小规模提取 秀丽隐杆线虫 基因组DNA

摘要

这里介绍的是使用市售组织试剂盒从一只或几只动物中直接和相对快速地分离 秀丽隐杆线虫 基因组DNA的描述。所得的gDNA制剂是PCR的合适模板。

摘要

从单个或几个 秀丽隐杆线虫 中提取基因组DNA具有许多下游应用，包括用于基因分型系，克隆和测序的PCR。传统的基于蛋白酶K的方法从 秀丽隐杆线虫 中提取基因组DNA需要几个小时。有效打开 秀丽隐杆线虫 角质层和提取基因组DNA的商业提取试剂盒是有限的。本文介绍了一种简单，快速（约15分钟）且具有成本效益的提取 秀丽隐杆线虫 基因组DNA的方法，该方法适用于课堂和研究应用。这种DNA提取方法经过优化，使用单个或几个晚幼虫（L4）或成体线虫作为获得可靠模板进行PCR的起始材料。结果表明，DNA质量适用于通过PCR扩增不同大小的基因靶标，即使在每次反应中稀释到单个成虫DNA的五十分之一时，也可以对单个或少数动物进行基因分型。所报告的实验方案可以可靠地用于从单个或一小个 秀丽隐杆线虫 样本中快速生成DNA模板，用于基于PCR的应用。

引言

在这里，提出了两种用于秀 丽隐杆线虫 裂解的相关方案，以使DNA可用于基于PCR的应用。PCR是一种常用的分子技术，用于许多应用，包括用于克隆和测序的DNA片段的基因分型和扩增等。小（1毫米），自由生活的蛔虫 秀丽隐杆线虫 是生物学研究的流行动物系统。从单个动物或少数动物中获得合适的基因组DNA足以通过PCR扩增序列。晚期L4幼虫和成虫在 子宫^内仅含有约1，000个体细胞（包括一些多核多倍体细胞），生殖细胞和（如果动物是妊娠雌雄同体）后代。然而，这些动物受到角质层的保护，必须破坏角质层以提取基因组DNA²。制备用于PCR的线虫基因组DNA模板的标准方法涉及多个步骤，需要几个小时。首先将动物在含有蛋白酶K（−70°C或更低）的蠕虫裂解缓冲液中冷冻至少15-45分钟（某些方案建议更长）^{3，4，5，6}。这一步打开了动物。

冷冻后，将动物在60-65°C下孵育1小时以使蛋白酶K起作用，然后将酶在95°C下灭活15-30分钟。 蛋白酶K破坏降解DNA的核酸酶。在PCR之前蛋白酶K失活对于防止蛋白酶K降解DNA聚合酶非常重要。这里描述的两种基于试剂盒的方案是从单个动物或几个线虫中提取基因组DNA的快速，可靠且具有成本效益的方法，用于日常研究和教学实验室应用。所使用的试剂盒最初由制造商优化，以从动物组织，唾液和毛发中提取DNA⁷。它使用专有的组织制备溶液和提取溶液来裂解细胞并使基因组DNA易于访问。然后，专有的中和溶液中和可能抑制PCR的组分（例如，盐，离子和Mg^{2 +}结合分子）。

在基因分型时，可以测试单个动物。在确定菌株是否纯合时，从单个动物中测试六个或更多后代可以高度肯定一个品系是否纯合（从杂合亲本随机挑选六个纯合突变后代的几率为0.02%[（1/4）⁶ ×100%= 0.02%]）。该方法1）简单明了，步骤比蛋白酶K方法少，2）将模板制备时间减少到15分钟。这项工作的结果表明，所开发的方案在从单个或几个蠕虫中提取基因组DNA方面具有强大的作用，这些基因组DNA可以可靠地用于不需要高度纯化的DNA的下游应用，包括PCR。

研究方案

1. 秀丽隐杆线虫的 维持

注意:N2（野生型）和 blmp-1（tm548）C.秀丽隐杆线虫 菌株在20°C下维持在标准线虫生长培养基（NGM）板上。

1. 通过将23.005gNGM粉末溶解在2L烧瓶中的973mL水中来制备NGM板。用铝箔（或允许排气的可高温高压灭菌盖）盖住烧瓶开口，并用高压灭菌胶带固定盖子。高压灭菌器溶解粉末并以至少30分钟的灭菌循环对内容物进行灭菌。
2. 在水浴中将培养基冷却至60°C。
3. 向冷却的培养基中加入25mL无菌的1M磷酸盐（KH₂PO₄）缓冲液，pH 6.0 ;1 mL 1 M氯化钙溶液;和1 mL的1M硫酸镁溶液。
4. 在磁力搅拌板上搅拌培养基以获得均匀的混合物并防止冷却和凝固不均匀（〜5分钟）。确保搅拌棒旋转得足够快以产生涡流，但不要太快，以至于引入气泡（~250-300 rpm）。
5. 将〜25mL培养基倒入每个10厘米的培养皿中（总共约40个板）。在室温下（通常为16-25°C）干燥板过夜。
6. 在37°C下在30-50mL LB肉汤中培养 大肠杆菌 OP50菌落过夜。
7. 用500μL 大肠杆菌 OP50培养物接种每个板，并在使用前在室温下干燥（通常为16-25°C）⁸。将板在4°C下储存长达3周。
8. 使用钢丝镐或其他方法将 秀丽隐杆线虫 转移到种子板上，让它们在菌株所需的温度下生长到L4或成虫阶段（通常为16-25°C，如果动物被作为dauers镀上1-2天，如果动物被接种为胚胎，则为3-4天）⁸。

