Мелкомасштабная экстракция геномной ДНК Caenorhabditis elegans

Резюме

Здесь представлено описание простого и относительно быстрого выделения геномной ДНК Caenorhabditis elegans от одного или нескольких животных с использованием коммерчески доступного набора тканей. Полученный препарат гДНК является подходящим шаблоном для ПЦР.

Аннотация

Геномная экстракция ДНК из одного или нескольких Caenorhabditis elegans имеет много последующих применений, включая ПЦР для генотипирования линий, клонирования и секвенирования. Традиционные методы протеиназы на основе K для геномной экстракции ДНК из C. elegans занимают несколько часов. Коммерческие наборы для экстракции, которые эффективно разрывают кутикулу C. elegans и извлекают геномную ДНК, ограничены. Здесь сообщается о простом, быстром (~ 15 мин) и экономически эффективном методе извлечения геномной ДНК C. elegans , который хорошо подходит для классных и исследовательских приложений. Этот метод экстракции ДНК оптимизирован для использования одной или нескольких поздних личинок (L4) или взрослых нематод в качестве исходного материала для получения надежного шаблона для выполнения ПЦР. Результаты показывают, что качество ДНК подходит для амплификации генных мишеней разных размеров с помощью ПЦР, что позволяет генотипировать одного или нескольких животных даже при разведении до одной пятидесятой геномной ДНК от одного взрослого человека за реакцию. Сообщенные протоколы могут быть надежно использованы для быстрого получения шаблона ДНК из одного или небольшого образца C. elegans для приложений на основе ПЦР.

Введение

Здесь представлены два связанных протокола для лизиса Caenorhabditis elegans, чтобы сделать ДНК доступной для приложений на основе ПЦР. ПЦР является широко используемым молекулярным методом, используемым для многих применений, включая генотипирование и амплиферацию фрагментов ДНК для клонирования и секвенирования, среди прочих. Маленький (1 мм), свободно живущий круглый червь C. elegans является популярной животной системой для биологических исследований. Получение подходящей геномной ДНК от одного животного или нескольких животных достаточно для амплиации последовательности с помощью ПЦР. Поздние личинки L4 и взрослые особи содержат только ~ 1000 соматических клеток (включая некоторые многоядерные, полиплоидные клетки), половые клетки и (если животное является гравидным гермафродитом) потомство в утробе матери¹. Однако эти животные защищены кутикулой, которая должна быть нарушена для извлечения геномной ДНК². Стандартные методы подготовки шаблона геномной ДНК нематоды для ПЦР включают в себя несколько шагов и занимают несколько часов. Животных сначала замораживают в буфере лизиса червей, содержащем протеиназу K (−70 °C или ниже) в течение не менее 15-45 мин (более длительный рекомендуется некоторыми протоколами)3,4,5,6. Этот шаг раскалывает животных.

После замораживания животных инкубируют в течение 1 ч при 60-65 °С для работы протеиназы К, затем фермент инактивируют в течение 15-30 мин при 95 °С. Протеиназа К разрушает нуклеазы, которые разрушают ДНК. Инактивация протеиназы К перед ПЦР важна для предотвращения деградации протеиназы К ДНК-полимеразы. Два описанных здесь протокола на основе наборов являются быстрыми, надежными и экономически эффективными методами извлечения геномной ДНК либо из одного животного, либо из нескольких нематод для повседневных исследований и обучения лабораторным приложениям. Используемый набор был первоначально оптимизирован производителем для извлечения ДНК из тканей животных, слюны и волос⁷. Он использует запатентованный раствор для подготовки тканей и экстракционный раствор для лизирования клеток и делает геномную ДНК доступной. Запатентованный нейтрализующий раствор затем нейтрализует компоненты, которые могут ингибировать ПЦР (например, соли, ионы и Mg²⁺-связывающие молекулы).

При генотипировании может быть протестировано одно животное. При определении того, является ли штамм гомозиготным, тестирование шести или более потомков от одного животного дает высокую уверенность в том, что линия гомозиготна или нет (существует 0,02% вероятность случайного выбора шести гомозиготных мутантных потомков от гетерозиготного родителя [(1/4)⁶ × 100% = 0,02%]). Этот метод 1) является простым, с меньшим количеством шагов, чем метод протеиназы К, и 2) сокращает время приготовления шаблона до 15 минут. Результаты этой работы демонстрируют, что разработанный протокол надежно работает при извлечении геномной ДНК из одного или нескольких червей, которые могут быть надежно использованы для последующих применений, не требующих высокоочищенной ДНК, включая ПЦР.

