Kleine Extraktion von Caenorhabditis elegans Genomischer DNA

Zusammenfassung

Hier wird eine Beschreibung der einfachen und relativ schnellen Isolierung der genomischen DNA von Caenorhabditis elegans aus einem oder wenigen Tieren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Gewebekits vorgestellt. Die resultierende gDNA-Präparation ist eine geeignete Vorlage für die PCR.

Zusammenfassung

Die genomische DNA-Extraktion aus einer oder wenigen Caenorhabditis elegans hat viele nachgelagerte Anwendungen, einschließlich PCR für Genotypisierungslinien, Klonen und Sequenzierung. Die traditionellen Proteinase-K-basierten Methoden zur genomischen DNA-Extraktion aus C. elegans dauern mehrere Stunden. Kommerzielle Extraktionskits, die die Cuticula von C. elegans effektiv aufbrechen und genomische DNA extrahieren, sind begrenzt. Eine einfache, schnellere (~ 15 min) und kostengünstige Methode zur Extraktion von C. elegans genomischer DNA, die sich gut für Unterrichts- und Forschungsanwendungen eignet, wird hier berichtet. Diese DNA-Extraktionsmethode ist optimiert, um einzelne oder einige spätlarven (L4) oder erwachsene Nematoden als Ausgangsmaterial für die Gewinnung einer zuverlässigen Vorlage für die Durchführung einer PCR zu verwenden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die DNA-Qualität geeignet ist, Genziele unterschiedlicher Größe durch PCR zu amplifizieren, was die Genotypisierung einzelner oder weniger Tiere auch bei Verdünnungen auf ein Fünfzigstel der genomischen DNA von einem einzelnen Erwachsenen pro Reaktion ermöglicht. Die berichteten Protokolle können zuverlässig verwendet werden, um DNA-Template aus einer einzelnen oder einer kleinen Probe von C. elegans für PCR-basierte Anwendungen schnell herzustellen.

Einleitung

Hier werden zwei verwandte Protokolle für die Lyse von Caenorhabditis elegans vorgestellt, um DNA für PCR-basierte Anwendungen zugänglich zu machen. PCR ist eine häufig verwendete molekulare Technik, die für viele Anwendungen verwendet wird, einschließlich der Genotypisierung und Amplifikation von DNA-Fragmenten zum Klonen und Sequenzieren, unter anderem. Der kleine (1 mm), freilebende Spulwurm C. elegans ist ein beliebtes Tiersystem für die biologische Forschung. Die Gewinnung geeigneter genomischer DNA von einem einzelnen Tier oder einigen wenigen Tieren reicht aus, um die Sequenz durch PCR zu amplifizieren. Späte L4-Larven und Erwachsene enthalten nur ~ 1.000 somatische Zellen (einschließlich einiger multinuklearer, polyploider Zellen), Keimzellen und (wenn das Tier ein gravider Hermaphrodit ist) Nachkommen in utero¹. Diese Tiere sind jedoch durch eine Kutikula geschützt, die gestört werden muss, um die genomische DNA² zu extrahieren. Standardmethoden zur Vorbereitung der genomischen DNA-Vorlage für Nematoden für die PCR umfassen mehrere Schritte und dauern mehrere Stunden. Die Tiere werden zunächst in Wurmlysepuffer eingefroren, der Proteinase K (−70 °C oder weniger) für mindestens 15-45 min enthält (längere wird von einigen Protokollen empfohlen⁾3,4,5,6. Dieser Schritt reißt die Tiere auf.

Nach dem Einfrieren werden die Tiere für 1 h bei 60-65 °C inkubiert, damit die Proteinase K funktioniert, dann wird das Enzym für 15-30 min bei 95 °C inaktiviert. Die Proteinase K zerstört die Nukleasen, die DNA abbauen. Die Inaktivierung der Proteinase K vor der PCR ist wichtig, um zu verhindern, dass die Proteinase K die DNA-Polymerase abbaut. Die beiden hier beschriebenen Kit-basierten Protokolle sind schnelle, zuverlässige und kostengünstige Methoden, um genomische DNA aus einem einzelnen Tier oder einigen Nematoden für alltägliche Forschungs- und Lehrlaboranwendungen zu extrahieren. Das verwendete Kit wurde ursprünglich vom Hersteller optimiert, um DNA aus tierischem Gewebe, Speichel und Haaren zu extrahieren⁷. Es verwendet eine proprietäre Gewebepräparationslösung und Extraktionslösung, um Zellen zu lysieren und genomische DNA zugänglich zu machen. Eine proprietäre Neutralisationslösung neutralisiert dann die Komponenten, die die PCR hemmen können (z. B. Salze, Ionen und Mg²⁺-bindende Moleküle).