2. 单虫DNA提取

注意:该方法可用于从单个蠕虫（1.8μL总体积中的一个蠕虫）中提取DNA。如果一次裂解多个蠕虫，则可以进行预混料。

1. 将热循环仪在55°C下编程一个循环10分钟，然后在95°C下编程3分钟（裂解程序）。
2. 将0.8μL提取溶液从试剂盒中等分到冰上0.2mL PCR管的内壁上。从试剂盒中加入0.2μL组织制备溶液到提取溶液的液滴中。通过移液混合。
3. 在解剖显微镜下识别L4或成年动物⁹.为了识别L4雌雄同体，寻找一个特征性的外阴，在动物中间可以看到一个苍白的半圆。通过在平板上寻找最大的动物来识别成年雌雄同体，这些动物可能在子宫中可见椭圆形胚胎。
4. 使用铂金丝镐，将选定的动物转移到溶液¹⁰中。
5. 在室温下短暂离心管（2-3秒，≤6，000rpm / 2，000× g）以收集管底部的内容物。
6. 将试管置于热循环仪中，并运行步骤2.1中设置的裂解程序。
7. 程序完成后，短暂离心管并将其放在冰上。从试剂盒中加入0.8μL中和溶液到混合物中。通过移液混合。
8. 在室温下（2-3 s，≤6，000 rpm / 2，000 × g）短暂离心管。
9. 直接使用裂解液进行PCR或将其储存在4°C或-20°C以备将来使用。
   注意:提取的DNA在4°C或−20°C下稳定至少6个月⁷。

3. 少数个体的DNA提取

注意:这种方法对于从一些蠕虫中提取DNA很有用。如果一次裂解多个菌株，则可以制备预混液。

1. 将热循环仪在55°C下编程一个循环10分钟，然后在95°C下编程3分钟（裂解程序）。
2. 将2.0μL提取溶液从试剂盒中等分到冰上0.2mL PCR管的内壁上。从试剂盒中加入0.5μL组织制备溶液到提取溶液的液滴中。通过移液混合。
3. 在解剖显微镜下识别L4或成年动物⁹.L4雌雄同体有一个特征性的外阴，在动物中间可以看到一个苍白的半圆。成年雌雄同体是盘子上最大的动物，可能在子宫中可见椭圆形胚胎。
4. 使用铂丝拾取，将几只动物转移到溶液中:每0.5μL裂解物中产生9只动物相当于基因组DNA的动物，16只动物在0.25μL（3.5线虫/ μL）¹⁰中产生约1只动物当量的基因组DNA。
   注意:很难将超过16只动物转移到此体积中。
5. 在室温（2-3秒，≤6，000转/2，000× 克）下短暂离心管。
6. 将试管置于热循环仪中，并运行步骤3.1中设置的裂解程序。
7. 程序完成后，短暂离心管并将其放在冰上。从试剂盒中加入2μL中和溶液到混合物中。通过移液混合。
8. 在室温下（2-3 s，≤6，000 rpm / 2，000 × g）短暂离心管。
9. 直接使用裂解剂进行PCR或将其储存在4°C或−20°C以备将来使用。
   注意:提取的DNA在4°C或−20°C下稳定至少6个月⁷。

4. PCR反应

注意:描述了这种蠕虫裂解技术的一种下游应用，即使用快速聚合酶检测缺失突变。还证明了两种蠕虫裂解方案在生产基因组模板DNA方面的有效性，以便在每次反应中稀释至蠕虫的1/^50th 以成功PCR。

1. 使用野生型N2和突变菌株从单个蠕虫和16个蠕虫中提取DNA，如上述步骤2和步骤3中所述。
2. 准备来自野生型N2动物的单蠕虫DNA的2倍，10倍，20倍和50倍稀释度。
3. 使用特定于目标序列的引物和热启动PCR预混液，按照制造商的方案建立PCR反应（表1 和 表2）。在每个反应中使用1μL未稀释的DNA或2μL稀释的DNA作为模板。
4. 通过凝胶电泳和成像¹¹确认PCR产物。

结果

使用商业试剂盒或传统裂解方案从单个或几个野生型成虫中提取基因组DNA，以比较这两种方法的疗效。然后将这些裂解物用作PCR的模板，以扩增〜2，100 bp的较大靶标（编码 blmp-1）或〜500 bp的较小靶标（编码 sma-10的一部分）。两种方法都成功产生了适当的PCR产物（图1A）。

接下来，证明了试剂盒提取的基因组DNA作为各种DNA聚合酶模板的能力...

讨论

确定 秀丽隐杆线虫 的基因型是进行遗传杂交以创建新的 秀丽隐杆线虫 菌株的重要步骤。使用单个或几个 秀丽隐杆线虫进行 基因组DNA提取是秀 丽隐杆线虫基因分型的关键步骤。该协议描述了使用商业试剂盒从 秀丽隐杆线虫 中提取基因组DNA。此方法速度快，工作可靠。使用这种方法提取的基因组DNA可用于下游应用，包括基因分型，测序和克隆。所描述的DNA提取?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoclave tape	Defend	43237-2
aluminium foil, heavy duty	Reynolds Wrap	2182934
calcium chloride	Millipore Sigma	102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)	Sigma-Aldrich Co. LLC	XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer	Fisher Scientific	11-100-495H
LB media, Lennox, capsules	MP Biomedicals, LLC	3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous	Thermo Scientific	AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge	Labnet International, Inc.	PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs, Inc.	M0515S	"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder	US Biological Life Sciences	N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs, Inc.	M0531S	"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase	Takara Bio Inc.	R050B	"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)	New England Biolabs, Inc.	N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix	Takara Bio Inc.	RR350A	"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix	Sigma-Aldrich Co. LLC	P4600	"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24812
stir bar	Fisher Scientific	14-512-126
vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
worm pick	Genesee Scientific Corporation	59-AWP