протокол

1. Обслуживание C. elegans

ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы N2 (дикий тип) и blmp-1(tm548) C. elegans поддерживались на стандартных пластинах среды роста нематод (NGM) при 20 °C.

1. Приготовьте пластины NGM, растворив 23,005 г порошка NGM в 973 мл воды в колбе 2 л. Накройте отверстие колбы алюминиевой фольгой (или автоклавируемым колпачком, позволяющим вентиляцию) и закрепите покрытие автоклавной лентой. Автоклав для растворения порошка и стерилизации содержимого с циклом стерилизации не менее 30 мин.
2. Охладите среду до 60 °C на водяной бане.
3. К охлаждаемой среде добавляют 25 мл стерильного буфера 1 Мфосфата (_KH2PO₄), рН 6,0; 1 мл 1 М раствора кальция хлорида; и 1 мл 1 М раствора сульфата магния.
4. Перемешайте среду на магнитной перемешиваемой пластине для получения однородной смеси и предотвращения неравномерного охлаждения и затвердевания (~5 мин). Убедитесь, что перемешивающий стержень вращается достаточно быстро, чтобы создать вихрь, но не так быстро, чтобы пузырьки вводились (~ 250-300 оборотов в минуту).
5. Налейте ~ 25 мл среды в каждую 10 см пластину Петри (всего ~ 40 пластин). Высушите пластины при комнатной температуре в течение ночи (обычно 16-25 °C).
6. Вырастите колонию Escherichia coli OP50 в 30-50 мл бульона LB в течение ночи при 37 °C.
7. Посейте каждую пластину 500 мкл культуры E. coli OP50 и дайте им высохнуть при комнатной температуре перед использованием (обычно 16-25 °C)⁸. Хранить пластины при температуре 4 °C до 3 недель.
8. Перенесите C. elegans на семенные пластины с помощью проволочного кирки или другого метода и дайте им вырасти до L4 или взрослой стадии при температуре, необходимой для штамма (обычно 16-25 ° C, 1-2 дня, если животные были покрыты голодом как дауэры, 3-4 дня, если животные были покрыты как эмбрионы)⁸.

2. Извлечение ДНК одного червя

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод полезен для извлечения ДНК из одного червя (одного червя на 1,8 мкл общего объема). Мастер-микс может быть сделан, если несколько червей будут лизироваться одновременно.

1. Запрограммируйте термоциклер на один цикл при 55 °C в течение 10 мин с последующим 95 °C в течение 3 мин (программа лизиса).
2. Аликвота 0,8 мкл экстракционного раствора из комплекта на внутреннюю стенку 0,2 мл ПЦР-трубки на льду. Добавьте 0,2 мкл раствора тканевого препарата из набора в каплю экстракционного раствора. Перемешать путем пипетки.
3. Идентификация L4 или взрослого животного под рассекающим микроскопом⁹. Чтобы идентифицировать гермафродиты L4, ищите характерную вульву, которая видна как бледный полукруг в середине животного. Идентифицируйте взрослых гермафродитов, ища самых крупных животных на пластине, которые могут иметь овальные эмбрионы, видимые в их матке.
4. С помощью платиновой проволоки переведите выбранное животное в раствор¹⁰.
5. Центрифугируйте трубку ненадолго (2-3 с, ≤6000 об/мин/2000 × г) при комнатной температуре для сбора содержимого на дне трубки.
6. Поместите трубку в термоциклер и запустите программу лизиса, установленную на шаге 2.1.
7. Когда программа будет завершена, ненадолго центрифугируйте трубку и поместите ее на лед. Добавить в смесь 0,8 мкл нейтрализующего раствора из набора. Перемешать путем пипетки.
8. Ненадолго центрифугируйте трубку при комнатной температуре (2-3 с, ≤6000 об/мин/2 000 × г).
9. Непосредственно используйте лизат для ПЦР или храните его при 4 °C или −20 °C для будущего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экстрагированная ДНК стабильна при 4 °C или −20 °C в течение не менее 6 месяцев⁷.

3. Извлечение ДНК нескольких особей

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод полезен для извлечения ДНК из нескольких червей. Мастер-микс может быть приготовлен, если несколько штаммов будут лизироваться одновременно.