Bei der Genotypisierung kann ein einzelnes Tier getestet werden. Bei der Bestimmung, ob ein Stamm homozygot ist, gibt das Testen von sechs oder mehr Nachkommen eines einzelnen Tieres eine hohe Sicherheit, dass eine Linie homozygot ist oder nicht (es besteht eine Wahrscheinlichkeit von 0,02%, dass zufällig sechs homozygote mutierte Nachkommen von einem heterozygoten Elternteil ausgewählt werden [(1/4)⁶ × 100% = 0,02%]). Diese Methode 1) ist einfach, mit weniger Schritten als die Proteinase K-Methode, und 2) verringert die Vorlagenvorbereitungszeit auf 15 min. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das entwickelte Protokoll robust bei der Extraktion genomischer DNA aus einzelnen oder wenigen Würmern funktioniert, die zuverlässig für nachgelagerte Anwendungen verwendet werden kann, die keine hochgereinigte DNA benötigen, einschließlich PCR.

Protokoll

1. C. elegans Wartung

HINWEIS: N2 (Wildtyp) und blmp-1(tm548) C. elegans Stämme wurden auf Standard-Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) -Platten bei 20 ° C gehalten.

1. Bereiten Sie NGM-Platten vor, indem Sie 23,005 g NGM-Pulver in 973 ml Wasser in einem 2-Liter-Kolben auflösen. Decken Sie die Kolbenöffnung mit Aluminiumfolie (oder einer autoklavierbaren Kappe, die eine Belüftung ermöglicht) ab und sichern Sie die Abdeckung mit Autoklavband. Autoklav zum Auflösen des Pulvers und Sterilisieren des Inhalts mit einem Sterilisationszyklus von mindestens 30 min.
2. Das Medium in einem Wasserbad auf 60 °C abkühlen.
3. Zu dem abgekühlten Medium werden 25 ml steriler 1 M Phosphatpuffer (KH₂PO₄), pH 6,0, zugegeben; 1 ml 1 M Calciumchloridlösung; und 1 ml 1 M Magnesiumsulfatlösung.
4. Rühren Sie das Medium auf einer magnetischen Rührplatte um, um eine homogene Mischung zu erhalten und eine ungleichmäßige Abkühlung und Erstarrung zu verhindern (~5 min). Stellen Sie sicher, dass sich der Rührstab schnell genug dreht, um einen Wirbel zu erzeugen, aber nicht so schnell, dass Blasen eingeführt werden (~ 250-300 U / min).
5. Gießen Sie ~ 25 ml des Mediums in jede 10 cm Petriplatte (~ 40 Platten insgesamt). Trocknen Sie die Platten bei Raumtemperatur über Nacht (typischerweise 16-25 °C).
6. Züchten Sie eine Kolonie Escherichia coli OP50 in 30-50 ml LB-Brühe über Nacht bei 37 ° C.
7. Jede Platte mit 500 μL E. coli OP50-Kultur aussaat und vor Gebrauch bei Raumtemperatur trocknen lassen (typischerweise 16-25 °C)⁸. Lagern Sie die Platten bei 4 °C für bis zu 3 Wochen.
8. C. elegans mit einer Drahtpickel oder einer anderen Methode auf ausgesäte Platten übertragen und sie bei der für den Stamm erforderlichen Temperatur auf L4 oder das Erwachsenenstadium wachsen lassen (typischerweise 16-25 °C, 1-2 Tage, wenn Tiere als Dauers verhungert wurden, 3-4 Tage, wenn Tiere als Embryonen plattiert wurden)⁸.

