליזום תאים ולהנגיש את הדנ"א הגנומי. תמיסת נטרול קניינית מנטרלת את הרכיבים שעלולים לעכב PCR (למשל, מלחים, יונים ומולקולות קושרות Mg²⁺).

בעת גנוטיפ, ניתן לבחון בעל חיים יחיד. כאשר קובעים אם זן מסוים הוא הומוזיגוטי, בדיקת שישה צאצאים או יותר מבעל חיים אחד נותנת ביטחון גבוה שהקו הוא הומוזיגוטי או לא (יש סיכוי של 0.02% לבחור באופן אקראי שישה צאצאים מוטנטיים הומוזיגוטיים מהורה הטרוזיגוטי [(1/4)⁶ × 100% = 0.02%]). שיטה זו 1) היא פשוטה, עם פחות שלבים משיטת הפרוטאינאז K, ו-2) מקטינה את זמן הכנת התבנית ל-15 דקות. התוצאות בעבודה זו מדגימות כי הפרוטוקול שפותח פועל באופן חזק בחילוץ דנ"א גנומי מתולעים בודדות או מכמה תולעים, אשר ניתן להשתמש בהן באופן אמין עבור יישומים במורד הזרם שאינם דורשים דנ"א מטוהר מאוד, כולל PCR.

Protocol

1. C. elegans תחזוקה

הערה: N2 (סוג פראי) ו blmp-1(tm548) C. elegans זנים נשמרו על לוחות סטנדרטיים של מדיית גדילת נמטודה (NGM) בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.

1. הכן צלחות NGM על ידי המסת 23.005 גרם של אבקת NGM ב 973 מ"ל של מים בבקבוקון 2 ליטר. מכסים את פתח הבקבוקון בנייר אלומיניום (או מכסה אוטוקלאב המאפשר אוורור) ומהדקים את הכיסוי באמצעות סרט אוטוקלאב. Autoclave כדי להמיס את האבקה ולעקר את התוכן עם מחזור עיקור של לפחות 30 דקות.
2. מקררים את הבינוני עד 60 מעלות צלזיוס באמבט מים.
3. למדיום המקורר, הוסף 25 מ"ל של חיץ סטרילי 1 M פוספט (KH₂PO₄), pH 6.0; 1 מ"ל של 1 M תמיסת סידן כלוריד; ו-1 מ"ל של תמיסת 1 M מגנזיום גופרתית.
4. מערבבים את המדיום על צלחת ערבוב מגנטית כדי לקבל תערובת הומוגנית ולמנוע קירור והתמצקות לא אחידים (כ-5 דקות). ודאו שמוט ההתעוררות מסתובב מספיק מהר כדי ליצור מערבולת, אך לא כל כך מהר עד שהבועות מוצגות (כ-250-300 סל"ד).
5. יוצקים כ-25 מ"ל מהמדיום לכל צלחת פטרי באורך 10 ס"מ (כ-40 צלחות בסך הכל). מייבשים את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך הלילה (בדרך כלל 16-25 מעלות צלזיוס).
6. לגדל מושבה של Escherichia coli OP50 ב 30-50 מ"ל של מרק LB לילה ב 37 °C (64 °F).
7. זרעו כל צלחת עם 500 μL של תרבית E. coli OP50 ותנו להם להתייבש בטמפרטורת החדר לפני השימוש (בדרך כלל 16-25 מעלות צלזיוס)⁸. אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שבועות.
8. העבר את C. elegans לצלחות שנזרעו באמצעות פיק חוטים או שיטה אחרת ותן להם לגדול ל-L4 או לשלב הבוגר בטמפרטורה הנדרשת לזן (בדרך כלל 16-25 מעלות צלזיוס, 1-2 ימים אם בעלי חיים היו מצופים מורעבים כדאורים, 3-4 ימים אם בעלי חיים היו מצופים כעוברים)⁸.

2. מיצוי דנ"א של תולעת בודדת

הערה: שיטה זו שימושית לחילוץ דנ"א מתולעת בודדת (תולעת אחת ב-1.8 μL של הנפח הכולל). ניתן ליצור תערובת מאסטר אם תולעים מרובות יוטלו בו זמנית.

1. תכנת תרמוציקלר למחזור אחד בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (תוכנית ליזיס).
2. Aliquot 0.8 μL של תמיסת החילוץ מהערכה אל הקיר הפנימי של צינור PCR 0.2 מ"ל 0.2 מ"ל על קרח. מוסיפים 0.2 μL של תמיסת הכנת הרקמה מהערכה לטיפה של תמיסת המיצוי. מערבבים על ידי צנרת.
3. זהה בעל חיים L4 או בעל חיים בוגר תחת מיקרוסקופ ניתוח⁹. כדי לזהות הרמפרודיטים L4, חפשו פות אופייני הנראה כחצי עיגול חיוור במרכז החיה. זהה הרמפרודיטים בוגרים על ידי חיפוש אחר בעלי החיים הגדולים ביותר בצלחת שעשויים להיות להם עוברים סגלגלים הנראים ברחם שלהם.
4. באמצעות בחירת חוט פלטינה, העבר את החיה שנבחרה לתוך הפתרון¹⁰.
5. צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/2,000 × גרם) בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את התכולה בתחתית הצינור.
6. מקם את הצינור בתרמוציקלר והפעל את תוכנית הליזיס שנקבעה בשלב 2.1.
7. כאשר התוכנית הושלמה, צנטריפוגה לזמן קצר את הצינור והנח אותו על קרח. מוסיפים 0.8 μL של תמיסת הנטרול מהערכה לתערובת. מערבבים על ידי צנרת.
8. צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר בטמפרטורת החדר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/2,000 × גרם).
9. השתמש ישירות בליזאט עבור PCR או אחסן אותו בטמפרטורה של 4 °C או −20 °C לשימוש עתידי.
   הערה: הדנ"א שחולץ יציב בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) או −20 °C (7 °F) למשך 6 חודשים לפחות^.