1. Запрограммируйте термоциклер на один цикл при 55 °C в течение 10 мин с последующим 95 °C в течение 3 мин (программа лизиса).
2. Aliquot 2,0 мкл экстракционного раствора из комплекта на внутреннюю стенку ПЦР-трубки 0,2 мл на льду. Добавьте 0,5 мкл раствора тканевого препарата из набора в каплю экстракционного раствора. Перемешать путем пипетки.
3. Идентифицируйте L4 или взрослых животных под рассекающим микроскопом⁹. Гермафродиты L4 имеют характерную вульву, которая видна как бледный полукруг в середине животного. Взрослые гермафродиты являются самыми крупными животными на пластине и могут иметь овальные эмбрионы, видимые в их матке.
4. Используя платиновый проволочный отбор, переведите несколько животных в раствор: 9 животных дают 1 животный эквивалент геномной ДНК на 0,5 мкл лизата, а 16 животных дают ~ 1 животный эквивалент геномной ДНК в 0,25 мкл (3,5 нематода/ мкл)¹⁰.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трудно перенести в этот объем более 16 животных.
5. Ненадолго центрифугируйте трубку при комнатной температуре (2-3 с, ≤6000 об/мин/2 000 × г).
6. Поместите трубку в термоциклер и запустите программу лизиса, установленную на шаге 3.1.
7. Когда программа будет завершена, ненадолго центрифугируйте трубку и поместите ее на лед. Добавить в смесь 2 мкл нейтрализующего раствора из набора. Перемешать путем пипетки.
8. Ненадолго центрифугируйте трубку при комнатной температуре (2-3 с, ≤6000 об/мин/2 000 × г).
9. Непосредственно используйте лизис для ПЦР или храните его при 4 °C или −20 °C для будущего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экстрагированная ДНК стабильна при 4 °C или −20 °C в течение не менее 6 месяцев⁷.

4. Реакция ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Описано одно последующее применение этого метода лизиса червей, обнаруживающее мутацию делеции с использованием быстрой полимеразы. Также продемонстрирована эффективность двух протоколов лизиса червей в получении геномной шаблонной ДНК для успешной ПЦР при разведении до 1/^50-й доли червя за реакцию.

1. Извлеките ДНК из одного червя и 16 червей, используя дикий тип N2 и мутантные штаммы, как описано выше в Шагах 2 и 3.
2. Приготовьте 2-, 10-, 20- и 50-кратное разведение ДНК одного червя у диких животных N2 типа.
3. Настраивайте реакции ПЦР в соответствии с протоколом производителя с использованием праймеров, специфичных для интересующей последовательности, и мастер-микса ПЦР с горячим запуском (Таблица 1 и Таблица 2). Используйте 1 мкл неразбавленной ДНК или 2 мкл разбавленной ДНК в качестве шаблона в каждой реакции.
4. Подтвердите продукты ПЦР с помощью гелевого электрофореза и визуализации¹¹.

Результаты

Геномная ДНК из одного или нескольких взрослых особей дикого типа была извлечена с использованием коммерческого набора или традиционного протокола лизиса для сравнения эффективности этих двух методов. Эти лизаты затем использовались в качестве шаблонов для ПЦР для усиления либо бол?...

Обсуждение

Определение генотипов C. elegans является важным шагом при выполнении генетических скрещиваний для создания новых штаммов C. elegans . Геномная экстракция ДНК с использованием одного или нескольких C. elegans является решающим шагом в генотипировании C. elegans. Этот протокол описы?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoclave tape	Defend	43237-2
aluminium foil, heavy duty	Reynolds Wrap	2182934
calcium chloride	Millipore Sigma	102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)	Sigma-Aldrich Co. LLC	XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer	Fisher Scientific	11-100-495H
LB media, Lennox, capsules	MP Biomedicals, LLC	3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous	Thermo Scientific	AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge	Labnet International, Inc.	PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs, Inc.	M0515S	"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder	US Biological Life Sciences	N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs, Inc.	M0531S	"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase	Takara Bio Inc.	R050B	"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)	New England Biolabs, Inc.	N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix	Takara Bio Inc.	RR350A	"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix	Sigma-Aldrich Co. LLC	P4600	"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24812
stir bar	Fisher Scientific	14-512-126
vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
worm pick	Genesee Scientific Corporation	59-AWP