2. Einzelwurm-DNA-Extraktion

HINWEIS: Diese Methode ist nützlich, um DNA aus einem einzelnen Wurm (ein Wurm in 1,8 μL Gesamtvolumen) zu extrahieren. Ein Master-Mix kann erstellt werden, wenn mehrere Würmer gleichzeitig lysiert werden.

1. Programmieren Sie einen Thermocycler für einen Zyklus bei 55 °C für 10 Minuten, gefolgt von 95 °C für 3 min (Lyseprogramm).
2. Aliquot 0,8 μL der Extraktionslösung aus dem Kit auf die Innenwand eines 0,2 mL PCR-Röhrchens auf Eis. 0,2 μL der Gewebepräparationslösung aus dem Kit in das Tröpfchen der Extraktionslösung geben. Mischen durch Pipettieren.
3. Identifizieren Sie ein L4 oder ein erwachsenes Tier unter einem Seziermikroskop⁹. Um L4-Hermaphroditen zu identifizieren, suchen Sie nach einer charakteristischen Vulva, die als blasser Halbkreis in der Mitte des Tieres sichtbar ist. Identifizieren Sie erwachsene Hermaphroditen, indem Sie nach den größten Tieren auf dem Teller suchen, die ovale Embryonen in ihrer Gebärmutter sichtbar haben können.
4. Übertragen Sie das ausgewählte Tier mit einem Platin-Drahtbesteck in die Lösung¹⁰.
5. Zentrieren Sie das Rohr kurz (2-3 s, ≤6.000 U / min / 2.000 × g) bei Raumtemperatur, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln.
6. Legen Sie das Rohr in den Thermocycler und führen Sie das in Schritt 2.1 eingestellte Lyseprogramm aus.
7. Wenn das Programm abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz und legen Sie es auf Eis. 0,8 μL der Neutralisationslösung aus dem Kit in die Mischung geben. Mischen durch Pipettieren.
8. Zentrifugieren Sie das Rohr kurz bei Raumtemperatur (2-3 s, ≤6.000 U/min/2.000 × g).
9. Verwenden Sie das Lysat direkt für die PCR oder lagern Sie es bei 4 °C oder -20 °C für die zukünftige Verwendung.
   HINWEIS: Die extrahierte DNA ist bei 4 °C oder -20 °C für mindestens 6 Monate stabil⁷.

3. DNA-Extraktion einiger weniger Individuen

HINWEIS: Diese Methode ist nützlich, um DNA aus einigen Würmern zu extrahieren. Ein Master-Mix kann hergestellt werden, wenn mehrere Stämme gleichzeitig lysiert werden.

1. Programmieren Sie den Thermocycler für einen Zyklus bei 55 °C für 10 Minuten, gefolgt von 95 °C für 3 min (Lyseprogramm).
2. Aliquot 2,0 μL der Extraktionslösung aus dem Kit auf die Innenwand eines 0,2 ml PCR-Röhrchens auf Eis. 0,5 μL der Gewebepräparationslösung aus dem Kit in das Tröpfchen der Extraktionslösung geben. Mischen durch Pipettieren.
3. Identifizieren Sie L4 oder erwachsene Tiere unter einem Seziermikroskop⁹. L4-Hermaphroditen haben eine charakteristische Vulva, die als blasser Halbkreis in der Mitte des Tieres sichtbar ist. Erwachsene Hermaphroditen sind die größten Tiere auf dem Teller und können ovale Embryonen in ihrer Gebärmutter sichtbar haben.
4. Übertragen Sie mit einem Platin-Drahtbecher einige Tiere in die Lösung: 9 Tiere ergeben 1 tierisches Äquivalent genomischer DNA pro 0,5 μL Lysat und 16 Tiere erhalten ~ 1 tierisches Äquivalent genomischer DNA in 0,25 μL (3,5 Nematoden/μL)¹⁰.
   HINWEIS: Es ist schwierig, mehr als 16 Tiere in diesen Band zu übertragen.
5. Zentrifugieren Sie das Rohr kurz bei Raumtemperatur (2-3 s, ≤6.000 U / min / 2.000 × g).
6. Legen Sie das Rohr in den Thermocycler und führen Sie das Lyseprogramm aus, das in Schritt 3.1 eingestellt ist.
7. Wenn das Programm abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz und legen Sie es auf Eis. 2 μL der Neutralisationslösung aus dem Kit in die Mischung geben. Mischen durch Pipettieren.
8. Zentrifugieren Sie das Rohr kurz bei Raumtemperatur (2-3 s, ≤6.000 U/min/2.000 × g).
9. Verwenden Sie die Lyse direkt für die PCR oder lagern Sie sie bei 4 °C oder −20 °C für die zukünftige Verwendung.
   HINWEIS: Die extrahierte DNA ist bei 4 °C oder -20 °C für mindestens 6 Monate stabil⁷.