3. מיצוי דנ"א של כמה פרטים

הערה: שיטה זו שימושית לחילוץ דנ"א מכמה תולעים. ניתן להכין תערובת מאסטר אם יסקרו מספר זנים בו זמנית.

1. תכנת את התרמוצילר למחזור אחד בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (תוכנית ליזיס).
2. Aliquot 2.0 μL של תמיסת החילוץ מהערכה אל הקיר הפנימי של צינור PCR 0.2 מ"ל על קרח. מוסיפים 0.5 μL של תמיסת הכנת הרקמה מהערכה לטיפת תמיסת המיצוי. מערבבים על ידי צנרת.
3. זהה L4 או בעלי חיים בוגרים תחת מיקרוסקופ ניתוח⁹. להרמפרודיטים L4 יש פות אופייני הנראה כחצי עיגול חיוור במרכז החיה. הרמפרודיטים בוגרים הם בעלי החיים הגדולים ביותר בצלחת וייתכן שיש להם עוברים אליפטיים הנראים ברחם שלהם.
4. באמצעות פיק חוט פלטינה, העבירו כמה בעלי חיים לתמיסה: 9 בעלי חיים מניבים חיה אחת המקבילה לדנ"א גנומי לכל 0.5 μL של ליזאט, ו-16 בעלי חיים מניבים כ-1 בעלי חיים המקבילים לדנ"א גנומי ב-0.25 μL (3.5 נמטודות/μL)¹⁰.
   הערה: קשה להעביר יותר מ -16 בעלי חיים לנפח זה.
5. צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר בטמפרטורת החדר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/ 2,000 × גרם).
6. מקם את הצינור בתרמוציפל והפעיל את תוכנית הליזיס שנקבעה בשלב 3.1.
7. כאשר התוכנית הושלמה, צנטריפוגה לזמן קצר את הצינור והנח אותו על קרח. הוסיפו 2 μL של תמיסת הנטרול מהערכה לתערובת. מערבבים על ידי צנרת.
8. צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר בטמפרטורת החדר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/2,000 × גרם).
9. השתמש ישירות בליזה עבור PCR או אחסן אותה בטמפרטורה של 4 ° C או − 20 ° C לשימוש עתידי.
   הערה: הדנ"א שחולץ יציב בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) או −20 °C (7 °F) למשך 6 חודשים לפחות^.

4. תגובת PCR

הערה: מתואר יישום אחד במורד הזרם של טכניקת ליזיס תולעת זו, זיהוי מוטציית מחיקה באמצעות פולימראז מהיר. כמו כן, מוכחת היעילות של שני פרוטוקולי ליזיס התולעת בייצור דנ"א בתבנית גנומית ל-PCR מוצלח בדילולים עד 1/50^th של תולעת לכל תגובה.

1. חלץ דנ"א מתולעת בודדת ומ-16 תולעים באמצעות זנים מסוג N2 ומוטאנטים מסוג בר, כמתואר לעיל בשלב 2 ובשלב 3.
2. הכינו דילולים של פי 2, 10, 20 ו-50 של דנ"א של תולעת בודדת מחיות N2 מסוג בר.
3. הגדר תגובות PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן באמצעות פריימרים ספציפיים לרצף העניין ולתערובת המאסטר של PCR עם התחלה חמה (טבלה 1 וטבלה 2). השתמש ב-1 μL של דנ"א לא מדולל או 2 μL של דנ"א מדולל כתבנית בכל תגובה.
4. אשרו את מוצרי ה-PCR על ידי אלקטרופורזה של ג'ל והדמיה¹¹.

תוצאות

דנ"א גנומי של בוגרים יחידים או כמה בוגרים מסוג פרא הופק באמצעות הערכה המסחרית או פרוטוקול ליזה מסורתי כדי להשוות את היעילות של שתי השיטות הללו. ליאסטים אלה שימשו לאחר מכן כתבניות עבור PCR כדי להגביר מטרה גדולה יותר של ~ 2,100 bp (קידוד blmp-1) או יעד קטן יותר של ~ 500 bp (קידוד חלק מ - sma-10). שתי הש...

Discussion

קביעת הגנוטיפים של C. elegans היא צעד חשוב בעת ביצוע הצלבות גנטיות ליצירת זנים חדשים של C. elegans . מיצוי דנ"א גנומי באמצעות C. elegans יחיד או מעטים הוא שלב מכריע בגנוטיפ C. elegans. פרוטוקול זה מתאר מיצוי דנ"א גנומי מ-C. elegans באמצעות ערכה מסחרית. שיטה זו מהירה ופועלת בחוזקה. הדנ"א הגנו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoclave tape	Defend	43237-2
aluminium foil, heavy duty	Reynolds Wrap	2182934
calcium chloride	Millipore Sigma	102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)	Sigma-Aldrich Co. LLC	XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer	Fisher Scientific	11-100-495H
LB media, Lennox, capsules	MP Biomedicals, LLC	3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous	Thermo Scientific	AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge	Labnet International, Inc.	PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs, Inc.	M0515S	"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder	US Biological Life Sciences	N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs, Inc.	M0531S	"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase	Takara Bio Inc.	R050B	"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)	New England Biolabs, Inc.	N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix	Takara Bio Inc.	RR350A	"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix	Sigma-Aldrich Co. LLC	P4600	"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24812
stir bar	Fisher Scientific	14-512-126
vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
worm pick	Genesee Scientific Corporation	59-AWP