4. PCR-Reaktion

HINWEIS: Eine nachgelagerte Anwendung dieser Wurmlysetechnik, die eine Deletionsmutation mit einer schnellen Polymerase nachweist, wird beschrieben. Die Wirksamkeit der beiden Wurmlyseprotokolle bei der Herstellung genomischer Vorlagen-DNA für eine erfolgreiche PCR bei Verdünnungen auf 1/50^eines Wurms pro Reaktion ist ebenfalls nachgewiesen.

1. Extrahieren Sie DNA aus einem einzelnen Wurm und 16 Würmern unter Verwendung von Wildtyp-N2- und Mutantenstämmen, wie oben in Schritt 2 und Schritt 3 beschrieben.
2. Bereiten Sie 2-, 10-, 20- und 50-fache Verdünnungen von Single-Worm-DNA von Wildtyp-N2-Tieren vor.
3. Richten Sie PCR-Reaktionen nach dem Protokoll des Herstellers unter Verwendung von Primern ein, die für die interessierende Sequenz und den Hot-Start-PCR-Master-Mix spezifisch sind (Tabelle 1 und Tabelle 2). Verwenden Sie 1 μL unverdünnte DNA oder 2 μL verdünnte DNA als Vorlage für jede Reaktion.
4. Bestätigen Sie die PCR-Produkte durch Gelelektrophorese und Bildgebung¹¹.

Ergebnisse

Genomische DNA von einem einzelnen oder wenigen Wildtyp-Erwachsenen wurde mit dem kommerziellen Kit oder dem traditionellen Lyseprotokoll extrahiert, um die Wirksamkeit dieser beiden Methoden zu vergleichen. Diese Lysate wurden dann als Vorlagen für die PCR verwendet, um entweder ein größeres Ziel von ~ 2.100 bp (Kodierung von blmp-1) oder ein kleineres Ziel von ~ 500 bp (Kodierung eines Teils von sma-10) zu verstärken. Beide Methoden lieferten erfolgreich geeignete PCR-Produkte (

Diskussion

Die Bestimmung der Genotypen von C. elegans ist ein wichtiger Schritt bei der Durchführung genetischer Kreuzungen, um neue C. elegans-Stämme zu erzeugen. Die genomische DNA-Extraktion mit einem oder wenigen C. elegans ist ein entscheidender Schritt bei der Genotypisierung von C. elegans. Dieses Protokoll beschreibt die genomische DNA-Extraktion aus C. elegans mit einem kommerziellen Kit. Diese Methode ist schnell und funktioniert robust. Die mit dieser Methode extrahierte g...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoclave tape	Defend	43237-2
aluminium foil, heavy duty	Reynolds Wrap	2182934
calcium chloride	Millipore Sigma	102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)	Sigma-Aldrich Co. LLC	XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer	Fisher Scientific	11-100-495H
LB media, Lennox, capsules	MP Biomedicals, LLC	3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous	Thermo Scientific	AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge	Labnet International, Inc.	PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs, Inc.	M0515S	"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder	US Biological Life Sciences	N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs, Inc.	M0531S	"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase	Takara Bio Inc.	R050B	"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)	New England Biolabs, Inc.	N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix	Takara Bio Inc.	RR350A	"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix	Sigma-Aldrich Co. LLC	P4600	"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24812
stir bar	Fisher Scientific	14-512-126
vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
worm pick	Genesee Scientific Corporation	59-AWP